Summary
これらのケラチノ サイトと線維芽細胞を用いた誘導多能性幹細胞由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を区別し、3 D 肌 organoid を生成する方法を示すプロトコルを提案します。このプロトコルには、ヒト化マウス モデルを生成する追加の手順が含まれています。ここで紹介しているテクニックは、皮膚の研究が改善されます。
Abstract
皮膚は身体の最大の臓器で、多くの機能。皮膚は、物理的な障壁と体のプロテクターとして機能し、身体機能を調節します。バイオ ・ ミメティクス モデル、システム、および複雑な人間の問題1の解決の為、自然の要素の模倣であります。皮膚バイオミメティックスは体外病研究と生体内再生医療の役に立つツールです。ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) 無制限の増殖特性と 3 つの胚葉分化の能力があります。人間の Ips は、様々 な細胞、血液細胞、ケラチノ サイト、線維芽細胞などから生成されます。その中で、臍帯血単核細胞 (CBMCs) は、同種の再生医学の視点から代替セル源として浮上しています。ひと白血球抗原 (HLA) の入力が銀行システムのセルに不可欠であるために、CBMCs、再生医療に役立ちます。我々 は CBMC Ips のケラチノ サイトと線維芽細胞への分化と 3 D 肌 organoid の生成のためのメソッドを提供します。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトと線維芽細胞一次電池ラインと同様の特性があります。3 D 肌 organoids が真皮層に表皮層を重ねることによって生成されます。この 3 D 肌 organoid を移植、ヒト化マウス モデルが生成されます。本研究では、3 D iPSC 由来皮膚における in vitro および in vivo 皮膚研究小説、代替用具であるかもしれないことを示しています。
Introduction
皮膚は身体の外側の表面をカバーし、内臓を保護します。皮膚が病原体からの保護、吸収、保存水など、さまざまな機能、体温を調節し、体を排泄を無駄に2。皮膚移植は皮膚のソースに応じて分類できます。別のドナーからのスキンを使用して移植は移植と呼ばれているし、患者自身の皮膚を使用して移植は自家。自家の低拒絶反応の危険があるため最寄りの治療ですが、皮膚生検は重篤な病変を有する患者または皮膚細胞の数が不足で実行が困難です。重症熱傷患者、皮膚細胞数の 3 倍、大きい区域をカバーするために必要です。Allogenous 移植が必要な状況では患者の体から皮膚細胞の限られた供給の結果します。同種移植片は、までは通常、約 1 週3の後の宿主の免疫系による拒絶されるので、自家移植を行うことが一時的に使用されます。患者さんの免疫システムによって拒絶を克服するためには、移植が患者4と同じ免疫 id とソースから来なければなりません。
ヒト Ips 細胞の幹細胞療法5新たな源であります。人間の Ips は、OCT4、SOX2、Klf4、C-myc6などリプログラミング因子を用いた体細胞から生成されます。胚性幹細胞 (Esc)7,8の倫理的および免疫学的問題を克服する人間 Ips を使用しています。人間 Ips 多能性と 3 つの胚葉9に分化することができます。HLA、再生医療で重要な要因の存在は、免疫反応と拒絶反応10の可能性を決定します。患者由来の Ips の使用は、ソース セル制限と免疫拒絶の問題を解決します。CBMCs も再生医療11代替セル源として浮上しています。CBMC 銀行中に発生する、入力すると、必須の HLA は、研究と移植に簡単に使用できます。さらに、ホモの HLA 型 Ips は、様々 な患者の12に広く適用できます。CBMC iPSC 銀行は小説と細胞療法と同種の再生医療12,13,14のための効率的な戦略です。本研究では CBMC Ips、ケラチノ サイトと線維芽細胞、分化し、層状 3 D スキン層を生成します。本研究の結果は、in vitro および in vivo 皮膚研究のための新しいツールである CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoid をお勧めします。
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Protocol
実験室の動物福祉法、ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い動物を含むすべての手順を行ったし、機関動物ケアによって提供されるガイドラインと齧歯動物実験のためのポリシーと使用委員会 (IACUC) 韓国カトリック大学医学部。研究プロトコルは、韓国のカトリック教の大学 (CUMC-2018-0191-01) の制度検討委員会によって承認されました。2017 と取得した評価会で韓国食品医薬品局の韓国優秀動物研究施設、IACUC、学科の研究室動物 (逃げよう) 韓国カトリック大学の Songeui キャンパスに認定し、2018 年に研究所動物ケア国際 (AAALAC) 国際完全認定の認定。
1. 皮膚の誘導多能性幹細胞からの細胞分化
- 培地の準備
注: は、3 ヵ月の暗い環境で 4 ° C ですべての媒体を保存します。殺菌のため使用前に 0.22 μ m ポリエーテルサルホン フィルター システムを使用してすべての媒体をフィルター処理します。すべての媒体は、500 mL の容量で利用できた。- KDM1 の準備 (表皮細胞分化培地 1)。ミックス ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM)/2% ウシ胎児血清 (FBS)、0.3 mmol/L L アスコルビン酸、5 μ g/mL インスリン 24 μ g/mL アデニンと F12 媒体 (3:1)。
- KDM2 の準備 (表皮細胞分化培地 2)。ミックスは、表皮細胞の無血清培地を定義 (テーブルの材料を参照) 0.3 mmol/l L アスコルビン酸、5 μ g/mL インスリン 10 G/ml アデニンと。
注: 定義された表皮細胞の無血清培地は、ケラチノ サイトの拡大成長を支援に最適です。 - KDM3 の準備 (表皮細胞分化培地 3)。ミックスは、表皮細胞の無血清培地を定義し、表皮細胞無血清培地 (1:1) 詳細については材料の表を参照してください。
注: 表皮細胞の無血清培地は、成長とケラチノ サイトのメンテナンスに最適です。 - FDM1 の準備 (線維芽細胞分化培地 1)。5 %fbs、5 μ g/mL インスリン、0.18 mM アデニンおよび 10 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) とミックス DMEM/F12 媒体 (3:1)。
- FDM2 を準備 (線維芽細胞分化培地 2)。5 %fbs と 1% 必須でないアミノ酸ミックス DMEM/F12 媒体 (1:1)。
- EP1 を準備 (1 上皮中)。ミックス DMEM/F12 (3:1) 4 mM L グルタミン、40 μ M アデニン、10 μ g/mL トランスフェリン、10 μ g/mL インスリンと 0.1 %fbs。
- EP2 の準備 (上皮中 2)。EP1 と 1.8 mM 塩化カルシウムを混ぜます。
- EP3 の準備 (上皮中 3、ハツカネズミ中)。4 mM L グルタミン、40 μ M アデニン、10 μ g/mL トランスフェリン、10 μ g/mL インスリン、2 %fbs と 1.8 mM 塩化カルシウム ミックス F12 媒体。
- 胚体生成
- CBMC Ips 以前研究12に示すプロトコルを使用してが生成されます。
- コート文化料理、ビトロネクチン。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。
- 解凍し、0.5 mg/mL ビトロネクチンの 50 μ L を再懸濁します (最終濃度: 5 μ g/mL) 5 ml 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の。料理をソリューションに追加し、1 h. 吸引使用 (乾燥しない) する前にコーティング材 (RT) 室温で孵化させなさい。
- ビトロネクチン コーティング 100 mm CBMC 由来 Ips プレートし、10% の CO2と 37 ° C で毎日 iPSC 媒体 (E8) を変更を維持します。
- 以前研究15 (説明の簡潔に次のように) に示すプロトコルを使用して萌芽期の体 (EBs) を生成します。セルが 80% の合流点に到達するまでに媒体を変更することにより、Ips を展開します。80% の合流点でメディアを取り出して、PBS で洗浄します。
- 1 ml の 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のセルを扱います。5% CO2 2 分の 37 ° C で、E8 培地 3 mL を使用してセルを収穫します。2 分間 250 x gで細胞を遠心します。
- 上清を吸引し、E8 培地 5 mL をセルに適用します。診断を使用してセルをカウントし、1 x 10 の6セルを新しい 15 mL の円錐管に転送します。2 分間 250 x gで細胞を遠心します。
- 10 μ M の Rho 関連キナーゼ (ロック) 阻害剤による EB 形成中の 2.5 ml 転送細胞を再懸濁します。1 x 10 の4セル (25 μ L/ドロップ) 10-100 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して noncoated 文化板蓋の上にドロップします。1 x 10 の6セル (1 × 104セル/1 EB) からフォーム 100 EBs。皿を裏返して、蓋、液滴にハングアップします。
注: ROCK 阻害剤は、維持と分化プロセスの添付手順で必要です。EB 集計段階で ROCK 阻害剤を追加します。 - 1 日 5% CO2と 37 ° C で水滴を孵化させなさい。
- 次の日、収穫、100 EBs と差別化のために使用します。IPSC 媒体 (E8 媒体) または PBS とプレートの蓋を洗うし、50 mL の円錐管にその内容を収穫します。それらを解決するため 1 分の RT で EBs を維持します。上清を吸引、E8 媒体、EBs を再懸濁します、分化まで 90 mm シャーレでそれらを維持します。
- CBMC Ips のケラチノ サイトへの分化
注: CBMC Ips から表皮細胞の分化においては、図 1を参照してください。- IPSC 媒体または PBS で 50 mL の円錐管に収穫、100 EBs。EBs 落ち着くに 1 分間、常温を維持します。円錐管の下部につけるかどうかを確認します。上清を吸引し、1 ng/mL 骨形成タンパク質 4 (BMP4) E8 媒体と EBs を再懸濁します。90 mm シャーレの EBs を転送し、1 日 5% CO2と 37 ° C でそれらを維持します。
- IV 型コラーゲンを使用して培養皿をコートします。100 mm ディッシュをコートに IV 型コラーゲンの 5 mL を準備します。
- 解凍し、タイプ IV コラーゲン溶液を再懸濁します (最終濃度: 50 μ g/mL) 0.05 N 塩酸。 料理にソリューションを追加し、RT で 1 時間インキュベートを使用 (乾燥しない) する前に塗料を吸引。
注: プレートを使用する前に洗って料理 3 x 酸を削除する PBS の。
- 解凍し、タイプ IV コラーゲン溶液を再懸濁します (最終濃度: 50 μ g/mL) 0.05 N 塩酸。 料理にソリューションを追加し、RT で 1 時間インキュベートを使用 (乾燥しない) する前に塗料を吸引。
- 50 mL の円錐管に EBs (ステップ 1.3.1) を収穫し、それらを解決するため 1 分の RT でそれらを維持します。彼らは、円錐管の下部に解決、上清を吸引、10 μ M ROCK 阻害剤と KDM1 の 6 mL で EBs を再懸濁しますを確認します。タイプ IV コラーゲン被覆 100 mm 皿に EBs を転送します。
注: は、EB 添付の段階にのみ ROCK 阻害剤を追加します。 - 0-8 日間中 3 μ M レチノイン酸 (RA) と KDM1 にすべての他の日と 25 ng/mL、各 BMP4 EGF を変更します。5% CO2と 37 ° C で EBs を維持します。
- 日 9-12 の間に媒体を変更他の毎日 3 μ M RA、25 ng/mL、BMP4 20 ng/mL EGF と KDM2。
- 13-30 日の間に媒体を変更その他の毎日 KDM3 10 ng/mL BMP4 と 20 ng/mL EGF。
- CBMC iPSC の線維芽細胞への分化
注: CBMC Ips から線維芽細胞の分化においては、図 2を参照してください。- コートの培養皿の基底膜マトリックスを使用しています。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。
- 基底膜マトリックスを解凍 (最終濃度: 600 ng/mL)/F12 DMEM 培地で希釈し、。料理をソリューションに追加し、30 分吸引 (乾燥しない) 使用前に塗料の 37 ° C で孵化させなさい。
- IPSC 媒体または PBS のピペットを使用して 50 mL の円錐管に収穫、100 EBs。EBs 落ち着くに 1 分間、常温を維持します。円錐管の下部につけるようにします。上澄みを除去します。
- 10 μ M の ROCK 阻害剤と FDM1 の 6 mL で 1,000 μ L ピペットを使用して EBs を再懸濁します。基底膜マトリックス コート 100 mm 皿 (中) と EBs を転送し、, 5% CO2と 37 ° C で。3 日間毎日、FDM1 を更新します。
注: のみ、EB 添付の段階で ROCK 阻害剤を追加します。 - 4 日から 6 日間 FDM1 に 0.5 nM 骨形成タンパク質 (BMP 4) 4 を追加します。
- 7 日に媒体を変更 FDM2 1 週間毎日。
- 14 日に 1 mL 1 mM EDTA を加えるし、2 分 2 分、上清を除去し、FDM1 の 5 mL の細胞を再懸濁します FDM2 3 mL、250 × gで遠心すると細胞の収穫のため 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
- 診断を使用してセルをカウント、FDM1 培地で 2 x 106細胞を再懸濁し、セルを noncoated の皿に転送します。5% CO2と 37 ° C で細胞を維持し、一日おきに媒体を変更します。
- 使用したコート文化料理 I 型コラーゲンです。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。希釈タイプ I のコラーゲン溶液 (最終濃度: 50 μ g/mL) 0.02 N 酢酸。料理をソリューションに追加し、1 h. 吸引使用 (乾燥しない) する前に塗料の RT で孵化させなさい。
注: プレートを使用する前に洗って料理 3 x 酸を削除する PBS の。 - 21 日に 1 mM EDTA の 1 mL を追加し、2 分 FDM1 3 mL、250 × gで遠心するとセルを収穫は、2 分の上澄みを除去し、FDM1 の 5 mL の細胞を再懸濁しますのため 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。検定と転送を使用してセルを 2 × 106細胞型に私 FDM1 中コラーゲン被覆の 100 mm ディッシュの数。5% CO2と 37 ° C で細胞を維持し、一日おきに媒体を変更します。
- 28 日に 1 mM EDTA の 1 mL を追加し、2 分 FDM1 3 mL、250 × gで遠心するとセルを収穫は、2 分の上澄みを除去し、FDM1 の 5 mL の細胞を再懸濁しますのため 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。診断を使用してセルをカウントし、2 x 10 の6セルを FDM1 中 noncoated 皿に転送します。5% CO2と 37 ° C で細胞を維持し、一日おきに媒体を変更します。
注: iPSC 由来線維芽細胞は主に線維芽細胞のセルラインと 10 の通路までの通路のような増殖します。本研究では、さらに分析 2 ~ 5 通路の iPSC 由来線維芽細胞を使用しました。
- コートの培養皿の基底膜マトリックスを使用しています。100 mm ディッシュをコートに 5 mL を準備します。
2. による細胞分化の応用
-
3 D 肌 organoid の生成
- 中和型を準備私コラーゲン氷上では、製造元の推奨事項に従います。最終濃度として 3 mg/mL を使用しての I 型コラーゲン (ストック濃度は I 型コラーゲンは 3.47 mg/mL)、混合物の最終的な量は 5 mL であることを確認します。10 x PBS の体積を計算 (最終的なボリューム/10 = 0.5 mL)。ボリュームを計算する I 型コラーゲン使用される (最終的なコラーゲン濃度 x 最終巻/コラーゲン濃度を株価 = 5 mL x 3 mg/mL/3.47 mg/mL = 4.32 mL)。1 N NaOH の量を計算する (使用するコラーゲンの量 × 0.023 mL = 0.1 mL)。DH2O のボリュームを計算 (10 x PBS - 1 N NaOH の量の最終的なボリューム - コラーゲン - ボリューム = 5 mL 4.32 mL ・ 0.5 mL 0.1 mL = 0.08 mL)。管の内容をミックスを使用する準備ができるまで氷の上保管してください。
- 1.4.10 のステップから iPSC 由来線維芽細胞に EDTA の 1 mL を追加し、2 分剥離細胞を収穫、検定を使用してセルをカウント、2 x 10 の5セルを新しい 15 mL の円錐管に転送のため 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。2 分間 250 × gで遠心し、上清を削除します。FDM1 の 1.5 mL の iPSC 由来線維芽細胞を再懸濁します、中和タイプ私コラーゲン溶液 (1:1)。
注: は、優しく泡を避けるためにソリューションをミックスします。 - 6 ウェル マイクロ プレートの膜挿入を置いて、挿入に液を移し、室温で 30 分間インキュベートします。
注: は、プレートを移動しないでください。 - ゲル化を確認した後挿入と、井戸の底に 3 mL のトップに培地 2 mL を追加します。5-7 日、ゲル化が完了するまで、もはや契約の線維芽細胞および 5% CO2と 37 ° C でコラーゲンのマトリックスを孵化させなさい。
- 完全なゲル化後 (ステップ 1.3.6) から iPSC 由来ケラチノ サイトを分離 EDTA を使用します。EDTA の 1 つの mL を追加し、, 5% CO2と 37 ° C で 2 分剥離細胞を収穫、診断、それらを数えるし、1 x 10 の6セルを新しい 15 mL の円錐管に転送。250 x gで 2 分間遠心します。
- 上澄みを除去し、低カルシウム上皮中 1 (EP1) の 50-100 μ L で 1 x 10 の6セルを再懸濁します。
- マトリックス内のすべての媒体を吸引 (手順 2.1.5 参照) とそれぞれの線維芽細胞層に iPSC 由来ケラチノ サイトの 1 x 10 の6セルの種子します。37 ° C で 30 分間 5% CO2で板を孵化させなさい。
注: プレートを移動しないし、ケラチノ サイトの添付ファイルを任意のメディアを追加しないでください。 - ドライブベイ カバーの上部と、井戸の底に EP1 の 3 mL に EP1 の 2 mL を追加します。
- 2 日後膜挿入プレートのすべての媒体を吸引し、2 日間通常カルシウム EP2 に媒体を変更します。
- 2 日後すべての媒体を吸引し、空気液体インターフェイスを生成する下にだけハツカネズミ中の 3 mL を追加します。
- 5% CO2と 37 ° C で 14 日前までの 3 D 肌 organoid を維持し、一日おきに媒体を変更します。カバーの端を切断することによって 3 D 肌 organoid を収穫し、染色と皮膚移植のさらなる研究のために使用します。
-
皮膚移植
- NOD/scid マウス (男性、6 週齢) の吸入麻酔を行う、標準的な制度的承認メソッドを使用します。皮膚移植の各マウスの皮膚の毛を剃る。
- 鉗子で曲線はさみを使用して、マウスの皮膚の 1 cm × 2 cm のセクションを削除します。
- 欠陥サイトとタイオーバー ドレッシング法を用いた絹糸縫合に CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoid を配置します。
- 2 週間のマウスを観察し、組織学的解析のためそれらに犠牲します。汚損のプロトコルが以前の研究16で確認されます。
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Representative Results
ほとんどの部分は、表皮と真皮の皮膚を構成します。ケラチノ サイトは、表皮の主要な細胞型と線維芽細胞は、真皮の主要な細胞のタイプ。表皮細胞分化のスキームを図 1に示します。CBMC iPCSc はビトロネクチン コーティング皿 (図 1B) に維持されました。本研究では EB 形成を利用した線維芽細胞とケラチノ サイトに CBMC Ips を区別されます。EBs では絞首刑を使用して生成したケラチノ サイトと線維芽細胞 (図 1C) の制服と制御された分化を確実にドロップします。EBs のタイプの表皮細胞の IV コラーゲン コーティング プレートに取り付けられていたし、媒体は毎日変更されました。CBMC Ips は、RA、BMP4、EGF と扱われました。CBMC Ips は、ケラチノ サイトに分化しました。分化、CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトの形態変化 (補足図 1)。
CBMC iPSC 由来ケラチノ サイト主ケラチノ サイト (図 1D) と同様の形態があります。多能性マーカー OCT4 の発現は CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトのダウンレギュ レートだったプライマー シーケンスは、表 1のとおりです。Np63、KRT5, KRT14 表皮細胞マーカーの発現は CBMC iPSC 由来ケラチノ サイト (図 1F) に増加しました。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトは、免疫組織化学 (図 1E) Np63 および KRT14 発現によって確認されました。これらの結果は、CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトがプライマリ ケラチノ サイトの特性を持つことを確認します。
線維芽細胞分化のスキームを図 2に示します。また、ビトロネクチン コーティング皿に CBMC Ips を維持し、(図 2B, C) の線維芽細胞分化用 EB 形成。我々 は EBs を基底膜マトリックス コーティング プレートに接続されているし、一日おきに媒体を変更します。伸長細胞に noncoated 移ったおよびタイプ I のコラーゲン コーティング プレート。CBMC Ips は、線維芽細胞に分化しました。分化、CBMC iPSC 由来線維芽細胞の形態は変わった時間 (補足図 2)。
CBMC iPSC 由来線維芽細胞がある形態主な線維芽細胞 (図 2D) に似ています。多能性幹細胞のマーカー OCT4 の発現は CBMC iPSC 由来線維芽細胞のダウンレギュ レートだった線維芽細胞マーカー CD44、COL3A1、COL1A2 COL1A1 は CBMC iPSC 由来線維芽細胞 (図 2F) で亢進しました。プライマー シーケンスは、表 1のとおりです。また、CBMC iPSC 由来線維芽細胞は、免疫組織化学 (図 2E) ビメンチン, フィブロネクチンの発現によって確認されました。CBMC iPSC 由来線維芽細胞が主に線維芽細胞に類似しているが示唆されました。
我々 は CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を使用して 3 D 肌 organoid を生成されます。3 D 肌 organoid の形成のスキームを図 3に示します。我々 は、膜挿入プレートで 3 D 肌 organoid を生成されます。3次元培養 CBMC iPSC 由来線維芽細胞であったタイプ私コラーゲンを成層し、重ねて CBMC iPSC 由来ケラチノ サイト。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイト, 播種後培地は、2 日間の通常のカルシウム濃度に変更されました。2 日後高カルシウム濃度培地は気液界面文化の形成の下院にのみ追加されました。気液界面培養による成熟とケラチノ サイトの階層。3 D 肌 organoid の厚さは、3次元培養中に増資。これらの結果は、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色 (図 3C) によって 3 D 肌 organoid が iPSC 由来ケラチノ サイトと線維芽細胞から生成されたことを確認します。
CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoid を使用して、我々 はマウスに 3 D 肌 organoid をグラフト化によるヒト化マウス モデル (図 3B) を生成しました。1 cm × 2 cm の欠損を促したし、タイオーバー法は移植のために使用されました。2 週間後移植した皮膚効率的に、マウスに移植したところ、H & E と免疫細胞化学的解析 (図 3D) によってこれを確認しました。表皮細胞の成熟と loricrin と KRT14 表皮分化マーカーは CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoids (図 3E) で表現されました。CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoids 区別された機能的、効率的にマウス、接ぎ木、マウスの皮膚の欠陥を効果的に治癒します。
図 1: CBMC Ips の表皮細胞分化します。CBMC Ips から表皮細胞の (A) の方式です。(BとC) CBMC Ips (パネルB) と iPSC 由来 EBs (パネルC) の形態。(D) CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトの形態。(E) Np63 (赤) と一緒に (青) を汚す DAPI KRT14 (緑) の免疫組織化学的解析。スケールバー = 100 μ m。(F) 多能性マーカーと iPSC 由来ケラチノ サイト (iPSC Ks) の表皮細胞マーカーの発現。グラフは、5 つの独立したサンプルの SEM の意味を見る。学生のtを使用して統計的に有意差を調べた-テストします。T-テストを行った分析ノンパラ メトリックの定量的なデータセット、および片側p-値の計算 (*p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001 に統計的有意性が示されている)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: CBMC Ips の線維芽細胞分化します。CBMC Ips から線維芽細胞分化の (A) の方式です。(BとC) CBMC Ips (パネルB) と iPSC 由来 EBs (パネルC) の形態。(D) CBMC iPSC 由来線維芽細胞の形態。(E) ビメンチン (赤) と一緒に DAPI 染色 (青) (赤)、フィブロネクチンの免疫細胞化学的解析。スケールバー = 100 μ m。(F) 多能性マーカーと iPSC 由来線維芽細胞 (iPSC Fs) の線維芽細胞マーカーの発現。グラフは、5 つの独立したサンプルの SEM の意味を見る。学生のtを使用して統計的に有意差を調べた-テストします。T-テストを行った分析ノンパラ メトリックの定量的なデータセット、および片側p-値の計算 (*p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001 に統計的有意性が示されている)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: CBMC iPSC 由来皮膚器官毛細とヒト化マウス モデル生成します。(A) iPSC 由来皮膚 organoid (iSO) 生成過程の模式図。(B) 移植マウスへの iSO のプロセス。(C) 生体外での iSO の組織学的解析。(D) 生体内移植された iSO の組織学的解析。(E-H)Loricrin と KRT14 の免疫細胞化学的解析。コントロール (パネルE)、移植された iSO (パネルFloricrin)、マウス皮膚 (ネガティブ コントロール、パネルG)、移植された iSO (標示板H, KRT14) を模擬します。スケール バー 200 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: iPSC 由来ケラチノ サイトの形態。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2: iPSC 由来線維芽細胞の形態。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲット名 | 方向 | プライマー シーケンス (5' 3') | サイズ (基礎組) | Refseq_ID | |
| OCT4 | フォワード 逆 |
ACCCCTGGTGCCGTGAA GGCTGAATACCTTCCCAAATA |
190 | NM_203289.5 | |
| PAX6 | フォワード 逆 |
GTCCATCTTTGCTTGGGAAA TAGCCAGGTTGCGAAGAACT |
110 | NM_000280.4 | |
| SOX1 | フォワード 逆 |
CACAACTCGGAGATCAGCAA GGTACTTGTAATCCGGGTGC |
133 | NM_005986.2 | |
| Np63 | フォワード 逆 |
GGAAAACAATGCCCAGACTC GTGGAATACGTCCAGGTGGC |
294 | NM_001114982.1 | |
| KRT5 | フォワード 逆 |
ACCGTTCCTGGGTAACAGAGCCAC GCGGGAGACAGACGGGGTGATG |
198 | NM_000424.3 | |
| KRT14 | フォワード 逆 |
GCAGTCATCCAGAGATGTGACC GGGATCTTCCAGTGGGATCT |
181 | NM_000526.4 | |
| CD44 | フォワード 逆 |
AAGGTGGAGCAAACACAACC AGCTTTTTCTTCTGCCCACA |
151 | NM_001202556.1 | |
| COL1A1 | フォワード 逆 |
CCCCTGGAAAGAATGGAGATG TCCAAACCACTGAAACCTCTG |
148 | NM_000088.3 | |
| COL1A2 | フォワード 逆 |
GGATGAGGAGACTGGCAACC TGCCCTCAGCAACAAGTTCA |
77 | NM_000089.3 | |
| COL3A1 | フォワード 逆 |
CGCCCTCCTAATGGTCAAGG TTCTGAGGACCAGTAGGGCA |
161 | NM_000090.3 | |
| ビメンチン | フォワード 逆 |
GAGAACTTTGCCGTTGAAGC TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT |
170 | NM_003380.5 | |
| GAPDH | フォワード 逆 |
ACCCACTCCTCCACCTTTGA CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT |
110 | NM_002046.5 | |
表 1: 量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応のため使用されるプライマーのシーケンス。
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Discussion
人間の Ips は、パーソナライズされた再生医療17のための新しい選択肢として提案されています。患者由来のパーソナライズされた Ips は、疾患モデル作製、薬剤のスクリーニングおよび自家移植18,19に使用することができます患者の特性を反映しています。患者由来の Ips の使用も一次電池、十分な細胞数, と免疫反応5,17,19の欠如に関する問題を克服できます。しかし、パーソナライズされた Ips の生成は時間、コスト、および労働の制限により経済的に実現可能ではありません。HLA ホモ CBMC 由来の Ips は、新たな可能性として浮上しています。HLA ホモ Ips は経済的に貴重なことができ、患者8,11,12,13の大規模な数に適用することができます。さらに、CBMCs の HLA タイピングにそれにそれら研究、移植のための使いやすい携帯銀行保管中に発生します。肝細胞、心筋細胞、軟骨細胞に CBMC Ips を区別するためにプロトコルがされている16,20,21,22,23を報告します。
表皮及び真皮層は、皮膚のコンポーネントです。表皮ケラチノ サイトと真皮線維芽細胞で構成されています。だから、私たち CBMC Ips に区別ケラチノ サイトと線維芽細胞、それぞれ。絞首刑によって生成された制服を着たよく制御し、最適化された EBs 分化の方法15,24をドロップします。IV 型コラーゲンは基底膜の主要なコンポーネントです。表皮細胞分化の EBs IV コラーゲンコートディッシュを入力に接続されています。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトは、石畳のような形状 (図 1D) を持っていた。表皮細胞マーカー Np63 と KRT14 いた iPSC Ks (図 1E, F) で表されます。その結果は、RA と BMP4 が表皮細胞マーカーの発現を誘導することを確認しました。さらに、CBMC Ips は、表皮ケラチノ サイトの主のように区別されました。
線維芽細胞分化の EBs が基底膜マトリックス コーティング プレートに取り付けられていた、分化した細胞が直列 noncoated に継代し、タイプ I コラーゲン コーティング プレート。連続継代培養線維芽細胞の分化を誘導されました。線維芽細胞の移行と接着機能を持っていた細胞外マトリックス (ECM) を生産しました。線維芽細胞は、コラーゲン成分25も生成します。CBMC iPSC 由来線維芽細胞、線維芽細胞表面マーカー CD44 が増加しました。コラーゲンの発現された iPSC Fs (図 2F)。フィブロネクチンおよびビメンチンの発現は、iPSC Fs (図 2E) に増加しました。
差別化ケラチノ サイトと線維芽細胞を使って、我々 は CBMC iPSC 由来皮膚 organoids (図 3A) を生成されます。CBMC iPSC 由来皮膚オルガノイドの成層の層を誘発高カルシウム中の気液界面培養を使いました。空気液体インターフェイスを使用して開発した多層層26,27,28中カルシウムの高濃度ケラチン生成細胞成熟の生体内および生体外での必要があります。実際皮膚と組織学的解析皮膚が成層だったことを示した (図 3C) を模倣するこの方法を使いました。創傷治癒能力を確認するため我々 iSO に移植マウス皮膚タイオーバー ドレッシング法 (図 3D) を用いたします。移植後皮膚オルガノイド効率的に接木され、マウス皮膚を十分に癒されました。KRT14 験扁平上皮および nonsquamous 上皮の基底層で表現しました。Loricrin は、分化し、角化上皮細胞29,30末期は、角質層の主要なコンポーネントです。Loricrin の表皮分化マーカーは、移植した皮膚に表現されました。皮膚器官毛細は完全に成熟した免疫組織染色 (図 3E) によって分化を示した KRT14 および loricrin の発現が確認.
本研究では、ケラチノ サイトと線維芽細胞、ヒトの皮膚の主要な細胞型に CBMC Ips を区別するためにプロトコルを開発しました。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトと線維芽細胞により表現型を示したことが一次電池ラインに似ていますを確認しました。これらの分化した細胞を使用して、我々 は 3 D 肌 organoid を生成され、タイオーバー ドレッシング法を用いたうなずき/scid マウスに移植しました。この独自の手法は最初に 1929 年にブレアとブラウンによって記述されていたし、皮膚移植31,32によく使用されています。このメソッドは、移植片の移動を妨げ、傷口に良好な接着性を支持、従って組織の治癒を促進します。組織学的解析は、正常に成層、2 週間以上の成熟した人間の皮膚表現を 3 D 肌 organoid に模倣を確認しました。皮膚移植が一般的に行われるケラチノ サイトと線維芽細胞の単一細胞を用いたシリコン泡箱33,34。このシステムは簡単に移植が、移植後の移植効率に観察のためより多くの時間が必要があります。プラスチックやシリコンのチャンバーは、マウスの皮膚に対するバリアとして機能します。3 D 肌 organoid システム由来 Ips はプラスチックやシリコンのチャンバーを使用しないでください。このシステムで移植された効率的です;しかし、マウスの自然治癒のプロセスをブロックすることは困難だった。だから、マウスの皮膚は移植後に長い時間のため、iSO の多くの部分をカバーしました。これは改善する必要がここに提示法の一部です。
結論としては、CBMC Ips は、皮膚移植の潜在的な細胞ソースです。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイト、これらのプロトコルを使用して、皮膚科学・医薬品と化粧品のスクリーニング ・再生医療に関連する研究で、線維芽細胞および 3 D 肌 organoid を使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、保健福祉家族部、大韓民国 (H16C2177、H18C1178) 韓国医療技術 R & D プロジェクト、省からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | - | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
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