Summary
ونحن نقترح بروتوكول يوضح كيفية التفريق بين الخلايا الكيراتينيه المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent والليفية وتوليد أورجانويد جلد 3D، استخدام هذه الخلايا الكيراتينيه والليفية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة إضافية لتوليد نموذج فئران أنسنة. هذه التقنية المقدمة هنا سيحسن البحوث الجلد.
Abstract
الجلد هو أكبر جهاز في الجسم، والعديد من الوظائف. الجلد ويعمل كحاجز مادي والحامي للجسم وينظم وظائف الجسم. بيوميميتيقا هو تقليد النماذج والنظم، وعناصر الطبيعة تهدف إلى حل المشاكل الإنسانية المعقدة1. بيوميميتيقا الجلد أداة مفيدة للبحوث في مجال الأمراض في المختبر والمجراه في الطب التجديدي. وقد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أن الخاصية غير محدود الانتشار وقدرة التمايز على الطبقات الجرثومية الثلاث. يتم إنشاء إيبسكس البشرية من الخلايا الأولية المختلفة، مثل خلايا الدم والخلايا الكيراتينيه والليفية وأكثر. فيما بينها، ظهرت الخلايا وحيدات النوى دم الحبل (كبمكس) كمصدر لخلايا بديلة من منظور الطب التجديدي متمكنة. كبمكس مفيدة في الطب التجديدي لكتابة (هلا) مستضد الكريات البيض البشرية ضروري للخلية النظام المصرفي. نحن نقدم طريقة للتفريق بين إيبسكس كبمك الكيراتينيه والليفية وجيل من أورجانويد الجلد 3D. المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الكيراتينيه والليفية لها خصائص مماثلة لخط خلية الأولية. أورجانويدس 3D الجلد يتم إنشاؤها بواسطة تراكب طبقة البشرة على طبقة الجلد. بزرع أورجانويد الجلد ثلاثية الأبعاد هذه، يتم إنشاء نموذج فئران أنسنة. وتبين هذه الدراسة أن أورجانويد 3D جلد الإنسان المستمدة من اللجنة التوجيهية قد تكون أداة جديدة وبديلة لبحوث الجلد في المختبر والمجراه.
Introduction
الجلد يغطي سطح الأبعد من الجسم، ويحمي الأعضاء الداخلية. الجلد وظائف مختلفة، بما في ذلك حماية ضد العوامل الممرضة وامتصاص وتخزين المياه، وتنظيم درجة حرارة الجسم، والتغوط الجسم النفايات2. ترقيع الجلد يمكن أن تصنف تبعاً لمصدر الجلد؛ وتسمى ترقيع الجلد من مانح آخر باستخدام اللوجرافتس، وترقيع الجلد للمريض باستخدام أوتوجرافتس. على الرغم من أن أوتوجرافت هو العلاج المفضل بسبب رفض منخفضة المخاطر، خزعات الجلد يصعب القيام به في المرضى الذين يعانون من آفات شديدة أو عدد غير كاف من خلايا الجلد. في المرضى الذين يعانون من حروق شديدة، ثلاث مرات عدد خلايا الجلد ضرورية لتغطية مساحات كبيرة. التوفر المحدود لخلايا الجلد من جسم المريض النتائج في الحالات التي يلزم فيها زرع اللوجينوس. Allograft يستخدم مؤقتاً حتى يمكن إجراء الزرع الذاتي حيث عادة ما رفضه من قبل النظام المناعي للمضيف بعد قرابة أسبوع واحد3. للتغلب على الرفض المناعي للمريض، يجب أن تأتي الطعوم من مصدر بنفس الهوية المناعية ك المريض4.
إيبسكس البشرية مصدرا ناشئة من الخلايا للخلايا الجذعية العلاج5. يتم إنشاء إيبسكس البشرية من خلايا جسدية، باستخدام عوامل إعادة برمجة مثل OCT4، SOX2، Klf4، وحركة ج6. استخدام إيبسكس البشرية ويتغلب على المسائل الأخلاقية والمناعية للخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا)،من78. وقد بلوريبوتينسي إيبسكس البشرية ويمكن أن تفرق في الطبقات الجرثومية الثلاث9. وجود هلا، عاملاً حاسما في الطب التجديدي، يحدد الاستجابة المناعية، وإمكانية رفض10. استخدام إيبسكس المستمدة من المريض يحل مشاكل رفض نظام المناعة والحد من الخلية المصدر. وظهرت أيضا كمصدر لخلايا بديلة للطب التجديدي11كبمكس. هلا إلزامية كتابة، الذي يحدث أثناء كبمك المصرفية، يمكن استخدامها بسهولة للبحوث، وزرع الأعضاء. يمكن تطبيق إيبسكس هلا من نوع متماثل، وكذلك على نطاق واسع لمختلف المرضى12. وهو مصرف كبمك-اللجنة التوجيهية الرواية واستراتيجية فعالة لعلاج الخلايا والطب التجديدي allogenic12،،من1314. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم كبمك-إيبسكس، متباينة في الخلايا الكيراتينيه والليفية، وتكوين طبقات الجلد 3D طبقية. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن أورجانويد المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك 3D جلد أداة جديدة للبحوث في المختبر والمجراه في الجلد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا "قانون رعاية الحيوانات المختبرية"، دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والمبادئ التوجيهية والسياسات المتعلقة "التجريب القوارض" التي تقدمها إلى "رعاية الحيوان المؤسسية" و استخدام اللجنة (إياكوك) من كلية الطب في الجامعة الكاثوليكية في كوريا. وأقر البروتوكول دراسة "مجلس المراجعة المؤسسية" "الجامعة الكاثوليكية كوريا" (كومك-2018-0191-01). إياكوك وقسم من مختبر الحيوانات (مجانين) جامعة كوريا الكاثوليكية، حرم سونجيوي المعتمدة مرفق مختبر "الحيوان التميز كوريا" كوريا إدارة الأغذية والعقاقير في الرابطة 2017 والمكتسبة لتقييم و الاعتماد الاعتماد الكامل الدولي الدولي رعاية الحيوانات المختبرية (آآلاك) في عام 2018.
1-الجلد تمايز خلية من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent
- إعداد متوسطة
ملاحظة: تخزين جميع المتوسطة في 4 درجات مئوية في بيئة مظلمة لمدة تصل إلى 3 أشهر. تصفية جميع المتوسطة باستخدام نظام تصفية بولييثيرسولفوني 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام للتعقيم. جميع المتوسطة كانت متاحة في إجمالي حجم 500 مل.- إعداد KDM1 (keratinocyte التمايز متوسطة 1). المتوسطة (دميم تعديل النسر مزيج دولبيكو)/F12 المتوسطة (3:1) مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS)، 0.3 حامض الأسكوربيك L ملمول/لتر، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين و 24 ميكروغرام/مل الأدنين.
- إعداد KDM2 (keratinocyte التمايز متوسطة 2). تعريف المزيج keratinocyte خالية من المصل المتوسط (انظر الجدول للمواد) مع 0.3 حامض الأسكوربيك L mmol/l و 5 ميكروغرام/مل الأنسولين الأدنين 10 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: keratinocyte محددة خالية من المصل المتوسط هو الأمثل لدعم النمو وتوسيع نطاق من الخلايا الكيراتينيه. - إعداد KDM3 (keratinocyte التمايز متوسطة 3). مزيج المعرفة المتوسطة خالية من المصل keratinocyte و keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (1:1) انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل.
ملاحظة: Keratinocyte خالية من المصل المتوسط هو الأمثل للنمو والحفاظ على الخلايا الكيراتينيه. - إعداد FDM1 (تنتجها الخلايا الليفية التمايز متوسطة 1). مزيج DMEM/F12 المتوسطة (3:1) مع 5% FBS، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، الأدنين 0.18 مم، وعامل نمو البشرة 10 نانوغرام/مليلتر (مماثلة).
- إعداد FDM2 (تنتجها الخلايا الليفية التمايز متوسطة 2). مزيج DMEM/F12 المتوسطة (1:1) مع 5% FBS و 1% الأحماض الأمينية غير الأساسية.
- إعداد EP1 (الظهارة المتوسطة 1). مزيج DMEM/F12 (3:1) مع 4 مم الجلوتامين ل 40 ميكرومتر الأدنين، 10 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، الأنسولين 10 ميكروغرام/مل و 0.1% FBS.
- إعداد EP2 (الظهارة المتوسطة 2). مزيج EP1 وكلوريد الكالسيوم 1.8 مم.
- إعداد EP3 (الظهارة المتوسطة 3، كورنيفيكيشن المتوسطة). F12 ميكس المتوسطة مع 4 مم الجلوتامين ل 40 ميكرومتر الأدنين، 10 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، الأنسولين 10 ميكروغرام/مل، 2% FBS وكلوريد الكالسيوم 1.8 مم.
- جيل الجسم الجنيني
- توليد كبمك-إيبسكس باستخدام البروتوكول هو موضح في دراسة سابقة12.
- معطف أطباق الثقافة، باستخدام فيترونيكتين. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم.
- ذوبان الجليد وريسوسبيند 50 ميكروليتر من فيترونيكتين 0.5 ملغ/مل (التركيز النهائي: 5 ميكروغرام/مل) مع 5 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) حاء 1 أسبيراتي مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
- الحفاظ على إيبسكس المستمدة من كبمك إلى 100 ملم المغلفة فيترونيكتين لوحة وتغيير المتوسطة اللجنة التوجيهية (E8) يوميا في 37 درجة مئوية مع شركة 10%2.
- إنشاء هيئات الجنينية (EBs) باستخدام البروتوكول هو مبين في دراسة سابقة15 (وصف بإيجاز على النحو التالي). قم بتوسيع إيبسكس عن طريق تغيير الوسيطة حتى وصلت الخلايا التقاء 80%. في التقاء 80%، إزالة المتوسطة ويغسل مع برنامج تلفزيوني.
- علاج الخلايا مع 1 مل حامض الإيثيلين 1 مم (يدتا). احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 2 دقيقة وحصاد الخلايا باستخدام 3 مل متوسطة E8. الطرد المركزي الخلايا في 250 س ز 2 دقيقة.
- نضح المادة طافية وتطبيق 5 مل من E8 المتوسطة للخلايا. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 1 × 106 خلايا لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. الطرد المركزي الخلايا في 250 س ز 2 دقيقة.
- ريسوسبيند الخلايا المحولة مع 2.5 مل متوسطة تشكيل المجلس التنفيذي مع 10 ميكرومترات المرتبطة رو كيناز (روك) المانع. قطره 1 × 104 خلايا (25 ميليلتر في إسقاط) على غطاء لوحة ثقافة نونكواتيد استخدام 10 – 100 ميكروليتر ماصة متعددة القنوات. نموذج 100 الحديدية من 1 × 106 خلايا (1 × 104 خلايا/1 EB). اقلب الطبق وتشبث الحبرية للغطاء.
ملاحظة: هناك حاجة إلى مثبط روك خلال الخطوة مرفق في عملية الصيانة والتمايز. إضافة مثبطات روك فقط في مرحلة التجميع EB. - احتضان قطرات عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة يوم واحد.
- في اليوم التالي، الحصاد 100 الحديدية واستخدامها للتفرقة. تغسل غطاء لوحة مع اللجنة التوجيهية المتوسطة (المتوسطة E8) أو برنامج تلفزيوني والحصاد محتوياته إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الحفاظ على الحديدية على RT لمدة 1 دقيقة ليستقر عليها. نضح المادة طافية، ريسوسبيند الحديدية مع المتوسطة E8، والمحافظة عليها في 90 مم طبق بيتري حتى التفريق بين.
- التفريق بين إيبسكس كبمك في الخلايا الكيراتينيه
ملاحظة: لمخطط للتفريق بين keratinocyte من كبمك-إيبسكس، انظر الشكل 1ألف.- الحصاد 100 الحديدية إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع اللجنة التوجيهية المتوسطة أو برنامج تلفزيوني. الحفاظ على RT لمدة 1 دقيقة ليستقر الحديدية. تأكد من أنها تسوية في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية. نضح المادة طافية وريسوسبيند الحديدية مع E8 متوسطة مع العظم نانوغرام/مليلتر 1 بروتين morphogenetic 4 (BMP4). نقل الحديدية إلى 90 مم طبق بيتري والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة يوم واحد.
- معطف أطباق الثقافة، باستخدام الكولاجين النوع الرابع. إعداد 5 مل من نوع الكولاجين الرابع معطف طبق 100 مم.
- ذوبان الجليد وريسوسبيند نوع الحل الكولاجين الرابع (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام/مل) مع 0.05 N HCl. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في RT حاء 1 نضح مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
ملاحظة: قبل استخدام اللوحات، غسل الأطباق 3 x مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي حمض.
- ذوبان الجليد وريسوسبيند نوع الحل الكولاجين الرابع (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام/مل) مع 0.05 N HCl. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في RT حاء 1 نضح مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
- حصاد الحديدية (الخطوة 1.3.1) إلى أنبوب مخروطي 50 مل والمحافظة عليها في RT لمدة 1 دقيقة ليستقر عليها. تأكد من أنها تسوية في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية ونضح المادة طافية وريسوسبيند الحديدية في 6 مل KDM1 مع 10 ميكرون روك المانع. نقل الحديدية للطبق المغلفة بالكولاجين 100 مم النوع الرابع.
ملاحظة: إضافة مثبط روك فقط في مرحلة مرفق EB. - بين أيام 0 – 8، تغيير في المتوسط كل يوم إلى KDM1 مع 3 حمض الريتينويك ميكرومتر (RA) و 25 نانوغرام/مليلتر كل من BMP4 ولو. الحفاظ على الحديدية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- بين أيام 9-12، تغيير في المتوسط كل يوم إلى KDM2 مع 3 ميكرومتر را و 25 نانوغرام/مل BMP4 20 نانوغرام/مليلتر لو.
- بين أيام 13 – 30، تغيير في المتوسط كل يوم إلى KDM3 مع 10 نانوغرام/مل BMP4 و 20 نانوغرام/مليلتر لو.
- التفريق بين كبمك-اللجنة التوجيهية في الخلايا الليفية
ملاحظة: لمخطط للتفريق بين تنتجها الخلايا الليفية من كبمك-إيبسكس، انظر الشكل 2أ.- معطف أطباق الثقافة، باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم.
- ذوبان الغشاء مصفوفة (التركيز النهائي: 600 نانوغرام/مل) وتمييع مع المتوسطة DMEM/F12. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 Aspirate مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
- الحصاد 100 الحديدية إلى أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام ماصة مع اللجنة التوجيهية المتوسطة أو برنامج تلفزيوني. الحفاظ على RT لمدة 1 دقيقة ليستقر الحديدية. ضمان يستوطنون في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية. إزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند الحديدية استخدام ماصة ميليلتر 1,000 في 6 مل FDM1 مع 10 ميكرون روك المانع. نقل الحديدية (بالمتوسط) إلى طبق المغلفة بمصفوفة 100 ملم غشاء واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2. تحديث FDM1 كل يوم لمدة 3 أيام.
ملاحظة: إضافة فقط المانع روك في مرحلة مرفق EB. - إضافة العظام نانومتر 0.5 البروتين morphogenetic 4 (BMP 4) إلى FDM1 بين 4 و 6 أيام.
- في يوم 7، تغيير في المتوسط إلى FDM2 كل يوم لمدة أسبوع واحد.
- في يوم 14، أضف 1 مل من 1 مم يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 للحد الأدنى 2 حصاد الخلايا مع 3 مل من FDM2 وأجهزة الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 5 مل FDM1.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، ريسوسبيند 2 × 106 خلايا مع FDM1 المتوسطة، ونقل الخلايا إلى الطبق نونكواتيد. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 وتغيير في المتوسط كل يوم.
- معطف ثقافة الأطباق، استخدام النوع الأول من الكولاجين. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم. تمييع الحل الكولاجين من النوع الأول (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام/مل) في حامض الخليك N 0.02. إضافة الحل إلى الأطباق واحتضان في RT حاء 1 أسبيراتي مواد الطلاء قبل الاستخدام (عدم تجف).
ملاحظة: قبل استخدام اللوحات، غسل الأطباق 3 x مع برنامج تلفزيوني لإزالة الحامض. - في يوم 21، أضف 1 مل من 1 مم يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 للحد الأدنى 2 حصاد الخلايا مع 3 مل من FDM1 وأجهزة الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 5 مل FDM1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 2 × 106 خلايا للنوع أنا طبق المغلفة بالكولاجين 100 ملم مع المتوسطة FDM1. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 وتغيير في المتوسط كل يوم.
- في يوم 28، أضف 1 مل من 1 مم يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 للحد الأدنى 2 حصاد الخلايا مع 3 مل من FDM1 وأجهزة الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 5 مل FDM1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 2 × 106 خلايا لطبق نونكواتيد مع FDM1 المتوسطة. الحفاظ على الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 وتغيير في المتوسط كل يوم.
ملاحظة: تتكاثر الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية مثل خط الخلية تنتجها الخلايا الليفية الأولية والمرور ما يصل إلى 10 مقاطع. في هذه الدراسة، استخدمنا الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية من اثنين إلى خمسة ممرات لمزيد من التحليل.
- معطف أطباق الثقافة، باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إعداد 5 مل معطف طبق 100 مم.
2-تطبيق الخلايا المتمايزة المستمدة من هيبسك
-
جيل من الجلد 3D أورجانويد
- إعداد نوع معادلتها أنا الكولاجين على الجليد، واتباع توصيات الشركة المصنعة. كالتركيز النهائي، استخدام 3 مغ/مل للنوع الأول من الكولاجين (تركيز المخزون من النوع الأول الكولاجين 3.47 مغ/مل)، والتأكد من حجم الخليط النهائي 5 مل. حساب حجم 10 x PBS (الحجم النهائي/10 = 0.5 مل). حساب الحجم من النوع الأول من الكولاجين لاستخدامها (الحجم النهائي × تركيز الكولاجين النهائي/الأسهم تركيز الكولاجين = 5 مل × 3 مغ/مل/3.47 مغ/مل = 4.32 مل). حساب حجم هيدروكسيد الصوديوم N 1 (حجم الكولاجين تستخدم x 0.023 مل = 0.1 مل). حساب حجم dH2س (الحجم النهائي-الحجم الكولاجين-حجم برنامج تلفزيوني 10 x-حجم هيدروكسيد الصوديوم ن 1 = 5 مل-مل 4.32-مل 0.5-0.1 مل = 0.08 مل). خلط محتويات الأنبوبة وإبقائه على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
- إضافة 1 مل أدتا إلى الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية من الخطوة 1.4.10 واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 دقيقة 2 حصاد الخلايا المنفصلة، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، ونقل 2 × 105 خلايا لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. الطرد المركزي في 250 س ز 2 دقيقة وإزالة المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية في 1.5 مل FDM1 وتحييد النوع أنا الحل الكولاجين (1:1).
ملاحظة: مزيج الحل برفق لتجنب الفقاعات. - مكان إدراج غشاء على ميكروسكوبية 6-جيدا ونقل الخليط إلى الإدراج واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحات. - بعد التأكد من جيلاتيون، إضافة 2 مل متوسطة إلى الجزء العلوي من إدراج و 3 مل إلى أسفل البئر. احتضان مصفوفة الليفية والكولاجين في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 5-7 أيام، حتى تكتمل جيليشن، ولم تعد العقود.
- وبعد جيلاتيون كاملة، فصل الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية (من الخطوة 1.3.6) باستخدام يدتا. أضف 1 مل يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 دقيقة 2 حصاد الخلايا المنفصلة، يعول عليها باستخدام هيموسيتوميتير، ونقل 1 × 106 خلايا لأنبوب مخروطي 15 مل جديدة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 2 دقيقة.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند 1 × 106 خلايا في 50-100 ميليلتر من الكالسيوم منخفضة الظهارة المتوسطة 1 (EP1).
- نضح المتوسطة كافة في المصفوفة (راجع الخطوة 2.1.5) والبذور 1 × 106 خلايا من الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية على كل طبقة تنتجها الخلايا الليفية. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحة ولا تقم بإضافة أي وسيلة لإلحاق keratinocyte. - إضافة 2 مل EP1 إلى الجزء العلوي من إدراج و 3 مل من EP1 إلى أسفل البئر.
- بعد يومين، نضح المتوسطة كافة في لوحة إدراج غشاء وتغيير المتوسطة للكالسيوم العادي EP2 لمدة يومين.
- وبعد يومين، نضح المتوسطة جميع وأضف 3 مل الوسط كورنيفيكيشن فقط لأسفل لإنشاء واجهة الهواء السائل.
- الحفاظ على أورجانويد 3D الجلد لمدة تصل إلى 14 يوما في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 وتغيير في المتوسط كل يوم. حصاد أورجانويد 3D الجلد بقطع حافة الإدراج، واستخدامه لدراسة أخرى لتلطيخ والاختلاس الجلد.
-
الاختلاس الجلد
- إجراء التخدير استنشاق على الإيماءة/مشمولان الفئران (ذكور، 6 أسابيع من العمر)، واستخدام طريقة قياسية من الناحية المؤسسية المعتمدة. للاختلاس الجلد، يحلق فرو الجلد الظهرية كل الماوس.
- قم بإزالة مقطع 1 × 2 سم من الجلد للماوس، باستخدام مقص منحنى بالملقط.
- مكان أورجانويد المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الجلد 3D على موقع الخلل وخياطة باستخدام أسلوب خلع ملابس أكثر من التعادل مع خيوط الحرير.
- مراقبة الفئران لمدة أسبوعين والتضحية بهم للتحليل النسيجي. تم التحقق من البروتوكول المصبوغة في الدراسات السابقة16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتألف الجلد، معظمها، من البشرة والأدمة. الكيراتينيه هي الخلية الرئيسية نوع البشرة والليفية نوع الخلية الرئيسية الأدمة. مخطط keratinocyte التمايز يظهر في الشكل 1ألف. وأبقى على إيبكسك كبمك في صحن فيترونيكتين المغلفة (الشكل 1ب). في هذه الدراسة، ونحن متباينة إيبسكس كبمك الكيراتينيه والليفية باستخدام تكوين المجلس التنفيذي. لقد ولدت الحديدية المعلقة باستخدام إسقاط أسلوب لضمان تفريق موحدة وخاضعة للمراقبة في الخلايا الكيراتينيه والليفية (الشكل 1ج). ألحقت الحديدية لكتابة لوحات المغلفة بالكولاجين الرابع للتمايز keratinocyte، وتم تغيير في المتوسط يوميا. إيبسكس كبمك تعامل مع جمهورية أرمينيا، BMP4، ولو. إيبسكس كبمك كانت متباينة للخلايا الكيراتينيه. خلال التفريق بين، تغيير مورفولوجية الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك على مر الزمن (تكميلية الشكل 1).
وقد كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الكيراتينيه مورفولوجيس مشابهة للخلايا الكيراتينيه الأولية (الشكل 1د). وكان التعبير الجيني لعلامة pluripotent OCT4 دوونريجولاتيد في الكيراتينيه كبمك-اللجنة التوجيهية-مشتقة. وترد في الجدول 1متواليات التمهيدي. زاد التعبير عن علامات keratinocyte Np63، KRT5، و KRT14 في كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الكيراتينيه (الشكل 1و). وأكدت الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك التعبير عن Np63 و KRT14 إيمونوهيستوتشيميستري (الشكل 1ﻫ). وأكدت هذه النتائج أن كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الكيراتينيه بخصائص الخلايا الكيراتينيه الأولية.
ويبين الشكل 2ألفمخطط التمايز تنتجها الخلايا الليفية. نحن أيضا الإبقاء على كبمك-إيبسكس في صحن فيترونيكتين المغلفة واستخدمت تشكيل المجلس التنفيذي للتمايز تنتجها الخلايا الليفية (الشكل 2ب، ج). تعلق الحديدية للغشاء المغلفة بمصفوفة ألواح، وتغير في المتوسط كل يوم. تم نقل نونكواتيد إلى خلايا ثمرة ولوحات المغلفة بالكولاجين من النوع الأول. إيبسكس كبمك كانت متباينة للخلايا الليفية. خلال التفريق بين، تغيير مورفولوجية الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك على مر الزمن (تكميلية الشكل 2).
وقد كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الليفية مورفولوجيس مشابهة للخلايا الليفية الأولية (الشكل 2د). وكان التعبير عن علامة الخلية الجذعية pluripotent OCT4 دوونريجولاتيد في كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الليفية. وكانت علامات تنتجها الخلايا الليفية من COL1A1، COL1A2، COL3A1، و CD44 upregulated في كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الليفية (الشكل 2و). وترد في الجدول 1متواليات التمهيدي. كذلك، أكدت المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الليفية بالتعبير عن فيمنتين وفيبرونيكتين immunohistochemistry (الشكل 2ه). هذه النتائج تشير إلى أن الخلايا الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك مشابهة للخلايا الليفية الأولية.
ونحن إنشاء أورجانويد جلد ثلاثي الأبعاد استخدام الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك والليفية. ويبين الشكل 3ألفمخطط تشكيل أورجانويد الجلد 3D. نحن المتولدة من أورجانويد جلد 3D على لوحة إدراج غشاء. لثقافة 3D، المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الليفية كانت طبقات مع نوع الكولاجين ومضافين مع الكيراتينيه كبمك-اللجنة التوجيهية-مشتقة. بعد البذر كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الكيراتينيه، تم تغيير الوسيلة لتركيز كالسيوم عادي لمدة يومين. وبعد يومين، تمت إضافة متوسط تركيز عالية من كالسيوم فقط إلى مجلس النواب لتشكيل ثقافة واجهة الهواء السائل. ثقافة واجهة الهواء السائل المستحث بالنضج والتكوين الطبقي للخلايا الكيراتينيه. سمك أورجانويد الجلد 3D زاد خلال الثقافة 3D. وأكدت هذه النتائج أن أورجانويد الجلد 3D تم إنشاؤها من الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية والليفية التي توضع وويوزين (H & E) تلوين (الشكل 3ج).
استخدام أورجانويد المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الجلد 3D، نحن إنشاء نموذج فئران أنسنة (الشكل 3ب) بتطعيم أورجانويد الجلد 3D للفئران. حملت عيب 1 × 2 سم، وتم استخدام أسلوب أكثر من التعادل لزرع الأعضاء. بعد أسبوعين، كانت كفاءة المطعمة الجلد زرع للفئران، وأكدنا هذا بتحليل ح & هاء و immunocytochemical (الشكل 3د). وأعرب نضوج Keratinocyte وعلامات تمييز البشرة لوريكرين و KRT14 في أورجانويدس كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الجلد 3D (الشكل 3ه). أورجانويدس المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الجلد 3D كانت متباينة وظيفيا، وكفاءة المطعمة على الفئران، وفعالية تلتئم عيوب البشرة الفئران.
الشكل 1 : التفريق بين Keratinocyte كبمك-إيبسكس- (أ) نظام التمايز keratinocyte من كبمك-إيبسكس. (ب وج) مورفولوجيا كبمك-إيبسكس (فريق ب) والمستمدة من اللجنة التوجيهية الحديدية (لوحة ج). (د) مورفولوجيا الخلايا الكيراتينيه كبمك-اللجنة التوجيهية-مشتقة. (ﻫ) تحليل إيمونوسيتوتشيميكال Np63 (أحمر) و KRT14 (الأخضر)، جنبا إلى جنب مع DAPI تلطيخ (أزرق). أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر. (و) التعبير الجيني لعلامة pluripotent وعلامات keratinocyte من الخلايا الكيراتينيه المستمدة من اللجنة التوجيهية (اللجنة التوجيهية-Ks). وتظهر الرسوم البيانية يعني مع وزارة شؤون المرأة لخمس عينات مستقلة. تم فحص الفروق بين المجموعات للدلالة الإحصائية باستخدام الطالب t-اختبار. T-تم تطبيق اختبار لتحليل مجموعات البيانات الكمية nonparametric، و الذيل واحد فحسبت القيمة (*p < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001 أوضح دلالة إحصائية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التمايز تنتجها الخلايا الليفية من كبمك-إيبسكس- (أ) نظام التمايز تنتجها الخلايا الليفية من كبمك-إيبسكس. (ب وج) مورفولوجيا كبمك-إيبسكس (فريق ب) والمستمدة من اللجنة التوجيهية الحديدية (لوحة ج). (د) مورفولوجية الليفية كبمك-اللجنة التوجيهية-مشتقة. (ﻫ) تحليل Immunocytochemical فيمنتين (أحمر) وفيبرونيكتين (أحمر)، جنبا إلى جنب مع DAPI تلطيخ (أزرق). أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر. (و) التعبير الجيني لعلامة pluripotent وعلامات تنتجها الخلايا الليفية من المستمدة من اللجنة التوجيهية تنتجها الخلايا الليفية (اللجنة التوجيهية-خ). وتظهر الرسوم البيانية يعني مع وزارة شؤون المرأة لخمس عينات مستقلة. تم فحص الفروق بين المجموعات للدلالة الإحصائية باستخدام الطالب t-اختبار. T-تم تطبيق اختبار لتحليل مجموعات البيانات الكمية nonparametric، و الذيل واحد فحسبت القيمة (*p < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001 أوضح دلالة إحصائية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : توليد أورجانويد كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الجلد ونموذج الفئران أنسنة. (أ) رسم تخطيطي لعملية توليد أورجانويد (iSO) الجلد المستمدة من اللجنة التوجيهية. (ب) زرع العملية على شهادة الأيزو في الفئران. (ج) التحليل النسيجي على شهادة الأيزو في المختبر. (د) تحليل iSO زرع المجراة في غذائها. (ه–ح) تحليل إيمونوسيتوتشيميكال لوريكرين و KRT14. يسخرون من التحكم (لوحة ه)، زرع iSO (الفريق و، لوريكرين)، وجلد الفئران (المراقبة السلبية، لوحة ز)، زرع iSO (لوحة ح، KRT14). أشرطة مقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: مورفولوجية المستمدة من اللجنة التوجيهية الكيراتينيه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 2: مورفولوجيا الخلايا الليفية المستمدة من اللجنة التوجيهية- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم الهدف | الاتجاه | تسلسل التمهيدي (5 '-3') | الحجم (زوج قاعدي) | Refseq_ID | |
| OCT4 | إلى الأمام عكس |
أككككتجتجككجتجا جكتجاتاككتكككااتا |
190 | NM_203289.5 | |
| PAX6 | إلى الأمام عكس |
جتككاتكتتجكتججاا تاجككاجتجكجاجاكت |
110 | NM_000280.4 | |
| SOX1 | إلى الأمام عكس |
كاكاكتكجاجاتكاجكا جتاكتجتاتككججتجك |
133 | NM_005986.2 | |
| Np63 | إلى الأمام عكس |
جاااكاتجكككاجاكتك جتجاتاكجتككاجتجك |
294 | NM_001114982.1 | |
| KRT5 | إلى الأمام عكس |
أككجتككتججتاكاجاجككاك جكججاجاكاجاكجججتجاتج |
198 | NM_000424.3 | |
| KRT14 | إلى الأمام عكس |
جكاجتكاتككاجاجاتجتجاكك ججاتكتككاجتججاتكت |
181 | NM_000526.4 | |
| CD44 | إلى الأمام عكس |
آجتجاجكااكاكاكك أجكتتتتتكتكتجكككاكا |
151 | NM_001202556.1 | |
| COL1A1 | إلى الأمام عكس |
ككككتجااجاتجاجاتج تككااككاكتجااككتكتج |
148 | NM_000088.3 | |
| COL1A2 | إلى الأمام عكس |
جاتجاجاجاكتجكاكك تجكككتكاجكاكاجتكا |
77 | NM_000089.3 | |
| COL3A1 | إلى الأمام عكس |
كجكككتككتاتجتكاج تكتجاجاككاجتاججكا |
161 | NM_000090.3 | |
| فيمنتين | إلى الأمام عكس |
جاجاكتتجككجتجاجك تككاجكاجكتككتجتاغت |
170 | NM_003380.5 | |
| جابده | إلى الأمام عكس |
أكككاكتككتككاككتتجا كتجتجكتجتاجككااتكجت |
110 | NM_002046.5 | |
الجدول 1: تسلسل الإشعال المستخدمة للكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إيبسكس البشرية وقد اقترحت كبديل جديد للطب التجديدي شخصية17. وتعكس المستمدة من المريض إيبسكس شخصية المريض من الخصائص التي يمكن استخدامها للنمذجة المرض وفحص المخدرات والزرع الذاتي18،19. كما يمكن استخدام إيبسكس المستمدة من المريض من التغلب على المشاكل المتعلقة بالخلايا الأولية، ونقص إعداد كافية من الخلايا، وردود فعل المناعة5،،من1719. بيد أن توليد إيبسكس شخصية ليست مجدية اقتصاديا بسبب الوقت والتكلفة، وقيود العمل. هلا متماثل إيبسكس المستمدة من كبمك ظهرت كإمكانية جديدة. إيبسكس هلا متماثل يمكن أن تكون قيمة اقتصاديا، ويمكن تطبيقها على عدد كبير من المرضى8،11،،من1213. وعلاوة على ذلك، هلا والكتابة كبمكس يحدث أثناء تخزين البنك الخلية، مما يجعلها سهلة الاستخدام للبحث وزرع. بروتوكولات التفريق بين إيبسكس كبمك في cardiomyocytes، وخلايا الكبد، وتشوندروسيتيس وقد ذكرت16،،من2021،،من2223.
طبقات البشرة والجلد مكونات الجلد. تتكون البشرة من الخلايا الكيراتينيه وتتكون الأدمة الخلايا الليفية. لذا، نحن متباينة إيبسكس كبمك الكيراتينيه والليفية، على التوالي. الحديدية يرتدون الزي الرسمي، والتي تسيطر عليها جيدا، والأمثل للتفريق بين، تم إنشاؤها بواسطة الشنق إسقاط أسلوب15،24. النوع الرابع الكولاجين عنصرا رئيسيا من الغشاء الطابق السفلي. Keratinocyte التفريق، ألحقت الحديدية لكتابة الأطباق المغلفة بالكولاجين الرابع. وقد كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الكيراتينيه حصاة كبيرة تشبه مورفولوجيا (الشكل 1د). وأعرب علامات Keratinocyte Np63 و KRT14 في اللجنة التوجيهية، كانساس (الشكل 1ه، و). وأكدت هذه النتيجة أن را و BMP4 التي يسببها upregulation علامات keratinocyte. وعلاوة على ذلك، كانت متباينة إيبسكس كبمك إلى الخلايا الكيراتينيه مشابهة للخلايا الكيراتينيه الأولية.
التفريق تنتجها الخلايا الليفية، ألحقت الحديدية بألواح الغشاء المغلفة بالمصفوفة، وكانت الخلايا المتمايزة متسلسل باساجيد على نونكواتيد ولوحات المغلفة بالكولاجين من النوع الأول. ثقافة فرعية مسلسل حملت على تحديد التمايز تنتجها الخلايا الليفية. الليفية المنتجة مصفوفة خارج الخلية (ECM) التي كانت مهام الهجرة والالتصاق. أيضا إنتاج الخلايا الليفية الكولاجين الوفيرة مكونات25. في كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الخلايا الليفية، زيدت علامة تنتجها الخلايا الليفية السطحية CD44. وكان التعبير عن الكولاجين أوبريجولاتيد في اللجنة التوجيهية-خ (الشكل 2و). تمت زيادة التعبير عن فيبرونيكتين وفيمنتين في اللجنة التوجيهية-خ (الشكل 2ه).
باستخدام الخلايا الكيراتينيه المتباينة والليفية، نحن ولدت أورجانويدس كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الجلد (الشكل 3أ). كنا ثقافة واجهة الهواء السائل مع وسيلة الكالسيوم العالية الناجمة عن طبقات طبقية من أورجانويدس كبمك اللجنة التوجيهية-المستمدة من الجلد. التركيز العالي للكالسيوم الضروري نضج keratinocyte المجراة في وفي المختبر، بينما تم استخدام واجهة الهواء السائل وضع طبقات متعددة الطبقات26،،من2728. لقد استخدمت هذه الطريقة لتقليد الجلد الحقيقي، وغذائها وأظهر تحليل أن كان طبقات الجلد (الشكل 3ج). لتأكيد قدرة التئام الجروح، نحن زرعها على شهادة الأيزو في جلد الفئران، استخدام أسلوب خلع الملابس أكثر من التعادل (الشكل 3د). بعد زرع الأعضاء، أورجانويدس جلد المطعمة كفاءة وتلتئم الجلد الفئران على نحو كاف. وأعرب KRT14 في الطبقة القاعدية لتساوت epithelia الحرشفية ونونسكواموس. لوريكرين هو عنصر رئيسي للطبقة القرنية الموجودة في شفاء متباينة والكيراتينيه الخلايا الظهارية29،30. وأعرب علامة تمييز البشرة من لوريكرين في زرع الجلد. وأكد التعبير عن KRT14 ولوريكرين أن أورجانويد الجلد ناضجة تماما، والتمايز وتجلى المناعي تلطيخ (الشكل 3ه).
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير بروتوكول للتفريق بين إيبسكس كبمك الكيراتينيه والليفية، وأنواع الخلايا الرئيسية من جلد الإنسان. وأكد لنا أن المستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الكيراتينيه والليفية أظهرت تعمل مماثلة لخطوط الخلايا الأولية. باستخدام هذه الخلايا المتمايزة، المتولدة من أورجانويد جلد 3D والمطعمة عليه في الفئران إيماءة/مشمولان باستخدام طريقة خلع الملابس أكثر من التعادل. ووصفت أولاً في عام 1929 ببلير وبراون هذا الأسلوب الأصلي واستخداما ترقيع الجلد31،32. هذا الأسلوب حالت دون المضي الاختلاس ويفضل التصاق جيدة للجرح وهكذا تسريع شفاء الأنسجة. وأكد التحليل النسيجي أن تحاكي أورجانويد 3D الجلد جلد الإنسان النمط الظاهري بنجاح طبقات ونضجت أكثر من 2 أسابيع. عموما يتم ترقيع الجلد باستخدام واحدة من الخلايا الكيراتينيه والليفية من السليكون الدائرة فقاعة33،34. هذا النظام من السهل graft ولكن نحتاج مزيدا من الوقت لزرع الكفاءة بعد الاختلاس. مهام دائرة من البلاستيك أو السيليكون كحاجز ضد الجلد في الفئران. إيبسكس المستمدة من نظام أورجانويد 3D الجلد لا تستخدم دائرة من البلاستيك أو السيليكون. في هذا النظام، تم زرع تتسم بالكفاءة؛ ومع ذلك، كان من الصعب لعرقلة عملية الشفاء الطبيعية للفئران. لذا، تغطي الجلد في الفئران أجزاء كثيرة من iSO لفترة طويلة بعد زرع الأعضاء. وهذا جزء من الطريقة المعروضة هنا التي يجب تحسينها.
وفي الختام، إيبسكس كبمك خلية مصدرا ترقيع الجلد. باستخدام هذه البروتوكولات، والمستمدة من اللجنة التوجيهية كبمك الكيراتينيه، الخلايا الليفية، ومن أورجانويد جلد 3D يمكن استخدامها في الدراسات المتعلقة بالأمراض الجلدية والمخدرات وفحص مستحضرات التجميل والطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمنحه من كوريا الرعاية الصحية تكنولوجيا البحث والتطوير المشروع د، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية و "شؤون الأسرة"، جمهورية كوريا (H16C2177، H18C1178).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | - | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008).
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
