Summary
我们提出了一个协议, 说明如何区分诱导多能干细胞衍生角质形成细胞和成纤维细胞, 并产生三维皮肤有机体, 使用这些角质形成细胞和成纤维细胞。该协议包含生成人性化小鼠模型的附加步骤。这里介绍的技术将改进皮肤科的研究。
Abstract
皮肤是人体最大的器官, 有许多功能。皮肤作为身体的屏障和保护者, 调节身体功能。仿性主义是模仿自然的模型、系统和元素, 目的是解决复杂的人类问题1。皮肤仿生学是体外疾病研究和体内再生医学的有用工具。人体诱导多能干细胞具有无限增殖和分化为三种生殖层的能力。人类 Ipsc 是由各种原代细胞产生的, 如血细胞、角质形成细胞、成纤维细胞等。其中, 脐带血单个核细胞 (Cbmc) 已从同种异体再生医学的角度成为替代细胞来源。Cbmc 在再生医学中很有用, 因为人类白细胞抗原 (HLA) 分型对细胞银行系统至关重要。我们提供了一种方法, 分化为角质形成细胞和成纤维细胞, 并产生三维皮肤有机体。Cbmc-ipscc 衍生角质形成细胞和成纤维细胞具有类似于原代细胞系的特征。3D 皮肤有机体是通过将表皮层覆盖在真皮层而产生的。通过移植这种3D 皮肤有机体, 生成了一个人性化的小鼠模型。本研究表明, 三维人体 ipsc 衍生皮肤有机体可能是一种新的, 替代工具的皮肤科研究在体外和体内。
Introduction
皮肤覆盖身体最外层, 保护内脏。皮肤具有多种功能, 包括预防病原体、吸收和储存水、调节体温和排泄身体废物 2。皮肤移植可以根据皮肤来源进行分类;使用另一个捐献者皮肤的移植被称为同种异体移植, 使用患者自己的皮肤的移植是自体移植。虽然自体移植是首选的治疗方法, 因为它的低排斥风险, 皮肤活检是很难执行严重病变或皮肤细胞数量不足的患者。在严重烧伤的患者中, 覆盖大面积所需的皮肤细胞数量是其三倍。患者体内皮肤细胞的有限可用性导致需要同种异体移植的情况。同种异体移植被暂时使用, 直到可以进行自体移植, 因为它通常在大约 1周3后被宿主的免疫系统拒绝.为了克服患者免疫系统的排斥, 移植必须来自与患者4具有相同免疫身份的来源。
人的 Ipsc 是干细胞治疗的新兴细胞来源5。人类的 Ipsc 是由体细胞产生的, 使用的是 OCT4、SOX2、Klf4 和 c-Myc6 等重新编程因子。使用人的 ipsc 克服了胚胎干细胞 (esc) 的伦理和免疫学问题 7,8.人的 Ipsc 具有多能性, 可分为三个细菌层9。HLA 是再生医学中的一个关键因素, hla 的存在决定了免疫反应和排斥的可能性10。使用患者衍生的 Ipsc 解决了细胞源限制和免疫系统排斥的问题。Cbmc 也已成为再生医学的替代细胞来源11。强制 HLA 分型, 发生在 CBMC 银行业务, 可以很容易地用于研究和移植。此外, 纯合 hla 型 Ipsc 可广泛应用于各种患者12。Cbmc-ipsc 库是一种新的、有效的细胞治疗和同种异体再生医学12、13、14的策略。在这项研究中, 我们使用 Cbmc-ipsc, 分化为角质形成细胞和成纤维细胞, 并产生分层的三维皮肤层。这项研究的结果表明, Cbmcc-ipscc 衍生的3D 皮肤有机体是一种新的工具, 用于体外和体内皮肤科的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有涉及动物的程序都是根据《实验动物福利法》、《实验动物护理和使用指南》以及机构动物护理机构提供的啮7号动物实验指南和政策进行的。韩国天主教大学医学院使用委员会 (IACUC)。研究议定书得到韩国天主教大学机构审查委员会的批准 (CUMC-2018-0191-01)。IACUC 和韩国天主教大学实验动物系 (DOLA) 松井校区于2017年认可了韩国食品药品监督管理局的韩国卓越动物实验室设施, 并获得了评估和动物研究协会。2018年获得国际实验动物护理 (AAALAC) 国际认证。
1. 皮肤细胞分化与诱导多能干细胞的分化
- 中等制备
注: 将所有介质在4°C 的黑暗环境中存放长达3个月。在使用灭菌前, 使用0.22μm 聚醚磺酸过滤系统对所有介质进行过滤。所有介质的总体积均为500毫升。- 制备 KDM1 (角质形成细胞分化培养基 1)。将 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM)/F12 培养基 (3:1) 与2% 的胎牛血清 (FBS)、0.3 Mmol/L l l-抗坏血酸、5μgml 胰岛素和24μgml 腺嘌呤混合。
- 准备 KDM2 (角质形成细胞分化培养基 2)。将定义的角质形成细胞无血清培养基 (见材料表) 与 0.3 mmol l-抗坏血酸、5μgml 胰岛素和10μgl 腺嘌呤混合。
注: 定义的角质形成细胞无血清学培养基得到优化, 以支持角质形成细胞的生长和扩张。 - 准备 KDM3 (角质形成细胞分化培养基 3)。混合定义的角质形成细胞无血清培养基和角质形成细胞无血清培养基 (1:1), 详见材料表。
注: 角质形成细胞无血清培养物的培养基优化了角质形成细胞的生长和维持。 - 制备 FDM1 (成纤维细胞分化培养基 1)。将 DMEM/f12 培养基 (3: 1) 与 5% FBS、5μgml 胰岛素、0.18 mm 腺嘌呤和 10 ngml 表皮生长因子 (EGF) 混合。
- 制备 FDM2 (成纤维细胞分化培养基 2)。将 DMEMM\ f12 培养基 (1:1) 与5% 的 FBS 和1% 的非必需氨基酸混合。
- 准备 EP1 (上皮介质 1)。将 DMEM/f12 (3:1) 与 4 mM l-谷氨酰胺、40μm 腺嘌呤、10μg/ml 转铁蛋白、10μgml 胰岛素和 0.1% FBS 混合。
- 准备 EP2 (上皮介质 2)。混合 EP1 和 1.8 mM 氯化钙。
- 准备 EP3 (上皮介质 3, 角化介质)。将 F12 培养基与 4 mM l-谷氨酰胺、40μm 腺嘌呤、10μgml 转铁蛋白、10μgml 胰岛素、2% FBS 和 1.8 mM 氯化钙混合。
- 胚胎体的生成
- 使用以前的研究12中显示的协议生成cbmcc-ipsc。
- 外套培养菜肴, 使用黄酮素。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。
- 解冻和再悬浮 50μl 0.5 mgml vitronectin (最终浓度: 5μg/ml), 不育磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 为5ml。将溶液加入到盘子中, 在室温 (RT) 下孵育 1小时. 使用前将涂层材料吸干 (不要干燥)。
- 将 cbmc 衍生的 Ipsc 保持在100毫米的玻璃体检测板上, 并在37°c 下每天更换 iPSC 介质 (E8), 使用10% 的co2。
- 使用先前研究15中显示的协议生成胚胎体 (eb) (简要描述如下)。通过改变培养基来扩展 Ipsc, 直到细胞达到80% 的融合。在80% 的汇合点处, 取出培养基, 用 PBS 清洗。
- 用 1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 治疗细胞。在37°c 与 5% co2 中培养 2分钟,并使用 E8 培养基3毫升的 ml 收获细胞。以 250 x g离心细胞2分钟。
- 吸入上清液, 并将 E8 培养基5毫升应用于细胞。使用血细胞仪计数细胞, 并将 1 x 106细胞转移到一个新的15毫升锥形管。以 250 x g离心细胞2分钟。
- 用 5μm RO 相关激酶 (ROCK) 抑制剂, 用 2.5 Ml 的 eb 形成培养基对转移细胞进行再利用。使用10–100μl 多通道移液器将 1 x 10 4 细胞 (25μl/滴) 滴在非涂层培养板盖上。从 1 x 106个细胞形成 100 eb (1 x10 4 cells"eb)。把盘子翻过来, 挂在水滴上的盖子上。
注: 在维护和分化过程中的连接步骤中, 需要使用岩石抑制剂。仅在 EB 聚集阶段添加 ROCK 抑制剂。 - 用 5% CO2 在37°c 下将液滴产下 1天 。
- 第二天, 收获 100个 Eb, 并使用它们进行分化。用 iPSC 介质 (E8 介质) 或 PBS 清洗板盖, 将其内容物收集到50毫升锥形管中。将在 RT 的 Eb 保持 1分钟, 以解决它们。吸起上清液, 用 E8 培养基重新悬浮 Eb, 并将其保持在90毫米培养皿中, 直到分化。
- Cbmcc-ipsc 分化为角质形成细胞
注: 关于从 Cbmcc-ipsc 分化角质形成细胞的方案, 见图 1a。- 用 iPSC 介质或 PBS 将 100 eb 收获到50毫升的锥形管中。在 RT 保持 1分钟, 以解决 Eb。确保它们在锥形管的底部沉淀。用 E8 培养基用 1 ngml 骨形态发生蛋白 4 (BMP4) 吸吸上清液并重新悬浮 Eb。将 Eb 转移到90毫米培养皿中, 并将其保持在 37°c, 并将其保持在 5% co2 1天。
- 涂衣菜肴, 使用 IV 型胶原蛋白。准备5毫升的 IV 型胶原蛋白, 以覆盖100毫米的盘子。
- 用 0.05 n HCl 解冻并重新悬浮类型的 IV 型胶原蛋白溶液 (最终浓度: 50μg ml). 将溶液加入盘中, 在 RT 孵育 1小时. 在使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
注: 在使用盘子之前, 用 PBS 清洗盘子 3倍, 以去除任何酸。
- 用 0.05 n HCl 解冻并重新悬浮类型的 IV 型胶原蛋白溶液 (最终浓度: 50μg ml). 将溶液加入盘中, 在 RT 孵育 1小时. 在使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
- 将 Eb (步骤 1.3.1) 收集到50毫升的锥形管, 并将其保持在 RT 1分钟, 以使其安顿下来。确保它们沉淀在锥形管的底部, 吸气上清液, 并用 10μm rock 抑制剂在 KDM1 的6毫升中重新悬浮 Eb。将 Eb 转移到 IV 型胶原蛋白涂层100毫米盘。
注: 仅在 EB 连接阶段添加岩石抑制剂。 - 在第0-8天之间, 每隔一天将培养基改为 KDM1, 每天使用3μm 维甲酸 (RA) 和 25 ngml 分别使用 BMP4 和 EGF。使用5% 的 CO2 将 eb 保持在 37°c.
- 在第9-12 天之间, 每隔一天将介质改为 KDM2, 使用 3μm ra、25 ngml BMP4 和 20 ngml EGF。
- 在13–30天之间, 每隔一天将介质更换到 KDM3, 使用 10 ngml BMP4 和 20 ngml EGF。
- CBMC-iPSC 分化为成纤维细胞
注: 关于与 Cbmcc-ipscs 分化成纤维细胞的方案, 见图 2a。- 涂布培养菜肴, 采用基底膜基质。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。
- 解冻基底膜基质 (最终浓度: 600 ngml), 并用 dmm任何 f12 介质稀释。将溶液加入到盘子中, 在37°c 孵育 30分钟, 在使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
- 使用带有 iPSC 介质或 PBS 的移液器将 100 Eb 收获到50毫升的锥形管中。在 RT 保持 1分钟, 以解决 Eb。确保它们在锥形管的底部沉淀。取出上清液。
- 使用 1, 000Μl 移液器在 FDM1 的6毫升中使用 10μm rock 抑制剂重新使用 eb。将 Eb (含介质) 转移到基底膜基质包覆100毫米盘, 并在37°c 孵育, 采用 5% co 2.每隔3天刷新 FDM1 3天。
注: 仅在 EB 连接阶段添加岩石抑制剂。 - 在第4天至第6天内, 在 FDM1 中加入 0.5 nM 骨形态发生蛋白 4 (BMP 4)。
- 第7天, 在一周内, 每隔一天将介质更改为 FDM2 2。
- 第14天, 加入1毫升 EDTA 1 毫升, 在37°c 孵育, 5% CO2 孵育 2分钟, 以 FDM2 的3毫升和 250 x g 的离心机孵育细胞 2分钟, 取出上清液, 重新悬浮 Fdm1 5 毫升的细胞。
- 使用血细胞计计数细胞, 用 FDM1 培养基重新悬浮 2 x10 6 细胞, 并将细胞转移到非涂层盘。使用5% 的 CO2 将电池保持在 37°c , 并每隔一天更换一次介质。
- 涂衣菜肴, 使用 I 型胶原蛋白。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。稀释 i 型胶原蛋白溶液 (最终浓度: 50Μg/ml) 在 0.02 N 醋酸中。将溶液加入到盘子中, 在 RT 孵育 1小时. 使用前对涂层材料进行吸气 (不要干燥)。
注: 在使用盘子之前, 用 PBS 清洗盘子 3倍, 以去除酸。 - 第21天, 加入1毫升 EDTA 1 毫升, 在37°c 孵育, 5% CO2 孵育 2分钟, 以 FDM1 3 毫升的速度采集细胞, 在 250 x g 处收集细胞 2分钟, 取出上清液, 重新悬浮 Fdm1 5 毫升中的细胞。使用血细胞计计数细胞, 并将 2 x 106细胞转移到 i 型胶原蛋白涂层100毫米盘与 FDM1 介质。使用5% 的 CO2 将电池保持在 37°c , 并每隔一天更换一次介质。
- 第28天, 加入1毫升 EDTA 1 毫升, 在37°c 孵育, 5% CO2 孵育 2分钟, 以 FDM1 3 毫升的速度采集细胞, 在 250 x g 处收集细胞 2分钟, 取出上清液, 重新悬浮 Fdm1 5 毫升中的细胞。使用血细胞计计数细胞, 并将 2 x 106 细胞转移到非涂层盘中, 并使用 FDM1 培养基。使用5% 的 CO2 将电池保持在 37°c , 并每隔一天更换一次介质。
注: ipscc 衍生的成纤维细胞像原生成纤维细胞系一样增殖, 通道长达10个通道。在这项研究中, 我们使用 ipscc 衍生的2至5个通道的成纤维细胞进行进一步分析。
- 涂布培养菜肴, 采用基底膜基质。准备5毫升, 以覆盖100毫米的菜。
2. hipscs 衍生分化细胞的应用
-
3D 皮肤有机体的生成
- 按照制造商的建议, 在冰上准备中和 I 型胶原蛋白。作为最终浓度, 使用 3 mgml 为 I 型胶原蛋白 (I 型胶原蛋白的库存浓度为 3.47 Mg/ml), 并确保混合物的最终体积为5毫升。计算 10倍 PBS 的体积 (最终体积 = 0.5 mL)。计算要使用的 I 型胶原蛋白的体积 (最终体积 x 最终胶原蛋白浓度/库存胶原蛋白浓度 = 5 毫升 x 3 Mgml/3.47 Mg/ml = 4.32 mL)。计算 1 N NaOH 的体积 (使用的胶原蛋白体积 x 0.023 ml = 0.1 mL)。计算 dH2o 的体积 (最终体积-胶原蛋白体积-10倍 pbs-体积为 1 n naoh = 5 ml-4.32 ml-0.5 ml-0.1 ml = 0.08 ml)。混合管的内容物, 并保持在冰上, 直到准备使用。
- 在 ipsc 衍生成纤维细胞1.4.10 中加入1毫升 edta, 在37°c 孵育, 用 5% co2 孵育 2分钟, 收获分离细胞, 使用血细胞计计数细胞, 并将 2 x 5 细胞转移到新的 15 ml 锥形管中。以 250 x g 离心 2分钟 , 并去除上清液。在 FDM1 1.5 mL 中重新移植 ipscc 衍生成纤维细胞的细胞, 并中和 i 型胶原蛋白溶液 (1:1)。
注: 轻轻混合溶液, 以避免气泡。 - 将膜插入物放在6孔微板上, 将混合物转移到插入物上, 并在 RT 孵育30分钟。
注: 不要移动板。 - 确认凝胶后, 在刀片顶部加入2毫升的介质, 在井底添加3毫升。用 5% CO2 在37°c 下将成纤维细胞和胶原蛋白基质生也就是 5-7, 直到凝胶状化完成, 不再收缩。
- 完全凝胶化后, 使用 EDTA 分离 ipsc 衍生的角质形成细胞 (从步骤 1.3.6)。加入1毫升的 EDTA, 在37°c 孵育 5% co2, 以 5分钟的时间, 收集分离细胞, 用血细胞计对其进行计数, 并将 1 x 106 细胞转移到新的 15 ml 锥形管中。以 250 x g 离心 2分钟 。
- 去除上清液, 在低钙上皮培养基 1 (ep1) 的50-100Μl 中重新悬浮 1 x 10 6 细胞。
- 将基质中的所有培养基 (参见步骤 2.1.5) 和 ipsc 衍生角质形成细胞的 1 x 10 6 细胞种子到每个成纤维细胞层。用 5% CO2 在37°c 下将板材加氢 30分钟 。
注: 不要移动板, 也不要添加任何介质来连接角质形成细胞。 - 在插入物顶部添加2毫升 EP1, 在井底添加3毫升 EP1。
- 2天后, 在膜插入板中吸气所有培养基, 并将培养基改为正常钙 EP2 2天。
- 2天后, 吸气所有培养基, 只在底部加入3毫升的玉米化介质, 以产生空气-液体界面。
- 在37°c 下使用5% 的 CO2 保持3D 皮肤有机体长达 14天, 并每隔一天更换一次介质。通过切割刀片边缘收获3D 皮肤有机体, 并将其用于染色和植皮的进一步研究。
-
皮肤移植
- 使用标准的、经制度认可的方法, 对 Nod/scid 小鼠 (男性, 6周大) 进行吸入麻醉。对于植皮, 剃光每个老鼠的背部皮肤的皮毛。
- 使用带有钳子的弯曲剪刀, 取出老鼠皮肤的1厘米 x 2 厘米部分。
- 将 Cbmc-ipscc 衍生的3D 皮肤有机体放置在缺陷部位, 并使用带丝缝线的扎针敷料方法进行缝合。
- 观察小鼠 2周, 并牺牲它们进行组织学分析。染色协议在以前的研究16中得到了验证。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
皮肤在很大程度上是由表皮和真皮组成的。角质形成细胞是表皮的主要细胞类型, 成纤维细胞是真皮的主要细胞类型。角质形成细胞分化的方案如图 1a 所示。Cbmcc-ipcsc 保存在一个玻璃体涂膜盘中 (图 1b)。在这项研究中, 我们区分 Cbmc-ipsc 到角质形成细胞和成纤维细胞使用 EB 形成。我们使用悬挂下降法生成了 Eb, 以确保角质形成细胞和成纤维细胞的均匀和可控分化 (图 1c)。在第四型胶原蛋白涂层板上加入 eb, 用于角质形成细胞分化, 培养基每日发生改变。用 RA、BMP4 和 EGF 处理 Cbmcc-ipsc。Cbmc-ipsc 被分化为角质形成细胞。在分化过程中, Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞的形态随着时间的推移而改变 (补充图 1)。
Cbmc-ipscc 衍生的角质形成细胞的形态与原代角质形成细胞相似 (图 1d)。多能标记 oct4 在 Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞中的基因表达被下调。引物序列如表 1所示。在 Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞中, 角质形成细胞标记 Np63、KRT5 和 KRT14 的表达增加 (图 1f)。通过免疫组织化学检测, np63 和 KRT14 的表达证实了 Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞 (图 1e)。这些结果证实了 Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞具有原代角质形成细胞的特征。
成纤维细胞分化方案如图 2a 所示。我们还在一个玻璃体检测物涂层盘中保持了 Cbmcc-ipsc, 并使用 EB 形成来分化成纤维细胞 (图 2b, c)。我们将 Eb 连接到基底膜基质涂层板上, 每隔一天更换一次介质。生长细胞被转移到非涂层和 I 型胶原涂层板。CBMC-iPSCs 被分化为成纤维细胞。在分化过程中, Cbmcc-ipscc 衍生成纤维细胞的形态会随着时间的推移而改变 (补充图 2)。
Cbmc-ipscc 衍生成纤维细胞的形态类似于原代成纤维细胞 (图 2d)。多能干细胞标记 OCT4 在 Cbmcc-ipscc 衍生成纤维细胞中的表达被下调。在 Cbmcc-ipscc 衍生成纤维细胞中, 对 COL1A1、COL1A2、COL3A1 和 CD44 的成纤维细胞标记进行了增强 (图 2f)。引物序列如表 1所示。此外, Cbmcc-ipc 衍生成纤维细胞通过免疫组织化学表达证实了 vimentin 和纤维连接蛋白 (图 2e)。这些结果表明, Cbmcc-ipc 衍生的成纤维细胞与原代成纤维细胞相似。
我们使用 Cbmcc-ipscs 衍生的角质形成细胞和成纤维细胞生成了三维皮肤有机体。三维皮肤有机体的形成方案如图 3a所示。我们在膜插入板上生成了3D 皮肤有机体。在三维培养中, Cbmcc-ipscc 衍生成纤维细胞被分层为 I 型胶原蛋白, 并与 Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞覆盖。在播种 Cbmcc-ipc 衍生角质形成细胞后, 培养基变为正常钙浓度2天。2天后, 仅在下腔中加入高钙浓度培养基, 形成气液界面培养。气液界面培养诱导角质形成细胞的成熟和分层。三维皮肤有机体的厚度在三维培养过程中增加。这些结果证实, 3D 皮肤有机体是由 ipscc 衍生的角质形成细胞和成纤维细胞通过血红素和 eosin (h &Amp; E) 染色 (图 3c) 产生的。
利用 Cbmc-ipc 衍生的三维皮肤有机体, 我们通过将三维皮肤有机体嫁接到小鼠身上, 生成了一个人性化的小鼠模型 (图 3b)。诱导1厘米 x2 厘米缺损, 采用捆绑法进行移植。2周后, 移植的皮肤有效地移植到小鼠身上, 我们通过 H & E 和免疫细胞化学分析证实了这一点 (图 3d)。在 Cbmcc-ipscc 衍生的三维皮肤有机体中表达了氯霉素和 KRT14 的角质形成细胞成熟和表皮分化标志物 (图 3e)。对 Cbmcc-ipc 衍生的3D 皮肤有机体进行了功能分化, 有效地移植到小鼠身上, 有效地治愈了小鼠的皮肤缺陷。
图 1: Cbmcc-ipsc 的角质形成细胞分化.(A) 从 Cbmcc-ipsc 分化角质形成细胞的方案。(B和c) cbmc-ipsc ( b组) 和 ipsc-衍生的 eb (c 组) 的形态。(D) Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞的形态。(E) np63 (红色) 和 krt14 (绿色) 的免疫细胞化学分析, 以及 dapi 染色 (蓝色)。刻度柱 = 100μm。(F) ipsc 衍生角质形成细胞 (ipsc-k) 多能标记和角质形成细胞标记的基因表达。图显示了五个独立样本的扫描电镜平均值。使用学生t-测试对各组之间的差异进行了统计意义的检查。应用t检验分析了非参数定量数据集, 计算了单尾p值 (*p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 表示有统计意义)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: Cbmcc-ipsc 的成纤维细胞分化.(A) 与 Cbmcc-ipscs 分化成纤维细胞的方案。(B和c) cbmc-ipsc ( b组) 和 ipsc-衍生的 eb (c 组) 的形态。(D) Cbmcc-ipscc 衍生成纤维细胞的形态。(E) vimentin (红色) 和纤维连接蛋白 (红色) 的免疫细胞化学分析, 以及 dapi 染色 (蓝色)。刻度柱 = 100μm。(F) ipsc 衍生成纤维细胞 (Ipsc-f) 多能标记和成纤维细胞标记的基因表达。图显示了五个独立样本的扫描电镜平均值。使用学生t-测试对各组之间的差异进行了统计意义的检查。应用t检验分析了非参数定量数据集, 计算了单尾p值 (*p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 表示有统计意义)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 生成 Cbmcc-ipc 衍生皮肤有机体和人性化小鼠模型.(A) ipsc 衍生皮肤有机体 (iso) 生成过程示意图。(B) iso 移植过程进入小鼠体内。(C) 体外对 iso 的组织学分析。(D) 体内移植的 iso 的组织学分析。(E–H)氯霉素和 KRT14 的免疫细胞化学分析。MOCK 控制 (面板e), 移植 iso (面板f, loricrin), 小鼠皮肤 (阴性对照, g 组), 移植 ilo (面板 h, krt14)。刻度柱 = 200 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: ipsc 衍生角质形成细胞的形态.请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 2: ipscc 衍生成纤维细胞的形态.请点击这里查看此图的较大版本.
| 目标名称 | 方向 | 底漆序列 (5 '-3 ') | 大小 (基础对) | Refseq _ ID | |
| OCT4 | 向前 反向 |
ACCCCGGGCCGAA GGTGAATATCCCAATA |
190 | NM_203289.5 | |
| POX6 | 向前 反向 |
GTCCATTGTGGGAAA TAGCAGTGGGGGGAGAACAP |
1110 | NM_000280.4 | |
| SOX1 | 向前 反向 |
CAACACACAGAGACAGCAA GGTATTATOCGGGGC |
133 | NM_005986.2 | |
| Np63 | 向前 反向 |
GGAAACATCACACTC GGGGAGACCCGGGGGC |
294 | NM_001114982.1 | |
| KRT5 | 向前 反向 |
CCTTGGTAACAGCCAC GGGGGAGAGAGGGG |
198 | NM_000424.3 | |
| KRT14 | 向前 反向 |
GCACATCACAGAGGACC GGGATCCCGGGGATCT |
181 | NM_000526.4 | |
| CD44 | 向前 反向 |
AAGGGGGACACACACAACACC AGCTTTTCTCCCCACCA |
151 | NM_001202556.1 | |
| COL1A1 | 向前 反向 |
CCCCTGGAAGAGAGAGAG TCCACACACACGACCTG |
148 | NM_000088.3 | |
| COL1A2 | 向前 反向 |
GGAGAGAGGCAACC TGCCCCACACACAAGTCA |
77 | NM_000089.3 | |
| COL3A1 | 向前 反向 |
CGCCCCTATTAGCAGGCAAGG TTCTGAGGACAGGAGGGCA |
161 | NM_000090.3 | |
| 维门廷 | 向前 反向 |
GAGACATTGCCTGGAGC TCCAGCCTTTAGGT |
170 | NM_003380.5 | |
| GAPDH | 向前 反向 |
CCCCCCCCCCTTTGA CTTGTGTGTACCAATTCGT |
1110 | NM_002046.5 | |
表 1: 用于定量实时聚合酶链反应的引物序列。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
人类 Ipsc 被认为是个性化再生医学的新选择.患者派生的个性化 ipsc 反映了可用于疾病建模、药物筛选和自体移植18、19的患者特征。使用患者衍生的 ipsc 还可以克服原代细胞、缺乏足够的细胞数量和免疫反应5、17、19 的问题。然而, 由于时间、成本和劳动力限制, 生成个性化的 Ipsc 在经济上并不可行。Hla 纯合 cbmcc 衍生的 Ipsc 已成为一种新的可能性。Hla 纯合 ipsc 具有经济价值, 可应用于大量患者8、11、12、13.此外, 在细胞库储存过程中, Cbmc 的 HLA 分型也会发生, 从而便于用于研究和移植。据报道, 将 cbmc-ipsc 分化为心肌细胞、肝细胞和软骨细胞的方案有16、20、21、22、23。
表皮和皮肤层是皮肤的组成部分。表皮由角质形成细胞组成, 真皮由成纤维细胞组成。因此, 我们分别将 CBMC-iPSCs 分化为角质形成细胞和成纤维细胞。为了区分, 采用悬挂法15、24生成了均匀、控制良好、优化的 eb。IV 型胶原蛋白是基底膜的主要成分。对于角质形成细胞分化, Eb 被附着在 IV 型胶原蛋白包衣盘上。Cbmc-ipscc 衍生角质形成细胞具有类似鹅卵石的形态 (图 1d)。在 Ipsc-k 中表达了 Np63 和 KRT14 的角质形成细胞标记 (图 1e、f)。结果证实, RA 和 BMP4 诱导角化素蛋白标记的增强。此外, Cbmcc-ipsc 被分化为类似于原代角质形成细胞的角质形成细胞。
在成纤维细胞分化中, Eb 附着在基底膜基质涂层板上, 分化细胞连续传递到非涂层和 I 型胶原层涂层板上。诱导连续亚培养以确定成纤维细胞分化。成纤维细胞产生细胞外基质 (ECM), 具有迁移和粘附功能。成纤维细胞也会产生丰富的胶原蛋白成分25。在 Cbmcc-ipscc 衍生成纤维细胞中, 增加了成纤维细胞表面标记 CD44。胶原蛋白的表达在 Ipsc-f 中被放大 (图 2f)。在 Ipsc-f 中, 纤维连接蛋白和维门汀的表达增加 (图 2e)。
利用分化的角质形成细胞和成纤维细胞, 我们产生了 Cbmcc-ipscc 衍生的皮肤有机体 (图 3a)。我们使用了高钙培养基的气液界面培养, 诱导了 Cbmcc-ipc 衍生皮肤有机体的分层层。高浓度钙是角质形成细胞在体内和体外成熟所必需的, 而气液界面则被用来发育多层地层26、27、28.我们用这种方法来模拟真实的皮肤, 组织学分析显示, 皮肤是分层的 (图 3c)。为了确认伤口愈合能力, 我们使用捆绑敷料方法将 iSO 移植到小鼠皮肤中 (图 3d)。移植后, 有效地移植皮肤有机体, 充分治愈小鼠皮肤。KRT14 在分层鳞状上皮和非鳞状上皮的基底层表达。洛利克林是角膜的主要成分, 存在于终末分化和角化上皮细胞29,30。氯霉素的表皮分化标志物在移植皮肤中表达。KRT14 和氯西林的表达证实皮肤有机细胞完全成熟, 免疫组织化学染色显示分化 (图 3e)。
在这项研究中, 我们开发了一个方案, 将 Cbmcc-ipsc 分化为角质形成细胞和成纤维细胞, 这是人类皮肤的主要细胞类型。我们证实了 Cbmc-ipscc 衍生的角质形成细胞和成纤维细胞显示出与原代细胞系相似的表型。利用这些分化细胞, 我们产生了一个三维皮肤有机体, 并将其嫁接到 Nod/科学小鼠使用捆绑敷料的方法。这种原始技术最早是在1929年由布莱尔和布朗描述的, 通常用于皮肤移植31,32。这种方法防止了移植物的移动, 有利于对伤口有良好的粘附, 从而加速了组织愈合。组织学分析证实, 3D 皮肤有机体模仿人类皮肤表型, 成功分层和成熟超过2周。皮肤移植通常是使用角质形成细胞和成纤维细胞的单细胞由硅泡室33,34进行。该系统易于移植, 但我们需要更多的时间来观察移植后的移植效率。塑料或硅室起到屏障的作用, 对老鼠的皮肤。3D 皮肤有机体系统衍生的 Ipsc 不使用塑料或硅室。在这个系统中, 移植是有效的; 在这个系统中, 移植是有效的。然而, 很难阻止老鼠的自然愈合过程。因此, 小鼠的皮肤在移植后很长一段时间内覆盖了 iSO 的许多部分。这是这里介绍的方法的一部分, 必须改进。
总之, CBMC-iPSCs 是植皮的潜在细胞来源。使用这些协议, Cbmcc-ipscc 衍生角质形成细胞、成纤维细胞和3D 皮肤有机体可用于皮肤科、药物和美容筛查以及再生医学相关的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了大韩民国卫生、福利和家庭事务部韩国保健技术 &Amp; 开发项目的赠款 (H16C2177、H18C1178) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | - | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
References
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008).
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
