Vi præsenterer her, en protokol for at producere en oral vaccine kandidat mod Type 1 diabetes i en spiselig plante.
Plante molekylært landbrug er brugen af planter til at producere molekyler af interesse. I dette perspektiv, kan planter bruges både som bioreaktorer til produktion og efterfølgende rensning af det endelige produkt og for den direkte mundtlige levering af heterolog proteiner ved brug af spiselige plantearter. I dette arbejde præsenterer vi udviklingen af en kandidat oral vaccine mod Type 1 Diabetes (T1D) i spiselige plante systemer ved hjælp af dekonstrueret plante virus-baseret rekombinant DNA-teknologi, leveret med vakuum infiltration. Vores resultater viser, at en rødbede er en passende vært for forbigående udtryk for en menneskelig afledte autoantigen knyttet til T1D, anses for at være en lovende kandidat som en T1D vaccine. Bladene producerer autoantigen blev grundigt karakteriseret for deres modstand mod gastrisk fordøjelse, for tilstedeværelsen af resterende bakteriel afgift og for deres sekundære metaboliske profil, giver en oversigt over processen for den potentielle anvendelse af planter til direkte oral levering af en heterolog protein. Vores analyse viste næsten fuldstændig nedbrydning af den frysetørrede kandidat oral vaccine efter en simuleret gastrisk fordøjelse, tyder på, at en indkapsling strategi til fremstilling af plantebaserede GAD vaccine er påkrævet.
Siden anlægget Molekylærbiologi revolution i 1980 ‘ erne, kan plante-baserede systemer til produktion af biopharmaceuticals betragtes som et alternativ til traditionelle systemer baseret på mikrobiel og mammale celler1. Planter viser flere fordele frem for traditionelle platforme, med skalerbarhed, omkostningseffektivitet og sikkerhed at blive den mest relevante2. Den rekombinante produkt kan renset fra transformerede plantevæv og derefter administreres, enten parenteralt eller mundtligt og i øvrigt transformeret spiselige plante kan bruges direkte til oral levering. Den mundtlige rute fremmer samtidig slimhinde og systemisk immunitet, og det fjerner behovet for nåle og specialiseret medicinsk personale. Derudover eliminerer oral levering den komplekse downstream behandling, som normalt tegner sig for 80% af de samlede produktionsomkostninger af en rekombinant protein3. Alle disse fordele kan oversættes til besparelser i produktion, levering og arbejdskraft at reducere omkostningerne i forbindelse med hver dosis, gør stoffet overkommelig for de fleste af verdens befolkning.
Flere strategier, både for stabil transformation og forbigående udtryk, var udviklet til fremstilling af rekombinante proteiner i planter. Blandt dem giver en højtydende dekonstrueret plante virus-baseret udtryk system (f.eks. magnICON) overlegen ydeevne fører høje udbytter af rekombinante proteiner over relativt korte tidsfrister4. Mange eksempler på forbigående udtryk ved hjælp af planten virus-baseret udtryk system i Nicotiana benthamiana planter er rapporteret, at være guldstandarden produktion vært. Denne model plante betragtes ikke som en spiselige arter på grund af alkaloider og andre toksiske metabolitter, der er akkumuleret i sine blade.
I dette arbejde, beskriver vi sammenligning mellem to spiselige plante systemer, rødbede (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for at give udtryk for to kandidat 65 kDa isoform af glutaminsyre decarboxylase (GAD65), udført af planten virus-baseret vektorer5. GAD65 er et større autoantigen forbundet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er i øjeblikket under efterforskning i humane kliniske forsøg til at forhindre eller forsinke T1D ved at inducere tolerance6. Produktionen af GAD65 i planter er blevet grundigt undersøgt i modellen plantearter som Nicotiana tabacum og N. benthamiana4,5,6,7. Her, beskriver vi brugen af spiselige plantearter til produktion af molekyle i væv, der kan være beregnet til en direkte oral levering. Fra et teknisk synspunkt, vi studeret og valgt system for planten agroinfiltration og spiselige plante platform for GAD65 produktion ved at evaluere forskellige parametre: udtrykket rekombinante protein niveauer, de resterende mikrobielle afgift i anlægget væv beregnet til oral levering, modstanden i GAD65 til gastrisk fordøjelsen og bioækvivalens af de transformerede planter med wild-type.
I denne undersøgelse viste vi foreløbig analyse for udformningen af en kandidat oral vaccine for autoimmune diabetes. Target proteinet for dette eksperiment var en muteret form for den menneskelige 65 kDa glutamat Decarboxylase, hvilke produktions- og funktionalitet er let påviselige og målbare12. Dens udtryk i forskellige spiselige plantevæv blev formidlet af vektorer5, der mægle et højt niveau af rekombinante protein produktion i en meget kort tidsramme. Udvælgels…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det fællesprojekt “Brug af planter til produktion af en autoimmun diabetes spiselige vaccine (eDIVA)” (projekt-ID: 891854) finansieret af Universitet Verona inden for rammerne af indkaldelsen 2014.
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
C18 Column | Grace | – | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
C18 Guard Column | Grace | – | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
HILIC Column | Grace | – | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
HILIC Guard Column | Grace | – | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
HPLC Autosampler | Beckman Coulter | – | System Gold 508 Autosampler |
HPLC System | Beckman Coulter | – | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
Loading Buffer | |||
Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
Mass Spectometer | Bruker Daltonics | – | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
Methanol | Sigma | 32213 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
Milk-blocking solution | Ristora | – | 3 % in PBS |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
Syringe | Terumo | – | |
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |