Summary

Forbigående udtryk i rødbede biofarmaceutiske kandidat vaccine til Type 1 Diabetes

Published: March 19, 2019
doi:

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at producere en oral vaccine kandidat mod Type 1 diabetes i en spiselig plante.

Abstract

Plante molekylært landbrug er brugen af planter til at producere molekyler af interesse. I dette perspektiv, kan planter bruges både som bioreaktorer til produktion og efterfølgende rensning af det endelige produkt og for den direkte mundtlige levering af heterolog proteiner ved brug af spiselige plantearter. I dette arbejde præsenterer vi udviklingen af en kandidat oral vaccine mod Type 1 Diabetes (T1D) i spiselige plante systemer ved hjælp af dekonstrueret plante virus-baseret rekombinant DNA-teknologi, leveret med vakuum infiltration. Vores resultater viser, at en rødbede er en passende vært for forbigående udtryk for en menneskelig afledte autoantigen knyttet til T1D, anses for at være en lovende kandidat som en T1D vaccine. Bladene producerer autoantigen blev grundigt karakteriseret for deres modstand mod gastrisk fordøjelse, for tilstedeværelsen af resterende bakteriel afgift og for deres sekundære metaboliske profil, giver en oversigt over processen for den potentielle anvendelse af planter til direkte oral levering af en heterolog protein. Vores analyse viste næsten fuldstændig nedbrydning af den frysetørrede kandidat oral vaccine efter en simuleret gastrisk fordøjelse, tyder på, at en indkapsling strategi til fremstilling af plantebaserede GAD vaccine er påkrævet.

Introduction

Siden anlægget Molekylærbiologi revolution i 1980 ‘ erne, kan plante-baserede systemer til produktion af biopharmaceuticals betragtes som et alternativ til traditionelle systemer baseret på mikrobiel og mammale celler1. Planter viser flere fordele frem for traditionelle platforme, med skalerbarhed, omkostningseffektivitet og sikkerhed at blive den mest relevante2. Den rekombinante produkt kan renset fra transformerede plantevæv og derefter administreres, enten parenteralt eller mundtligt og i øvrigt transformeret spiselige plante kan bruges direkte til oral levering. Den mundtlige rute fremmer samtidig slimhinde og systemisk immunitet, og det fjerner behovet for nåle og specialiseret medicinsk personale. Derudover eliminerer oral levering den komplekse downstream behandling, som normalt tegner sig for 80% af de samlede produktionsomkostninger af en rekombinant protein3. Alle disse fordele kan oversættes til besparelser i produktion, levering og arbejdskraft at reducere omkostningerne i forbindelse med hver dosis, gør stoffet overkommelig for de fleste af verdens befolkning.

Flere strategier, både for stabil transformation og forbigående udtryk, var udviklet til fremstilling af rekombinante proteiner i planter. Blandt dem giver en højtydende dekonstrueret plante virus-baseret udtryk system (f.eks. magnICON) overlegen ydeevne fører høje udbytter af rekombinante proteiner over relativt korte tidsfrister4. Mange eksempler på forbigående udtryk ved hjælp af planten virus-baseret udtryk system i Nicotiana benthamiana planter er rapporteret, at være guldstandarden produktion vært. Denne model plante betragtes ikke som en spiselige arter på grund af alkaloider og andre toksiske metabolitter, der er akkumuleret i sine blade.

I dette arbejde, beskriver vi sammenligning mellem to spiselige plante systemer, rødbede (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for at give udtryk for to kandidat 65 kDa isoform af glutaminsyre decarboxylase (GAD65), udført af planten virus-baseret vektorer5. GAD65 er et større autoantigen forbundet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er i øjeblikket under efterforskning i humane kliniske forsøg til at forhindre eller forsinke T1D ved at inducere tolerance6. Produktionen af GAD65 i planter er blevet grundigt undersøgt i modellen plantearter som Nicotiana tabacum og N. benthamiana4,5,6,7. Her, beskriver vi brugen af spiselige plantearter til produktion af molekyle i væv, der kan være beregnet til en direkte oral levering. Fra et teknisk synspunkt, vi studeret og valgt system for planten agroinfiltration og spiselige plante platform for GAD65 produktion ved at evaluere forskellige parametre: udtrykket rekombinante protein niveauer, de resterende mikrobielle afgift i anlægget væv beregnet til oral levering, modstanden i GAD65 til gastrisk fordøjelsen og bioækvivalens af de transformerede planter med wild-type.

Protocol

1. røde sukkerroer og spinat dyrkning Vokse rødbede (B. vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (S. oleracea cv Industria) planter i et vækst kammer, med 150 µE af lysintensitet, 65% relativ luftfugtighed, 12 h lys/mørke cyklus på 23/21 ° C, hhv. Efter frø spiring, befrugte planter to gange om ugen med en 1 g/L opløsning af et kommercielt tilgængelige gødning (Tabel af materialer). Brug fem uger gamle spinat og seks uger gamle rødbede planter til agroinfiltra…

Representative Results

I dette arbejde præsenteres for udviklingen af en oral vaccine i spiselige plantevæv arbejdsgang. Fokus for dette arbejde er udtryk for et mål protein i en spiselig vært plantearter og karakterisering af den potentielle oral vaccine. Det første trin involveret evaluering af egnetheden af plante virus-baseret udtrykket teknologi til at producere rekombinante proteiner i spiselige plante systemer. Til dette formål, vi først…

Discussion

I denne undersøgelse viste vi foreløbig analyse for udformningen af en kandidat oral vaccine for autoimmune diabetes. Target proteinet for dette eksperiment var en muteret form for den menneskelige 65 kDa glutamat Decarboxylase, hvilke produktions- og funktionalitet er let påviselige og målbare12. Dens udtryk i forskellige spiselige plantevæv blev formidlet af vektorer5, der mægle et højt niveau af rekombinante protein produktion i en meget kort tidsramme. Udvælgels…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af det fællesprojekt “Brug af planter til produktion af en autoimmun diabetes spiselige vaccine (eDIVA)” (projekt-ID: 891854) finansieret af Universitet Verona inden for rammerne af indkaldelsen 2014.

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    – Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    – Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    – Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    – Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    – System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    – System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   – Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    – 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    –
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

References

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?. Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. . Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015)
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, (2017).

Play Video

Cite This Article
Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

View Video