Summary
Burada, bir sözlü aşı adayı karşı tip 1 diyabet bir yenilebilir bitki üretmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Bitki moleküler tarım bitkiler ilgi molekülleri üretmek için kullanılır. Bu açıdan, bitkiler hem Biyoreaktörler olarak üretim ve nihai ürünün sonraki arıtma ve kapaklı proteinlerin doğrudan oral teslimat için Yenilebilir bitki türü kullanılırken kullanılabilir. Bu çalışmada, Yenilebilir bitki sistemleri ile vakum infiltrasyon teslim deconstructed bitki virüs tabanlı rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak tip 1 diyabet (T1D) karşı bir aday sözlü aşı geliştirilmesi mevcut. Sonuçlarımız kırmızı pancar T1D aşı olarak umut verici bir aday olarak kabul T1D, ilişkili bir insan türetilmiş autoantigen geçici bir ifade için uygun bir ev sahibi olduğunu gösteriyor. Autoantigen üreten yaprakları iyice mide sindirim için onların direnci, bakteriyel şarj kalıntısı varlığı ve ikincil metabolik profilleri, işlem üretim potansiyelini kullanmak için genel bir bakış vermek için karakterize bitkilerin kapaklı bir protein doğrudan oral teslimat için. Bizim analiz neredeyse tam bir kapsülleme strateji bitki kaynaklı GAD aşı üretiminde gerekli olduğunu düşündüren bir simüle mide sindirim takip dondurularak aday sözlü aşı düşüşü gösterdi.
Introduction
Bitki moleküler biyoloji devriminden bu yana 1980'li yıllarda, bitki tabanlı sistemler Biyofarmasötikler üretimi için alternatif mikrobiyal ve memeli hücreleri1üzerinde esaslı geleneksel sistem olarak kabul edilebilir. Bitkiler geleneksel platformlar, çeşitli avantajlar ölçeklenebilirlik, maliyet-etkililik ve en alakalı2güvenlik ile görüntüler. Rekombinant ürün dönüştürülmüş bitki dokudan saflaştırılmış ve sonra yönetilen, ya parenterally ya da sözlü olarak ve ayrıca, dönüştürülmüş Yenilebilir bitki doğrudan oral teslimat için kullanılabilir. Sözlü rota aynı anda Mukozal ve sistemik bağışıklık teşvik ve iğneler ve uzman sağlık personeli için gereksinimini ortadan kaldırır. Ayrıca, oral teslimat normalde rekombinant protein3Toplam üretim maliyetinin % 80'i hesapları karmaşık aşağı akım işleme ortadan kaldırır. Bütün bu avantajları tasarruf üretim, malzeme ve ilaç dünya nüfusunun çoğu için uygun hale her doz maliyetlerini azaltarak emek doğru tercüme edilebilir.
Çeşitli stratejiler, hem istikrarlı dönüşümü ve geçici ifade, bitkilerde rekombinant proteinlerin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar arasında yüksek verimli deconstructed bitki virüs temel ifade sistemi (örneğin, magnICON) rekombinant proteinlerin yüksek verim nispeten kısa zaman çizelgelerine4üzerinde önde gelen üstün performans sağlar. Geçici ifade Nicotiana benthamiana bitkilerde bitki virüs temel ifade sistemi kullanarak pek çok örnek, altın standart üretim ev sahibi olmak raporlanır. Ancak, bu model bitki alkoloidler ve yaprakları içinde birikmiş olan diğer toksik metabolitleri nedeniyle yenilebilir bir tür olarak kabul edilmez.
Bu çalışmada, biz iki Yenilebilir bitki sistemi, kırmızı pancar arasında karşılaştırma tarif (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (Spinacea oleracea cv Industria), 65 kDa izoformu glutamik asit iki aday türde bir ifade için bitki virüs tabanlı tarafından yürütülen dekarboksilaz (GAD65),5Vektörler. GAD65 tip 1 diyabet (T1D) ilişkili bir büyük autoantigen ve bu şu anda önlemek veya T1D tolerans6inducing tarafından gecikme insan klinik çalışmalarda soruşturma altında. GAD65 üretim tesislerinde kapsamlı modeli bitki türleri içinde tütün ve i. benthamiana4,5,6,7çalışılmıştır. Burada, biz doğrudan sözlü teslim için demek dokularda molekül üretimi için Yenilebilir bitki türlerinin nasıl kullanılacağını açıklar. --Dan teknik görüş, okudu ve bitki agroinfiltration için sistemi ve Yenilebilir bitki platformu GAD65 üretim için farklı parametreler değerlendirilerek seçilen: rekombinant protein ifade seviyeleri, bitki mikrobiyal şarj kalıntısı doku'sözlü dır, GAD65 mide sindirim için direnç ve vahşi türü ile dönüştürülmüş bitkilerin bioequivalence demek istedim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kırmızı pancar, ıspanak ekimi
- Kırmızı pancar büyümek (B. vulgaris cv Moulin Rouge) ve ıspanak (S. oleracea cv Industria) 150 µE ışık şiddeti, %65 bağıl nem, 12 h açık/koyu döngüsü 23/21 ° C, sırasıyla kullanarak bitkilerde büyüme odası.
- Tohum çimlenme sonra haftada bir 1 g/L çözüm ticari gübre (Malzemeler tablo) ile bitkileri döller. Beş haftalık ıspanak ve altı haftalık kırmızı pancar bitkiler için agroinfiltration kullanın.
2. geçici ifade deconstructed bitki virüs tabanlı teknoloji aracılığıyla
- Bitki ifade vektörel çizimler inşaatı
- -5' modülü (pICH20111), yukarıda açıklanan1,2,7olarak hazırlanan 3' modülleri (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut ve pICH7410.eGFP) ve integrase modülü (pICH14011) - vektörel çizimler tanıtmak Agrobacterium tumefaciens GV3101 zorlanma içinde standart teknikler kullanma. 28 ° C'de 2 gün boyunca 50 μg/mL Rifampisin ve uygun vektör özgü antibiyotik (50 μg/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011 ve pICH7410.eGFP), pICH31070 için 50 μg/mL sefaloridin içeren LB ortamdaki büyümek
- Kolonilerin koloni her vektör için aşağıdaki belirli primerler kullanılarak PCR tarafından ekran: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' ve 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' modüller pICH31070.GAD65mut ve pICH31070.∆87G65mut, bir tavlama sıcaklığı 55 ° c ile ve bir uzama süresi 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' ve 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' için bir tavlama sıcaklığı 53 ° c ve bir uzama süresi 30 ile üçüncü 3' modülü pICH7410.eGFP, s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' ve 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' bir tavlama sıcaklığı 53 ° c ve bir uzama süresi 20 s ve 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3 ile 5' modül için ' ve 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' integrase modülü ile 57 ° C tavlama sıcaklığını ve bir uzama süresi 45 s.
- Toplam hacmi 20 μL aşağıdaki belirli tepki döngüsü kullanılarak PCR reaksiyonu gerçekleştirmek: 95 ° C'de 5 dk ilk denatürasyon 30 35 döngüleri s 95 ° c, 30 s tavlama sıcaklığı ve uzama adım 72 ° c (tavlama sıcaklığı ve uzama süresi bir Re her astar çift için belirli) ve son uzama adım 7 dk 72 ° C'de
- Şırınga agroinfiltration
- Üç A. tumefaciens transformants 50 ml LB orta içeren 50 μg/mL Rifampisin ve aşağıdaki uygun vektör özgü antibiyotik aşılamak: pICH20111 ile dönüştürülmüş A. tumefaciens için 50 μg/mL carbenicillin pICH14011 veya pICH7410.eGFP veya pICH31070 ile dönüştürülmüş A. tumefaciens için 50 μg/mL sefaloridin. Gecede 28 ° C'de sallayarak büyümek
- Santrifüjü 4500 x g 20 dk için de tarafından gece bakteriyel kültürlerde cips ve infiltrasyon arabellek 10 mM 4-morpholineethanesulfonic asit (MES; pH 5.5) içeren 100 mL (veya ilk bakteriyel kültürünün iki birim) içinde resuspend ve 10 mM MgSO4OD dikkate almadan,600. Süspansiyonlar, oda sıcaklığında (RT) 3 h için kuluçkaya.
- Bakteriyel süspansiyonlar bir üç modül, GAD65mut, ∆87GAD65mut veya eGFP 3' modülü, 5' modülü ile ve integrase modülü içeren eşit miktarda karıştırın. Süspansiyon karışımı kırmızı pancar, ıspanak yaprakları şırınga infiltrasyonu için kullanın.
- 5 mL süspansiyon bir şırınga iğne olmadan yerleştirin. Yaprağın alt karşı şırınga ıspanak ve kırmızı pancar bitkiler için bastırın ve bu arada diğer taraftaki yaprak yumuşak basıncın uygulayın.
- Her bitki için apex başlayarak ilk üç tamamen genişletilmiş yaprakları sızmak. Yaprak kök agroinfiltrated yapraklarda bir kağıt etiketle etiketleyin. Bitkiler büyüme odası standart koşullar altında dönmek.
Not: Sağlık ve güvenlik nedeniyle, infiltrasyon işlemi sırasında göz koruması ve eldiven giymek. - 4 14 gün sonrası enfeksiyon (dpi) ve bunları sıvı azot içinde dondurmak için toplamak agroinfiltrated bırakır. Mağaza bitki doku-80 ° C'de
- Vakum agroinfiltration
- Ayrı ayrı üç A. tumefaciens transformants 50 ml 50 μg/mL Rifampisin ve uygun vektör özel içeren LB orta gecede 28 ° C'de sallayarak antibiyotik büyümek
- Santrifüjü 4500 x g 20 dakika süreyle, pelet gecede bakteri kültürleri infiltrasyon arabelleği 0.35 bir OD600 1 L Pelet Resuspend ve RT, süspansiyonlar 3 h için kuluçkaya.
- % 0,01 v/v deterjan (polysorbate 20) her süspansiyon için ekleyin. Bakteriyel süspansiyonlar bir üç modül, GAD65mut, ∆87GAD65mut veya eGFP 3' modülü, 5' modülü ile ve integrase modülü içeren eşit miktarda karıştırın.
- Bir bitki Ekle (altı haftalık kırmızı pancar bitki, bkz: 1) tutucu. Sahibi ters çevir ve infiltrasyon banyo infiltrasyon süspansiyon yapraklarda daldırın için (2 L) içeren bir ölçek üzerine yerleştirin.
Not: Bütün yaprakları tamamen bakteriyel süspansiyon daldırma olun. Gerekirse ilave infiltrasyon süspansiyon ilavesi ile düzeyini yükseltmek. - Batık bitki infiltrasyon banyo infiltrasyon odasına aktarmak ve kapatın. Vakum pompası açmak ve infiltrasyon odası vakum emme valfi açın.
- Bir kez 90 mbar basınç infiltrasyon odasında azalttı, vakum 3 dk. yayın için 45 için vakum tutmak s. İnfiltrasyon odası atmosferik basınç için döndü sonra odası açmak ve bakteriyel banyodan infiltre bitki kaldırın.
- Bitkiler büyüme odası standart koşullar altında dönmek.
- Agroinfiltrated yaprak maksimum ifade dpi'de rekombinant protein bağlı olarak toplamak ve onları sıvı azot içinde dondurma. Mağaza bitki doku-80 ° C'de
3. rekombinant protein ifade analizi
- Toplam çözünür protein (TSP) çıkarma
- Şırınga eziyet veya vakum adım 2.2.6 ve 2.3.8, sıvı azot harç ve havaneli kullanarak ince toz için toplanan, kırmızı pancar, ıspanak yaprakları sızmış. Toz 15 mL plastik tüpler içine aktarın ve malzeme-80 ° C'de depolayın
- Ayıklama arabelleği (50 mM sodyum fosfat pH 8.0, 20 mM sodyum metabisulphite) 900 µL 300 mg yaprak tozu ekleyin.
Not: Bitki doku ağırlığı (mg) arabellek birimine (µL) arasında seçili oranı 1: 3'tür. - 1 dk. için vortexing tarafından karışımı homojenize sonra 30.000 x g 4 ° C'de 40 min için de santrifüj kapasitesi
- Süpernatant temiz bir tüp toplamak ve-80 ° C'de saklayın
- Bitki eGFP görselleştirme ve miktar
- Yapraklarda üç teknik çoğaltır, 96-şey tabağa ifade eGFP elde edilen her tatlı KAŞIĞI özü 100 µL yükleyin.
- Bir floresan okuyucu olarak 96-şey plaka koymak ve ölçüm başlar. EGFP floresan algılama için gerekli ayarla 485/535 nm filtre kullanın.
- Mutlak miktar için aynı plaka bir kalibrasyon eğrisi yükleme farklı miktarlar hazırlamak (62.5, 125, 500, 750 ve 1000 ng), saf bir eGFP.
- Bicinchoninic asit (BCA) tahlil için çay KAŞIĞI miktar
- 50 parça (Tablo reçetesi) Reaktif A Reaktif B (Tablo malzemeler), 1 kısım ile karıştırın. Taze BCA çalışma çözüm yeterli hacim denetlesinler için örnekleri ve Kalibrasyon standartları için hazır olun.
Not: 1,9 mL BCA çalışma çözüm her örnek için gerekli birimdir. 9 standartları (boş bir de dahil olmak üzere) ile standart prosedür, BCA çalışma çözüm 17,1 mL gereklidir. - Her standart (boş bir de dahil olmak üzere) ve çay KAŞIĞI özler etiketli bir tüp içine 0.1 mL pipet.
Not: Kalibrasyon standartları olarak sığır serum albümin yeni bir set (BSA) standartları tercihen aynı Dilüent örnekleri, su gibi olarak kullanarak 10-1000 μg/mL aralığında hazırlamak. Boş kalibrasyon standart ve numune hazırlama için kullanılan seyreltici 0.1 mL oluşur. - 1,9 mL BCA çalışma çözeltisi ekleyip iyice karıştırın. Tüplerin kapak ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- Tüpler dik ölçmek 562 Absorbans serin nm 10 dakika içinde tüm örnekleri.
Not: RT bile, renk geliştirme devam ediyor. Tüm tüpler Absorbans ölçümleri 10 dk içinde yapılırsa önemli hata tanıtılacaktır. - 562 nm Absorbans değeri boş okuma standartları ve çay KAŞIĞI özleri gelen çıkarma.
- Her standart onun konsantrasyon üzerinde okuma arsa boş düzeltilmiş 562 nm. Her tatlı KAŞIĞI özü protein konsantrasyonu belirlemek.
- 50 parça (Tablo reçetesi) Reaktif A Reaktif B (Tablo malzemeler), 1 kısım ile karıştırın. Taze BCA çalışma çözüm yeterli hacim denetlesinler için örnekleri ve Kalibrasyon standartları için hazır olun.
- Coomassie jel Gecchele vd.8daha önce açıklandığı gibi boyama gerçekleştirmek.
- Western blot analizi
- Daha önce Gecchele vd.8' de açıklandığı gibi Batı leke çözümlemesi gerçekleştirin.
- Proteinler elektroforetik Boşanmadan sonra onları standart yöntemlerle nitroselüloz membran aktarın. Engelleme çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) pH %7,4 4 süt karıştırarak hazırlayın. Membran ile 10 mL 1 h için RT, çözüm engelleme engellemek.
- Tavşan birincil antikor 1:10,000 anti-GAD65/67 ve anti-LHCB2 ve 1:20,000 anti-eGFP 5 ml %0,1 deterjan ile engelleme çözüm için hazır olun. Gecede 4 ° C'de veya sabit ajitasyon ile RT 4 h için hazırlanan birincil antikor çözümleri ile membran kuluçkaya.
- Birincil antikor atın ve 5 min için 3 kez membran % 0,1 deterjan içeren engelleme çözüm ile yıkayın.
- Hazırlamak horseradish peroksidaz (HRP)-% 0.1 deterjan çözüm engelleme 1:10,000, eşlenik Anti-tavşan antikor. Membran ile sürekli ajitasyon RT, 1,5 saat için kuluçkaya.
- İkincil antikor atın ve membran PBS-T (% 0,1 deterjan ile desteklenmiş PBS) ile her 5 min için 5 kere yıkayın.
- Membran üreticinin yönergelerini izleyerek bir piyasada bulunan luminol Çözümle kuluçkaya. Kemiluminesan görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılamak.
4. bitki malzeme işleme
- Hasat vakum agroinfiltrated ∆87GAD65mut ifade kırmızı pancar ifade tepe (11 dpi) bırakır ve onları sıvı azot içinde dondurma.
- 72 h-50 ° C ve 0,04 mbar için dondurulmuş yaprakları lyophilize. Onları-80 ° C'de depolayın
- Yapraklarını ince toz için eziyet ve nem dışlamak için silis jeli ile kapalı bir kapta RT saklayın.
5. mide sindirim simülasyon ve hücre bütünlük analizi
- Mide sindirim simülasyon
- Öğütülmüş kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg tartmak ve PBS (pH 7,4) 6 mL resuspend.
- Örnek pH 2 6 M HCl ile ayarlayın.
- 4 mg/mL pepsin domuz Gastrik mukoza 10 mm HCl bir son pepsin konsantrasyonu 1 mg/mL veya 1:20 toplam çözünen proteinler için bir oranı elde etmek için ekleyin. 120 dk 37 ° C'de örnek sallamak.
- Örnekleri ile pepsin devre dışı bırakabilirsiniz için 1 M NaOH pH 8 için ayarlayın.
- 750 µL aliquots 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de her örneğinin santrifüj kapasitesi Ayrı ayrı süpernatant toplamak ve Pelet arabellek yükleme bir süpernatant hacmindeki resuspend (1.5 M Tris HCl, pH 6.8, % 3 SDS, % 15 gliserol ve % 4 2-mercaptoethanol).
Not: Sağlık ve güvenlik nedeniyle, eldiven ve numune hazırlama için duman başlık altında çalışmak. - Süpernatant ve resuspended Pelet western blot analizi8tarafından analiz.
- Hücre bütünlük analizi
- Öğütülmüş kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg iki örnek hazırlamak ve PBS (pH 7,4) 6 ml her ikisi de resuspend.
- Bir örnek yalnızca için 2 ile 6 M HCl. sallamak her iki örnekleri için 120 dk 37 ° C'de pH değeri ayarlayın.
- 750 µL aliquots 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de her örneğinin santrifüj kapasitesi Ayrı ayrı süpernatant toplamak ve Pelet arabellek yükleme bir süpernatant hacmindeki resuspend.
- Süpernatant ve resuspended pelet tarafından western blot analizi.
6. Bioburden tahlil
- Kurutulmuş kırmızı pancar yaprakları 100 mg tartın. 8 mL steril PBS (pH 7,4) ve 1 dk. için girdap toz resuspend.
- Antibiyotik veya (i) 50 µg/mL Rifampisin, (ii) 50 µg/mL, Rifampisin ve carbenicillin her, (iii) 50 µg/mL her sefaloridin ve Rifampisin veya (iv) 50 µg/mL her Rifampisin, carbenicillin ve sefaloridin içeren olmadan LB orta hazırlayın.
- Plaka her kurutulmuş yaprak homogenate birinde 5 seçmeli LB medya 1 mL.
- Tüm plakaları 28 ° C'de 3 gün kuluçkaya
- Her plaka üzerinde yetiştirilen Agrobacterium koloniler sayılır.
- Hesaplamak ve bakteriyel şarj kalıntısı koloni oluşturan birimler (CFU) sayı olarak kurutulmuş yaprak homogenate (CFU/mL) mL tanımlayın.
7. metaboliti çıkarma
- Birincil metaboliti çıkarma
- -80 ° C depolanan 30 mg tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 2 mL plastik tüp içinde.
- Soğuk 70/30 (v/v) metanol/kloroform ve girdap 750 µL 2 h için-20 ° C'de 30 s. Incubate ekleyin.
Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir. - Soğuk su ve 10 dk. toplamak için 17,900 x g 4 ° C'de, santrifüj ve transfer 600 µL üst hydroalcoholic faz yeni 2 mL tüp içine ekleyin. Alt chloroformic faz ve Interphase atmak.
- Örnekleri çözücüler buharlaşır için bir vakum yoğunlaştırıcı 3 h için koymak.
- Adım 7.1.4 300 µL 50/50 (v/v) Asetonitril/su elde Pelet dağıtılması ve örnekleri 3 dk için solüsyon içeren temizleyicide.
- Çözümler 0,2 mikron membran filtreleri ile geçmek ve bir şeffaf sabit 300 µL Ekle cam tüpler içine koydu.
- İkincil metaboliti çıkarma
- 300 mg-80 ° c depolanan tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 15 mL plastik tüp içinde.
- 3 mL metanol, 30 için girdap ekleyin s ve 40 kHz 15dk için solüsyon içeren temizleyicide.
Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir. - 4500 x g 10 dk 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi ve supernatants yeni 15 mL tüpler içine aktarın.
- Seyreltik 100 µL 1:3 (v/v) su ile ayıklamak ve çözüm 0,2 mikron membran filtreden geçmek.
- Çözüm bir saydam sabit 300 µL Ekle cam tüp koymak.
- Polar lipit çıkarma
- -80 ° c depolanan 200 mg tartmak, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-ifade vakum kırmızı pancar yaprağı tozu 15 mL plastik tüp içinde.
- Su 200 µL ve sonra 2 mL metanol ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kalmasını sağlayın.
Not: Tüm maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir. - Girdap 30 s ve 40 kHz 15dk için solüsyon içeren temizleyicide.
- 4500 x g 25 dk. toplamak için 4 ° C'de, örnekleri ve transfer kloroform Faz 2 mL tüpler içine santrifüj kapasitesi. Üst hydroalcoholic faz ve Interphase atmak.
- Örnekleri çözücü buharlaşır için bir vakum yoğunlaştırıcı 3 h için koymak.
- Adım 7.3.5 600 µL metanol ile elde edilen Pelet geçiyoruz.
- Seyreltik 100 µL 1:5 (v/v) metanol ile ayıklamak ve çözüm 0,2 mikron membran filtreden geçmek.
- Çözüm bir saydam sabit 300 µL Ekle cam tüp koymak.
8. sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi analiz ve veri işleme
- LC-MS sistemi tedarikçi tarafından tavsiye edilen şekilde ayarlarsınız.
Not: Bir sütunla C18 Muhafız (75 x 2.1 mm, parçacık boyutu 5 µm) önünde bir C18 sütun (150 x 2.1 mm, parçacık boyutu 3 µm) Sekonder metabolitler ve Kutup lipidler analizi için donatılmış HPLC ile birleştiğinde bir Otomatik Örnekleyici LC bölüm oluşur , oysa bir sütunla HILIC görevlisi (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) önünde HILIC bir sütun (150 x 2.1 mm, parçacık Boyut 2,7 µm). MS electrospray iyonlaşma (ESI) ya da bir atmosfer basıncı kimyasal iyonizasyon (APCI) kaynakları ile sağlanan bir iyon kapanı Kütle Spektrometre var. - Uygun çözücüler HPLC degradeler için hazırlayın. Birincil metaboliti analizi için 20 mM amonyum formiat çözelti A olarak kullanın; % 95 Asetonitril, %5 su artı 10 mM amonyum formiat çözücü b olarak İkincil metaboliti analiz için su + %0,05 formik asit (A) ve Asetonitril + %0,05 formik asit (B) kullanın. Polar lipit analiz için su ile %0,05 formik asit (A) ve % 100 Asetonitril (B) kullanın.
Not: Maddeleri ve katkı maddeleri LC-MS sınıf olması gerekir. - Metaboliti elüsyon için Tablo 1 ' de rapor degradeler kullanın. Akış oranı, 0.2 mL/dak enjekte 10 µL Sekonder metabolitler ve Kutup lipidler, her örneğinin ise küme için birincil metabolitleri 5 µL enjekte et.
- Kalite kontrol (QC) örnek eşit deneysel her koşul temsilcisi karışımı için farklı örnekleri bölümlerini karıştırarak hazırlayın. QC örnek enstrüman etkinliğini izlemek için deneme sırasında analiz. Özellikle, bir QC örnek analiz her 10 örnek toplu iş sonra ekleyin.
- Enstrüman tahrik etkilerinden korunmak için örnekleri rastgele.
- 9 analizleri sonra temizleme yöntemi ve boş bir analiz bir sütun eklemek hemen sonra.
Not: en güçlü çözücü yüksek bir yüzdesini, bir isocratic elüsyon ile iki çözücüler arasında yavaş bir degrade uygulayın. Boş bir saf metanol bir enjeksiyon oluşur: tutma zaman tekrarlanabilirlik aşağıdaki analizi geliştirmek için su (50/50, v/v). - Tablo 2' de listelenen parametreleri kullanarak diğer pozitif ve negatif iyonlaşma modlarında kitle spectra almaya gerecini ayarlama.
Not: Diğer parametreler belirli platform üzerinde bağlıdır. - Sonraki veri işleme Dal Santo vd.9' da açıklandığı gibi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, Yenilebilir bitki dokularında sözlü bir aşı geliştirilmesi için iş akışı gösterilmektedir. Bu eser bir yenilebilir ana bitki türü bir hedef proteinin ifade ve potansiyel sözlü aşı karakterizasyonu odaklanmıştır.
İlk adım rekombinant proteinler Yenilebilir bitki sistemlerinde üretmek için bitki virüs temel ifade teknoloji uygunluğunun değerlendirilmesi söz konusu. Bu amaç için ilk eGFP bir modeli protein kullandığımız ve biz iki yenilebilir yapraklı bitki sistemi ifade: kırmızı pancar, ıspanak. Bitkiler el ile A. tumefaciens eGFP rekombinant ifade vektörel çizimler taşıyan süspansiyonlar ile agroinfiltrated vardı. Floresan protein ifade western blot analizi (şekil 1A, B, D, E) tarafından görüntülenir ve UV ışığı altında sayılabilir. En fazla eGFP düzeyleri (113.4 ± 0,3 µg/g FLW) 11 dpi ( ölçüldü ıspanak, daha yüksek bir eGFP ifade 544.9 ± 10,9 µg/g 9 dpi (şekil 1 c), (FLW) taze yaprak ağırlığının ulaşan, kırmızı pancar sistemi karakterize gösterdi sonuçları Rakam 1F). Bu nedenlerden dolayı kırmızı pancar ifade ana tüm sonraki deneyler için seçildi.
Chen ve ark.10göre eGFP geçici ifade infiltrasyon, büyük ölçekli aşı üretimi için daha uygun bir vakum yöntemi tarafından test edildi. Gecede A. tumefaciens kültür, 10-1 10-3ve deterjan farklı konsantrasyonlarda kadar farklı dilutions (0.005-%0,05) eGFP birikimine düzeyi maksimum ifade dpi (9 dpi) karşılaştırarak test ettik. Sonuçlar daha yüksek bakteri titreleri büyük eGFP verimleri üretilen bulundu (10-1 ~ 0,35). Ancak, hiçbir önemli farklılıklar farklı deterjan konsantrasyonları (veri gösterilmez) kullanarak bulundu.
O zaman, bitkiler bir A. tumefaciens süspansiyon 0,35 OD600 ve deterjan yüzde 0,01 ile infiltre vakum vardı. Bir kez ifade platformu ve dağıtım sistemi kuruldu, formu (∆87GAD65mut), GAD65, GAD65mut ve bir N-ölümcül iki türde ifade kesilmiş maksimum ifade, gününde karşılaştırıldı 5 ve 11 dpi, sırasıyla, olarak daha önce 11kurdu. Agroinfiltrated çay KAŞIĞI çıkarma gittikten sonra tüm örnekleri tarafından Batı leke analiz edildi ve rekombinant protein nispeten Dansitometresi analizi (Şekil 2) sayılabilir. Sonuçları 20-fold daha yüksek performans ∆87GAD65mut formunun üzerinde GAD65mut altını çizdi. Kesilmiş formu bu nedenle tercih edilen sözlü aşı aday, yüksek 201.4 ± 29.3 µg/g FLW kırmızı pancar yaprakları 11 dpi olarak biriken olarak seçilmiştir.
Son olarak, olası bir sözlü aşı geliştirilmesi için parametreleri değerlendirildi. Vakum dağılması kırmızı pancar yaprakları ∆87GAD65mut ifade sızmış sonra rekombinant protein bütünlük Karşılaştırmada işlenmemiş (sadece dondurulmuş) değerlendirildi doku, western blot analizi tarafından. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi hedef protein lyophilization işleminden sonra kararlı olmak gösterdi.
Mide sindirim simülasyonu dondurularak malzeme üzerinde son konsantrasyonu 1 mg/mL veya 1: 20'ye çay KAŞIĞI oranında domuz Gastrik enzim pepsin ekleyerek gerçekleştirilmiştir. Sindirim tedavi koşulların her ikisi de rekombinant protein yıkımı western blot analizi ile gösterildiği şekilde sonuçlandı (şekil 3 c, D, E, veriler rapor sadece pepsin son konsantrasyonu 1 mg/mL için). Pepsin sindirim (şerit pepsin, p 1-3), önerilen sonra tedavi dağılması sonra bitki hücreleri hedef protein yıkımı için önde gelen kendi bütünlüğünü kaybetti Pelet örnekte belirli bir sinyal olmaması.
Hücre bütünlük değerlendirilmesi ne zaman kurutulmuş bitki doku arabelleği nötr pH (pH 7,4), ∆87GAD65mut ile resuspended kısmen, en azından bazı hücreler Bileme ve kurutma yaprak sırasında bozuk olduğunu düşündüren çözündürüldükten olduğunu gösterdi. Resuspension asidik ortamlarda kurutulmuş bitki dokusunun yerine, sadece içinde çözünmez kesir ∆87GAD65mut tespiti yol açtı. Bu muhtemelen kırılmamış hücreleri11protein içeriğinin yanı sıra düşük pH neden ∆87GAD65mut yağış nedeniyle oldu. Bu donma kurutma aşı aday hazırlanması için tedavi olarak seçili bu deneyleri gösterir.
Ayrıca, agroinfiltrated kırmızı pancar yaprakları mikrobiyal şarj kalıntısı değerlendirilmiştir.
Bioburden tahlil için aday aşı hazırlık yararlanan tedaviler bakteriyel yük11ortadan görüntülenir.
∆87GAD65mut ve denetim kırmızı pancar bitkilerin metabolik bioequivalence parmak birincil ve ikincil metabolitleri ve Kutup lipidler LC-MS tarafından ∆87GAD65mut, dokuz agroinfiltrated denetimleri ifade dokuz kırmızı pancar bitkilerden üretilen tarafından değerlendirildi ve dokuz vahşi tipi kontrol eder. PCA Hayatinizda bir vahşi-türü bitki küme diğer örneklerinden ayrılmış saptandı. Hiçbir önemli farklılıklar yerine ∆87GAD65mut ve infiltre ve negatif kontrol bitkiler arasında vurgulanır. Ayrıca, bitkiler polar lipit profilleri açısından üç grup arasında anlamlı bir fark tespit11yaşındaydım.
Şekil 1: karşılaştırma eGFP ifade düzeylerinin agroinfiltrated kırmızı pancar, ıspanak yaprakları. Western blot analizi (A, D) ve Coomassie parlak mavi (B, E) protein özler eGFP ifade üzerinden ile lekeli karşılık gelen yükleme denetimleri (RuBisCO büyük alt birim) yaprak örnekleri 14'e 4 zamanlı Kurs Çözümleme sırasında toplanan gün enfeksiyon (dpi) sonrası. Her yaprak protein özü eGFP içeriğini Floresans ölçüm (C, F) sayısal. Agroinfiltrated kırmızı pancar yaprakları örnekleri sonuçlarından nerede agroinfiltrated ıspanak örnekleri sağ bir gösterilir sol panelinde görüntülenir. Proteini özleri eşit miktarda yüklenmiş, Batı leke için 3,5 µg ve Coomassie boyama için 30 µg. Bir anti-eGFP antikor bir sonda western blot analizi olarak kullanılmıştır. Yan sayıları kDa moleküler kütle işaretleyicilerini olduğunu gösterir. p.c., pozitif kontrolü, 10 ng ticari rekombinant insan GAD65; NC, negatif kontrol, özü yaprakları 5' taşıyan sadece A. tumefaciens ile infiltre üzerinden- ve integrase modülleri. Hata çubukları standart sapma üç bağımsız deneylerden temsil eder. Bu rakam Bertini vd.11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kırmızı pancar yaprakları GAD65mut ve Δ87GAD65mut ifade seviyelerinde. Western blot analizi(a)ve ilgili yükleme denetimi (RuBisCo büyük alt birimi) ile Coomassie parlak mavi (B) Δ87GAD65mut (solda) ve GAD65mut (sağda) ifade üç kırmızı pancar yaprakları protein özler, lekeli. Bir anti-GAD antikor (şerit 20 μL ekstresinin GAD65mut için ve Δ87GAD65mut için ekstresinin 1 μL ile doluydu) western blot analizi bir soruşturma olarak kullanılmıştır. Jel lekeli Coomassie içinde GAD65mut ve Δ87GAD65mut için protein özleri (10 μL/lane) aynı hacmi yüklendi. Yan sayıları kDa moleküler kütle işaretleyicilerini olduğunu gösterir. p.c., pozitif kontrolü, 10 ng ticari rekombinant insan GAD65; NC, negatif kontrol, 5' taşıyan sadece A. tumefaciens ile infiltre yaprakları elde edilen özü- ve integrase modülleri. Batı leke olumlu denetim densitometric analizi, iki protein formları göreli ifade düzeyleri için bir başvuru olarak çizilen (C) kullanma. Hata çubukları standart sapma üç bağımsız deneylerden temsil eder. Bu rakam Bertini vd.11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Sözlü aşı aday değerlendirme. Sol tarafta analizleri tedavi (A, B) dağılması sonra protein istikrar. Western blot analizi(a)ve ilgili jel Coomassie parlak Δ87GAD65mut ifade yaprakları üç bağımsız özler temsil eden mavi (B) ile lekeli. Hasat yaprakları doğrudan (taze) dondurulmuş veya -50 ° c, 72 h (freeze kurutulmuş) için 0,04 mbar liyofilize. Farklı doku: arabellek oranları çay KAŞIĞI ayıklama sırasında su kaybı nedeniyle dehidrasyon düşünün için istihdam edildi. Özler eşit miktarda yüklü, 0.25 ve western blot ve Coomassie sırasıyla boyama için 10 µL. Bir anti-GAD antikor kullanılan yan sondalama Batı leke için sayıları kDa moleküler kütle işaretleyicilerini olduğunu gösterir. NC, negatif kontrol, özü yaprakları infiltrated sadece ile A. tumefaciens 5' taşıyan- ve integrase modülleri. Sağ taraftaki vitro Δ87GAD65mut mide sindirim simüle (C, D, E). Batı Leke analizleri (C, D) ve karşılık gelen jel Coomassie parlak Δ87GAD65mut sonra simüle mide sindirim ifade yaprakları üç bağımsız özleri temsil eden mavi (E) ile lekeli. kullanılan enzim olmadan 1 mg/mL pepsin denetimi örneğini ise liyofilize doku 100 mg eklenmiştir. 24 µL ve supernatants (s) ve sırasıyla son Santrifüjü adımda elde pellets (p) için 16 µL SDS-sayfa analizi için kullanılmaya başlandı. Anti-GAD (C) ve anti-LHCB2 (D) antikorları probları western blot analizi olarak kullanılmıştır. Yan sayıları kDa moleküler kütle işaretleyicilerini olduğunu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Birincil metabolitleri (100 dk) | Süresi (dk) | % A | % B | Süresi (dk) | Türü |
| İlk | 0 | 100 | - | İlk durum | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isocratic | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Gradyan | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isocratic | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Gradyan | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isocratic | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Gradyan | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isocratic (re-denge) | |
| Sekonder metabolitler (60 dk) | Süresi (dk) | % A | % B | Süresi (dk) | Türü |
| İlk | 98 | 2 | - | İlk durum | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Gradyan | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Gradyan | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Gradyan | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Gradyan | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isocratic | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Gradyan | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isocratic | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Gradyan | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isocratic (re-denge) | |
| Kutup lipidler (90 dakika) | Süresi (dk) | % A | % B | Süresi (dk) | Türü |
| İlk | 50 | 50 | - | İlk durum | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Gradyan | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isocratic | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Gradyan | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isocratic (re-denge) |
Tablo 1: Degrade metaboliti elüsyon LC-MS analizi için koşullar.
| Kütle Spektrometre bileşenleri | İşlevi | Parametreleri | ||||
| Birincil metabolitleri | Sekonder metabolitleri | Kutup lipidler | ||||
| Electrospray iyonlaşma (ESI) kaynak | Gaz nebulizing | 50 psi, 350 ° C | 50 psi, 350 ° C | - | ||
| Gaz kurutma | 10 L min-1 | 10 L min-1 | ||||
| Atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (APCI) kaynak | Gaz nebulizing | - | - | 50 psi, 350 ° C | ||
| Gaz kurutma | 10 L min-1 | |||||
| Buharlaştırıcı | 450 ° C | |||||
| İyon kapanı ve Dedektör tarama | Tam tarama modu | 13.000 m/z / saniye | 13.000 m/z / saniye | 13.000 m/z / saniye | ||
| 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | ||||
| Tarama aralığı | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Hedef kitle | ||||||
| Çarpışma gaz | Helyum | |||||
| Vakum basıncı | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| Kapiller kaynak | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| Sonuna plaka ofset | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Kepçe | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| Cap çıkış | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| Ekim 1 DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| Ekim 2 DC | 1.7 V | -1.7 V | 2 V | |||
| Objektif 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Objektif 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| ICC olumlu iyonlaşma modu için | 20 | |||||
| ICC negatif iyonlaşma modu için | 7 | |||||
Tablo 2: Parametreler farklı pozitif ve negatif iyonlaşma modlarında kitle spectra Alım için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada otoimmün şeker hastalığı için bir aday sözlü aşı tasarımı için ön analizler gösterdi. Bu deneme için hedef proteini insan 65 kDa Glutamat dekarboksilaz, hangi üretim ve işlevselliği kolayca ortaya ve ölçülebilir12olduğunu mutasyona uğramış biçimiydi. Onun ifade farklı Yenilebilir bitki dokularında vektörel çizimler tarafından5, hangi rekombinant protein üretim çok kısa bir süre içinde yüksek düzeyde aracılık aracılı. Kırmızı pancar eGFP ifadede yenilebilir ana bilgisayar gerçekleştirilen en iyi aday bitki seçimi dayalı ve ıspanak tarafından el ile agroinfiltration bırakır. Bu adımı el ile agroinfiltration zaman alan yordamı ve ıspanak yaprağı doku infiltrasyonu içinde sertlik nedeniyle endüstriyel ölçekli-up için kritik olabilir.
Rekombinant protein birikimine düzeyde için rekombinant protein verir hasat özel DPI tanımlaması kritik bir adımdır ve test ve bir harf tarafından ayrı ayrı seçili gerekir. Farklı dpi ('dan 4'e 12), floresan protein ifade analizi izin en fazla ifade günün her bitki sisteminde tanımlamak için. En fazla ifade bugünlerde eGFP konsantrasyonu (µg/g FLW), arasında karşılaştırma vurgulanan o kırmızı pancar platformu rekombinant protein verim açısından en iyi olduğunu.
Bu nedenle, kırmızı pancar daha fazla bitki virüs tabanlı vektörel çizimler teslimi için aşı sanayi büyük ölçekli üretim13için daha uygun olarak kabul edilir bir vakum sistemi tarafından test edildi.
Verilen bu standart vakum infiltrasyon Protokolü tütün türler5için optimize edilmiştir, parametreleri kabul bitki türleri için yordam ayarlama için bir dizi kritik bir noktaya düzmece. Daha sonra kırmızı pancar vakum agroinfiltration Protokolü optimize edildi. Elimizdeki kanıtları Agrobacterium seyreltme yaprak geçirgenliği geliştirmek için deterjan konsantrasyonu ise protein ifade düzeylerini geliştirmek için çok önemli olduğunu gösterdi. Sonuçları gösterdi ki bitki sistemi ve bu iş amacı ile fit teknolojisi.
Daha önce i. benthamiana7farklı alt Hücrede yerleşimi, görüntüleme, onların ifade için karakterize iki farklı türde GAD65, GAD65mut ve ∆87GAD65mut, kırmızı pancar vakum infiltrasyon tarafından ifade edildi. Üç biyolojik çoğaltır her örnek için hazırlanmıştır. Her biyolojik REPLICATE infiltre yapraklarından üç farklı bitkiler, her iki GAD65 formları için 14 dpi 2 den örneklenmiş bir havuz oluşur. Onların ifade düzey en yüksek biriken proteinin içinde bitki doku seçmek için karşılaştırıldı.
Dansitometresi analizi tarafından göreli miktar ∆87GAD65mut 20-fold yüksek bir ifade düzeyinde olduğu gibi muadili göstermiştir. GAD65mut, hücre zarı, bu forma çapa onun artıkları nedeniyle7, verim düşük var iken bu onun sitozolik yerelleştirme nedeniyle düşük protein istikrar yansıtan. ∆87GAD65mut ortalama birikimi düzeyi kırmızı pancar yaprak dokusu ile T1D sözlü aşı geliştirme başlatmak yeterli 201.4 ± 29.3 µg/g FLW, idi.
Son olarak, en uygun platform, teknoloji ve protein formu seçimden sonra biz virüslü yaprakları kadar bir hasat sonrası tedavi ayarlayarak devam etti. Yaprak doku 95 oranında su oluşmaktadır yana, dehidrasyon tedavisi mikroorganizma kontaminasyonu önlemek yararlıdır. Sonuçlarımız yaprakları rekombinant protein düzeyleri etkilemeden bir freeze-drying tedavi örnek için uygulanan olabilir gösterdi. Lyophilization tarafından 10 kat su kaldırma agroinfiltration yordam için kullanılan rekombinan A. tumefaciens dahil bakteriyel kontaminasyon (bioburden), ortadan kaldırır.
Ayrıca, protein biyo kapsülleme analizi simüle bir mide sindirim takip ∆87GAD65mut tamamen sindirilmiş gösterdi. Bu freeze-drying tedavi mide ortam asidik ve enzimatik kompozisyon rekombinant protein açığa bitki hücre duvarı zarar göstermektedir.
Protein veya peptid molekül bütünlüğü üzerinde emme gastrointestinal sistem geçiş sitesine bakım oral ilaç teslim14için bir sorun temsil eder. Bu nedenle, dehidrasyon tedaviden sonra potansiyel aşı doğru mide çevre bütünlüğünü kaybetmeden üstesinden gelmek için formüle. Bitki kaynaklı GAD aşı üretiminde, nispeten istikrarlı bir kabuk katma korumalı ve sözlü teslim rota15boyunca istikrarlı olmasını sağlayan, verimliliği artırmak için bir sistem olarak uygulanabilir.
Çeşitli teknolojiler yüksek kapsülleme verimliliği gösterdi insülin ve hızlı insülin ile sentetik hidrojel complexation üzerinde bazı yeni çalışmalar oluştururlar sözlü teslimiyle ilişkili sorunların üstesinden gelmek için incelemiş bulunuyoruz bir pH bağımlı bir şekilde16,17bağırsaklarda serbest bırakmak.
Her iki birincil ve ikincil metaboliti bioequivalence ∆87GAD65mut ile karşılaştırıldığında infiltre ve infiltre olmayan denetimleri ifade bitkilerin PCA istatistiklerini kullanarak araştırılmıştır. Sigara sızmış vahşi-türü bitkiler ayrı bir kümesi oluşur, ancak ∆87GAD65mut ve infiltre denetimleri ifade infiltre bitkiler arasındaki farklar önemli, değildi. Bu sonuçlar infiltre bitkiler sayesinde bakteri metabolitleri veya zaten edebiyat13gösterildiği gibi infiltrasyon nedeniyle bitkiler tarafından üretilen metabolitleri LC-MS analizi tarafından işlenmemiş bitkilerden ayırt edilirler öneririz. Genel olarak bu analiz ∆87GAD65mut birikimi genel metabolizma üzerinde etkisi az olduğunu gösterdi.
Tamamen bu sonuçlar ∆87GAD65mut bitki virüs temel ifade teknoloji istismar elde edilen ifade kurutulmuş kırmızı pancar yaprak dokusu tarafından temsil edilen potansiyel sözlü aşı deneysel T1D sözlü immünoterapi için uygun olduğunu göstermektedir denemeler. Geçici ifade alanında hızla hem de yüksek düzeyde yabancı proteinler üretmek için onun yetenek nedeniyle bitki virüs ifade vektör teknolojisi çok cazip hale gelmiştir. Bu teknoloji sadece RNA polimeraz RNA bağımlı ve hareket protein5 taşıyan bir deconstructed vektör üzerinde temel alır ve bu nedenle onun infektivite tesislerinde kaybeder; Sonuç olarak, insanlar için potansiyel iletimini dışlanmaları gerekir.
Rapor burada deneysel protokol birçok farklı yenilebilir türler için marul gibi Chenopodium capitatum ve Tetragonia expansauzun olabilir. Bu tür, kırmızı pancar, ıspanak, dahil yaprakları beri kimin daha önce iyi ifade bitki sistemleri5olarak algılandı pişmemiş gıda olarak kullanılabilir, burada önerilen teknoloji veya üretim yenilebilir aşılar için kullanılan minimal işlenmiş fonksiyonel gıda veya yem üretimi.
Rekombinant protein/bitki türleri kombinasyonu, rekombinant protein birikimine düzeyde verir hasat DPI gerekir hala ampirik bir olgu-yapılmasına bağlı olarak ifade edilen rekombinant protein ve ev sahibi belirlenecek bitki tür18.
Bu teknoloji sözlü aşı üretimi için alternatif geleneksel aşılar yakın gelecekte için yanı sıra savaş oncolytic virüs, kanserleri ve solid tümör, Otolog aşı olmak için büyük bir potansiyel tutun ve Monoklonal antikor hedef kanser19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser ortak projesi "Bitkilerin kullanımı bir otoimmün diyabet yenilebilir aşısı (eDIVA) üretimi için" tarafından desteklenmiştir (Proje kodu: 891854) çağrı 2014 çerçevesinde Verona Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).
