Summary
本文介绍了一种解剖嗜酸性粒体木偶视网膜的手术方法, 以及免疫组织化学、西方分析和 rna 提取组织处理的方案。
Abstract
五食子性视网膜为研究发育过程中的形态发生过程提供了一个很好的模型系统。本文提出了一种可靠的方法来解剖娇嫩的酒糟体木偶视网膜。我们的手术方法利用现成的微解剖工具来打开小管, 精确地提取眼脑复合物。这些可以固定, 接受免疫组织化学, 视网膜, 然后安装在显微镜幻灯片和成像, 如果目标是检测细胞或亚细胞结构。或者, 不固定的视网膜可以从脑组织中分离出来, 在适当的缓冲液中裂解, 并用于蛋白质凝胶电泳或 mRNA 提取 (分别用于评估蛋白质或基因表达)。掌握所描述的微解剖协议可能需要大量的实践和耐心, 但一旦掌握了该协议, 就可以相对快速地隔离主要是未损坏的视网膜。
Introduction
嗜德维子由大约750个被细胞包围的孔体组成, 细胞排列在蜂窝晶格1、2、3、4 中.每个瘤包含八个光感受器神经元, 四个透镜分泌锥细胞, 和两个主要色素细胞。周围的每个复合材料都是产生色素的晶格细胞和感觉刚毛群。由于其后有丝分裂的性质和陈规定型六角形排列,五合子木偶视网膜提供了一个很好的模型系统, 研究形态发生过程, 包括细胞粘附5,6, 7,8,9,10和凋亡 11,12,13, 14,15.
几个已发表的协议利用气压从五食小狗 16,17,18提取眼脑复合物。这里描述的协议反而利用微解剖工具, 仔细和精确地分离眼睛-大脑复合物, 目的是获得未受损的视网膜组织。如果视网膜被用于形态、蛋白质或基因表达分析, 这一点至关重要, 因为视网膜的损伤会导致细胞压力或死亡, 从而改变细胞表型或基因表达。此外, 经过练习, 6 至10个眼脑复合物可以在10至15分钟内分离, 从而有助于实现在解剖眼组织的年龄和发育阶段最大限度地减少变异性的目标。
下面描述的固定、免疫染色和全安装协议适用于荧光显微镜用五全套眼睛的制备。视网膜可以与针对感兴趣的蛋白质的抗体一起孵育。例如, 抗体对粘附结成分可用于可视化细胞的顶部周长, 以便评估包括细胞类型、形状和排列在内的特征19。在固定之前, 眼睛可以从大脑中分离出来, 用于提取用于西方分析的蛋白质, 或用于 qRT-PCR 或 rna 测序的 RNA。
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Protocol
1. 组织制备
- 建立五合子十字架 (如前面所述 20) 或培养特定的嗜酸性粒菌株, 以获得所需的基因型的脓包。为了确保大量的小鱼巧合地出现, 在营养丰富的食品培养基或标准的食品培养基上大量补充酵母糊, 建立这些苍蝇培养物一式两份。
- 在 25°c 保持果蝇培养。对于使用 UAS-GAL4系统的交叉, gmr-gal4是一个理想的驱动程序, 表达在幼虫眼核后和整个木偶发育21,22,23,24. 交叉Uas-laz x UAS-lacZ 是一种理想的控制交叉, 因为它驱动了非源性和惰性β-半乳糖酶蛋白的表达。
- 使用用蒸馏水湿的6英寸竹夹板的尖端, 轻轻地将白色的前松 (图 1B) 从健康培养瓶的一侧 (图 1B) 提起 (图 1B), 放入 1.5 ml 微离心管 (图 1 c)。
- 将管道放入塑料移液器尖端盒, 并将一小块组织浸泡在蒸馏水中, 使腔内保持足够的湿度, 以防止导管干燥 (图 1D)。在25°c 时将脓肿孵化至解剖。
- 使用干燥的 6 "竹夹板轻轻地将子从微离心管中推出, 并放入黑色的解剖盘。把一块新鲜的双面胶带放在远离的解剖盘上。
- 使用一对钳子, 小心地将钳子背侧向上 (即, 面朝上的手术,图 1b) 放在胶带上 (图 2a)。确保小狗能很好地粘附在胶带上。
注: 木偶外壳上的水分会抑制对胶带的安全粘附, 在这种情况下, 在放置到双面胶带上之前, 使松软物保持风干。
2. 眼脑复合物的解剖
- 使用钳子删除每个子的周期 (图 2c)。
- 使用微解剖剪刀切片或切割打开每个的木偶案例。拍打打开基巴箱, 露出头部、胸部和前腹部段, 将木偶箱的边缘固定在双面胶带上 (图 2 c)。
注: 没有必要完全露出。 - 用锐利的钳子刺穿每个的腹部, 抓住动物, 并将其从木偶箱中取出 (图 2 c)。
- 将 pupae 放在黑色解剖盘上, 远离胶带, 并盖上约400Μl 的冰凉磷酸盐-缓冲溶液 (PBS, pH 7.4)。
- 用钳子抓住每个子的腹部, 用微解剖剪刀, 在整个胸部进行干净的横截面切割, 将切成两半 (图 2d)。
- 从 PBS 中取出每个尸体的后残存, 放在解剖盘的一侧 (不要丢弃, 请参阅步骤 3.2.1)。
- 使用两对细钳, 打开每个子的胸部和头部, 以揭示眼睛-大脑复合体 (图 2E)。要做到这一点, 抓住胸部上皮的伤口, 并逐渐撕裂打开胸部, 然后头囊, 暴露眼脑复杂和周围的脂肪组织。
- 在不抓住组织的情况下, 使用钳子引导眼脑复合体远离头部囊的残余, 或从打开的头部囊挖出眼脑复合体。
注: 眼睛大脑复合体是哑巴形, 白色, 比周围的奶油色脂肪更半透明 (图 2B, e)。 - 使用钳子, 小心地去除大多数与眼睛-大脑复合物相关的脂肪, 而无需触摸眼睛组织。
3. 组织的免疫荧光加工
- 如所述, 至少解剖 6-10 pupe (步骤 2.1-2.9)。
注: 每个解剖的三到四个独立复制往往会产生足够的数据来检验假设。 -
清洗和固定
- 用干净的剃须刀片切割 P20 或 P100 移液器尖端, 以增加刀尖开口, 使其半径约1毫米, 并通过向上和向下移液 PBS 和脂肪的混合物进行润滑。这种脂肪可以从第2.6 步中取出的尸体残留物中获得。
- 在冰上的9英寸玻璃盘中, 将眼脑复合物转化为约400μl 的 PBS。使用润滑尖端和 P20 或 P100 空气置换微型移液器进行传输。
注: 眼睛-大脑复合物在移液过程中会粘附在未润滑的尖端, 并被损坏或丢失。 - 通过将 PBS 向上和向下移液, 轻轻旋转眼脑复合物, 去除与眼睛组织相关的剩余脂肪。在这和随后的所有洗涤步骤中, 不要直接上下移液器的眼睛-大脑复合物, 因为这会损害脆弱的眼组织。
- 将 PBS 最小体积 (& lt;20 μL) 中的眼脑复合物转移到至少250μl 的固定剂中。通过上下移液混合溶液。在冰上孵化35分钟。
注: 步骤3.1.1 中制备的相同润滑尖端可用于此传输。 - 使用相同的移液器尖端, 将眼脑复合物转移到含有 ~ 400μl PBS 的井中。通过上下移液混合, 在冰上孵育 5-10, 进行清洗。重复清洗步骤至少两次。
注: 在最后的 PBS 清洗中, 可以在冰上或在4°c 下保持几个小时的眼脑复合体, 然后再继续步进3.3.1。
-
抗体染色
- 为了在接触抗体溶液之前阻断组织, 将眼脑复合物转移到 ~ 400μl 的 PBT。使用润滑尖端和 P20 或 P100 空气置换微型移液器进行转移。在冰上孵化10至60分钟。
- 通过稀释 PBT 中适当的抗体, 制备主要抗体溶液。由于眼脑复合物是在10μl 的抗体溶液中培养出来的, 因此所制备的体积将是10的复制。
- 将10μl 抗体溶液注入72井微井托盘的清洁井中 (见讨论)。
- 用干净的剃须刀片切割 P10 移液器尖端, 将尖端开口增加到半径约 0.5 mm, 并通过移液 PBT 上下润滑。
- 使用 P10 空气置换微管和润滑尖端, 将不超过5个眼脑复合物转移到每个10μl 井抗体溶液中, 体积为 pbs, 不超过5个眼睛-大脑复合物。
- 通过上下移液来使抗体溶液同质化。不要上下移液眼脑复合物, 因为这会损害组织。
- 为了最大限度地减少抗体溶液的蒸发, 将浸泡在蒸馏水中的一小块组织放入微井托盘中, 然后密封托盘 (例如, 提供盖子)。在4°C 下过夜。
- 将眼脑复合物从微井托盘转移到9美元的玻璃盘中, 进入 ~ 400μl 的 PBT 中, 进行清洗。使用 P10 空气置换微移液器和 pbt 润滑尖端 (准备步骤3.3.4 中所述)。通过上下移液混合溶液。在冰上孵化5-10。
- 重复清洗步骤至少两次。使用 P20 或 P100 空气置换微移液和 pbt 润滑尖端在洗涤溶液之间转移眼脑复合物。
- 根据需要稀释适当的氟标记的二级抗体, 准备二级抗体溶液。100μl 的二级抗体溶液是足够的每一批 6-10 pupe。将二级抗体溶液注入9链玻璃解剖盘中。
- 将眼脑复合物转化为二级抗体溶液。使用 P20 或 P100 空气置换微型移液器和 pbt 润滑尖端进行传输。
- 在室温下将眼脑复合物在二级抗体溶液中培养 1-2小时, 或在4°C 时培养3-5 小时。为防止光能被光漂白, 请用铝箔覆盖制剂。
注: 在二级抗体溶液中孵育的最佳持续时间可能因使用的原生抗体和二级抗体的不同而不同。 - 将眼脑复合物转移到9英寸玻璃盘中的约 400μl PBT 中, 进行清洗。通过上下移液混合溶液。在冰上孵化5-10。此清洗步骤应重复至少两次。
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二次固定
- 对于二次固定, 将眼脑复合物转移到至少200μl 的固定剂, 在室温下孵育 20分钟, 在4°C 下孵育35分钟。
注: 二次固定会使眼睛组织变硬, 从而有助于安装 (步骤 3.5)。 - 使用 P20 或 P100 空气置换微型移液器和 pbt 润滑尖端, 在9井玻璃盘中, 在冰上将眼脑复合物转移到 ~ 400Μl 的 PBT 中, 清洗5分钟。
- 至少重复一次清洗步骤。
- 使用 P20 或 P100 空气置换微移液器和 pbt 润滑尖端, 将眼睛-大脑复合物转移到9口玻璃盘中的约 400μl PBS 中, 在冰上冲洗 1-2分钟. 通过移液 PBS 保持组织的运动, 而不是组织, 向上和向下, 以防止眼睛大脑复合物在 pbs 冲洗过程中沉淀并粘附在玻璃盘上。
- 对于二次固定, 将眼脑复合物转移到至少200μl 的固定剂, 在室温下孵育 20分钟, 在4°C 下孵育35分钟。
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安装
- 将眼脑复合物转移到约200μl 的安装介质中。使用 P20 或 P100 空气置换微移液器和 pbt 润滑尖端转移眼脑复合物。让组织在安装介质中平衡1-2小时。
- 将5-8μl 滴的新鲜安装介质放置在干净的显微镜幻灯片上。
- 用干净的剃须刀片切割 P10 尖端, 以增加尖端开口, 使半径约 0.5 mm, 并使用此和 P10 空气置换微型移液器将5-8μl 安装介质中的眼睛-大脑复合物转移到滑块上安装介质的落差中。
- 使用两个钨针将眼睛与视叶分开。用坚固的钨针将眼睛与大脑复合体固定在幻灯片上, 并用细钨针将每只眼睛从其相关的视叶上切下来 (图 2f)。
- 使用精细的钨针将每只眼睛与显微镜滑块的表面进行机动, 每个眼睛的基部表面与滑块相邻。轻轻降低纸巾上干净的盖板, 用指甲油固定。
注: 将眼睛排列在幻灯片上, 使其彼此接近或在一条线上, 将有助于随后的显微镜检查。 - 使用荧光或共聚焦显微镜对视网膜进行成像。
注: 如果不立即成像, 则应将幻灯片存储在4°C。
4. 用于西部印迹的眼组织的制备:
- 解剖 10-16 pupae (步骤 2.1-2.9), 但有以下修改: a) 在 PBS 中分两批采集和解剖小皮, 间隔 10-16, b) 在 PBS 中解剖, 辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂 (PBS + pi)。
- 使用 P20 或 P100 空气置换微移液器和润滑尖端 (按步骤3.2.1 准备) 将眼睛大脑复合物转移到9英寸玻璃盘中的 ~ 400μl PBS + pi 中, 在冰上进行短暂冲洗。
注: 此润滑提示可用于后续步骤4.3 和4.4。 - 重复冲洗步骤两次。
- 将所有眼脑复合物转移到 ~ 400μl 的冰冷 PBS + pi 下脱到一个干净的黑色解剖盘。
- 使用坚固的钨针 (稳定眼脑复合物) 和精细的剃须刀刀片或微解剖剪刀将每只眼睛从视叶中取出, 使每只眼睛从视叶上剪下。
注: 眼睛在这个阶段是 "粘的", 可能会轻轻粘在解剖盘。这是有利的, 因为它可以帮助促进从视叶移除眼睛 (见讨论)。 - "扫" 到一个 "堆" 在 PBS + pi 解剖盘, 使用一个刀片的一个精细的钳子。
- 用干净的剃须刀片切割 P10 尖端, 将尖端宽度扩大到半径约 0.5 mm, 并通过上下移液西组织裂解缓冲器 (WTLB) 来润滑尖端内部。
- 将 5μl PBS + pi 中的眼脑复合物转移到500μl 微离心管中。使用此润滑尖端和 P10 空气置换微型移液器完成传输。
- 将微离心管放在冰上。在样品中加入 1个 WTLB 体积 (5μl), 在样品中加入10Μl 的2倍浓缩蛋白样品缓冲液 (或5倍浓缩蛋白质样品缓冲液的 2.5μl)。通过点击混合。
- 短暂地旋转微离心管, 并使用桌面微型离心机旋转样品。
- 将样品存放在-20°c, 直至分析。使用标准协议进行分析。
5. 用于 RNA 提取的眼组织的制备:
- 戴手套, 清洁台面, 显微镜, 解剖工具, 和黑色解剖盘, 首先与70% 乙醇, 然后 RNase 去污试剂。让它干燥。
- 解剖30-40 脓包 (步骤 2.1-2.9), 但须作以下修改: (a) 分批采集和解剖6至8种, 间隔 15-20;b) 在无核酸酶 PBS 中解剖, c) 分别分离每一批眼睛, 但将所有视网膜组织积累到同一微离心管中 (步骤 5.5)。
注: 让两个人同时解剖将加速良好的眼睛组织的有效隔离。 - 对于每个批次, 分离眼睛-大脑复合物 (步骤 2.1-2.9), 并在9口玻璃盘中转移到 ~ 400μl 的无核酸酶 PBS 中, 使用 P20 或 P100 空气置换式微型移液器和润滑尖端 (如步骤3.1.2 所述) 在冰上短暂冲洗。
注: 此润滑提示可用于后续步骤5.4、5.5 和5.8。 - 重复冲洗步骤两次。
- 将眼脑复合物转移到一个干净的黑色解剖盘上的一个新鲜的400Μl 滴的无冰川核 PBS。
- 使用坚固的钨针 (稳定眼睛大脑复合物) 和精细的剃须刀刀片或微解剖剪刀将每只眼睛从视叶中取出, 使每只眼睛从视叶上剪下。
注: 眼睛在这个阶段是 "粘的", 可能会轻轻粘在解剖盘。这是有利的, 因为它可以帮助促进从视叶的眼睛去除 (见讨论)。 - "扫" 到一个 "堆" 在无核酸酶 PBS 在解剖盘, 使用一个刀片的一副精细的钳子。
- 将眼睛转移到无菌的无 rnase 微离心管和液氮中的闪光灯冷冻。
- 对每批脓包重复解剖 (步骤 5.3-5.8)。将每批眼睛转移到保持在液氮中的同一微离心管 (步骤 5.5), 将所有眼睛积累在一个管中。
- 将样品存放在-80°c, 直到 RNA 提取。
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Representative Results
木偶眼是一种易于接触的组织, 可作为一个很好的模型来研究驱动形态发生的发育过程。在这里, 我们解剖视网膜, 并使用免疫荧光检测在细胞凋亡过程中激活的位粘连 (图 3a, c) 或 dcp-1 caspase (图 3A) (图3)25。这些方法使人们能够清楚地观察细胞在关键的形态发生过程中的作用, 包括原代细胞的吸收和形态发生 (来自 18h APF)、每个孔周围的晶格细胞的插层 (18-24h APF)、建立三级生态位 (21-24h APF), 细胞大小和形状的变化 (从18小时到 40h APF), 和凋亡 (从18到 ~ 33h APF)。这些形态发生事件的时间取决于温度, 因此由于不同实验室环境中孵化器温度的微小差异而略有变化。然而, 到了大约 40h apf, 细胞的最终排列通常是实现的 (图 3b, c), 这是一个评估基因突变或转基因表达后果的理想年龄. 例如, 在细胞凋亡酶活化的核心抑制剂 Diap1 (图 3c)26的异位表达之后, 我们的方法允许一个人量化与对照 gmr 相比, 晶格细胞数量的相应增加> 的乳胶视网膜人们还可以通过使用抗 Dcp-1 抗体或其他检测垂死细胞的方法更直接地评估细胞凋亡 (图 3d)。
眼裂解液可以通过西方分析进行审讯, 以确定感兴趣的蛋白质的存在和/或相对表达。在这里, 我们展示了在野生类型的 s 型视网膜在21和 40 h apf 眼睛解剖的干燥口的核心成分 de-cadherin 的检测结果 (图 4 a)。这个西方印迹样本的量化 (右,图 4 a) 显示, 在这两个时间点, 当波段强度根据 GAPDH (一个核心) 的表达式被归一化时, DE-Cadherin 的相对表达性没有很大的差异代谢酶)。这类分析通常是一式三份, 而不是一次, 如这里所示。
如果一个人的目的是使用先进的测序应用 (例如, Next-gen、rna-seq) 分析基因表达, 那么从嗜酸性人的基视网膜中分离出高纯度的 mrna 是至关重要的。我们发现, 如果一个人的目标是分离和 gt;1 毫克的高质量 rna (图 4b), 那么每个基因型或实验条件下解剖60只以上的眼睛是最佳的。在这里, 我们展示了一个 RNA 样本的吸收光谱的例子, 从57个野生类型的 s 型眼睛中分离出, 在 40H apf 解剖 (图 4b, 顶部面板)。260nm 的峰值吸收率与 RNA 的吸收波长相对应。我们还提供了一个表格, 反映了在 21 h 或 40 h APF 采集的 6个 RNA 样本的 rna 产量和 A260/A280 和 a260a230 的纯度比率。这些数据反映了提取 RNA 时 RNA 产量的细微差异。
图 1: 解剖用的选择和培养.(a) 在健康的果蝇培养的两侧徘徊的第三幼虫 (l3) 幼虫和小虫。(b) 前松可以通过其半透明的白色来识别, 因为在保护性木偶的情况下, 颜料尚未产生。的后侧和背腹轴呈蓝色显示。一个潮湿的竹夹板是用来移出和采摘前松从小瓶的墙壁。(c) pukae 被放置在 1.5 ml 微离心管内, 这些管贴上适当的标签 (基因型、采集日期和收集时间), (d) 在由空的移液尖端箱组装的加湿室内培养。通过在盒子内放置一块潮湿的组织来保持湿度。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 解剖木偶的眼睛.(a) 在黑色解剖盘上粘附在双面胶带上。前部、后部和背部的坐标以蓝色表示。(b) 为了隔离眼脑复合物 (这里显示了一个单一的), (c) 首先从它的木偶案例中取出。将显示此过程中的重要步骤。红线表示在切除小室后, 在哪里撕开并打开木偶的外壳。然后用钳子将从撕破的木偶箱中取出。(d) 暴露在外的首先用微解剖剪刀 (用虚线表示的位置) 沿着胸部切割, 头部上皮随后小心撕开 (红色箭头), 如 (e) 所示, 以揭示不透明的眼睛大脑复合体。(f) 在用适当的抗体孵育后, 视网膜从眼脑复合物中切片。将显示此过程中的重要步骤。眼睛被稳定与坚固的钨针 (左) 和视网膜去除用一个美好的钨针 (右)。对于蛋白质和 RNA 分析, 不固定的视网膜可以用细剃须刀片或微解剖剪刀, 而不是细钨针从视叶中干净地切割。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 小木偶眼睛的免疫荧光.(a) 对母目细胞的 de-cadherin 标签的抗体。面板 a 中的所有图像都是使用共聚焦显微镜在视网膜的中心区域采集的, 用图像处理软件进行了最小的修改, 并以相同的比例 (刻度条 = 5μm) 呈现。注意细胞从 18h APF 到 27小时 APF 的生长和重新排列。(b) 在 40H apical (左) 和横截面上的一个全模式的和一个的顶端视图的漫画。单元格类型是在键中列出的颜色编码。光感受器被埋在假分层神经上皮的表面以下, 并被锥形和色素细胞包围。三个刚毛组围绕着每个刚毛体。(c) 控制视网膜的小区域, 其中 lz 表达(左) 或diap1 (右), 以抑制二级和三级色素细胞的凋亡。用抗 De-cadherin 标记粘附物连接点可以分析细胞数量、排列和形状。使用标准荧光显微镜拍摄图像。(D) 整个视网膜与激活的 Dcp-1 抗体一起孵育, Dcp-1 是在细胞凋亡过程中激活的一种酪蛋白酶, 从眼睛中修剪出许多细胞。图像是用共聚焦显微镜拍摄的。白色虚线勾勒出眼睛。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 木偶眼的蛋白质和基因表达分析.(a) 28只眼睛的西方印迹 (左) 在 21 h apf 或 40 h apf 解剖, 用 DE-cad 抗体进行了探测, 并作为负载控制, 进行了 GAPDH。对蛋白质带强度的分析 (右) 显示, 相对于 GAPDH, 这些视网膜组中存在类似浓度的 de-cad。(b) 从 s 型视网膜中提取的 rna 样本的单吸收谱在 40小时 apf (上) 解剖。注意260纳米的吸收峰值。记录从 21 h 和 40 h apf (底部) 分离的 s-KLE 母皮视网膜中提取的 RNA 的数量和纯度比率的表。这些数据来自三个独立的样本集。每个样本集的 Puae 在相同的条件下进行饲养和孵化, 并在同一天进行解剖。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的五食母目解剖方法允许在10至15分钟内分离6到10个眼睛-大脑复合物。然而, 为了掌握解剖技术, 提高解剖质量和速度, 耐心和实践是必不可少的。这种短暂的解剖时间确保了每只眼睛大约处于相同的发育阶段, 减少了数据集中视网膜表型或基因表达的变异性。虽然替代协议可能需要较少的实践掌握, 我们的协议旨在有条不紊地分离微妙的视网膜组织, 同时最大限度地减少撕裂或剪切的风险, 因为对眼睛的损害可能会导致应力通路激活, 甚至甚至细胞死亡。我们建议初学者先掌握培养到 40 h APF 的解剖, 然后再尝试解剖年轻的眼睛。我们建议为所有实验 (步骤 1.1) 设置复制交叉 (步骤 1.1), 以确保始终有足够的 pupae 可供收集 (步骤 1.3)。在木偶发育过程中, 视网膜可以在不同的时间点进行解剖, 这取决于研究人员感兴趣的明显的形态发生事件。这可能包括原代细胞的吸收和形态发生 (从 18h APF)、晶格细胞的插层 (18-24h APF)、建立三级生态位 (21-24小时 APF)、细胞大小和形状的变化 (从18小时到 40h APF) 以及凋亡 (从18小时到 ~ 33h APF) (图 3 a)。
如果在基巴病例的初始打开过程中 (步骤 2.2,图 2c), 一个的胸部被刺破, 研究人员仍然应该能够继续解剖。然而, 如果头部最初被刺破, 提取未受损的眼脑复合物可能会很困难。当从其木偶箱中取出一个 (步骤 2.3,图 2 c, 右面板) 时, 腹部木偶的情况下有时可以从双面胶带上移出, 并保持包裹在的腹部。这不可能是一个障碍, 虽然当 PBS 包围时, 子可能会漂浮, 直到腹部和附属的木偶病例与分离 (第2.6 步)。为了保持视网膜组织的完整性, 它是必要的, 尽快固定或冻结后, 最初的穿刺的小孔。此外, 在整个协议过程中, 尽可能使用冰凉溶液并将组织保持在冰上 (或在 4°c), 将保持组织和细胞的完整性, 从而实现更好的免疫荧光、蛋白质分析或 rna 分析。对于后一种应用, 重要的是要从眼睛中去除所有脑组织和脂肪组织, 因为这些组织会污染分析 (步骤2.9 和4.3 或 5.4)。
当不固定或在 PBS 洗涤过程中, 木偶眼脑复合体可以粘附在未润滑的移液器尖端、玻璃和解剖工具上, 从而导致组织损伤。为了防止这种情况的发生, 我们建议您小心润滑移液器吸头, 不要用乙醇清洗9井玻璃盘 (也应避免使用洗碗肥皂)。相反, 只需清洁玻璃盘与蒸馏 h2o 和润滑, 如果需要, 与 PBT 冲洗使用前.解剖钳、剪刀和针头也应主要用蒸馏的h2o清洗, 除非在为 rna 萃取解剖准备时 (步骤 5.1)。然而, 视网膜和玻璃显微镜幻灯片之间的光粘附有助于展开眼睛, 并将其定位在滑块上, 当眼睛与眼睛裂片在安装过程中 (步骤3.5.4 和 3.5.5)。同样, 眼睛与黑色解剖盘的轻微粘附可用于在隔离用于蛋白质或 RNA 分析的视网膜时, 使组织变平并非常轻拉伸, 从而促进干净地切断眼睛瓣连接 (步骤4.5 和 5.6)。我们发现, 微解剖剪刀或一个精细的剃须刀刀片是优秀的工具, 快速和干净的裂开不固定的眼睛从视叶。
在原代抗体染色过程中, 可以使用9井玻璃盘, 而不是在72口微井托盘 (步骤 3.3.5) 中培养眼脑复合物。为了防止抗体溶液在一夜之间蒸发, 一定要用盖板或滑块封盖玻璃盘井。然而, 这种方法将需要40-50μl 的初级抗体溶液, 用于在一个9井玻璃盘井中培养的6-10 眼-大脑复合物, 而不是分布在72井微井托盘2井之间的初级抗体溶液20Μl。
在将眼睛安装在显微镜幻灯片上之前, 眼睛-大脑复合物 (3.4 步) 的二次固定 (3.4 步) 会使组织稍微变硬, 使眼睛更容易从视叶中裂开, 眼睛更不可能折叠或粘附在解剖针上。在安装介质 (步骤 3.5.1) 中孵育1-2小时后, 眼睛-大脑复合物变得略显不透明, 因此在安装过程中更容易看到。此外, 在安装介质1-2小时后, 大多数二级抗体在荧光成像过程中都会得到适当的保护, 免受光漂白。不建议在安装前在安装介质中隔夜孵化视网膜, 因为这会使视网膜变软, 从而消除二次固定的加劲效果。
对于西方分析, 需要至少20眼的裂解液, 以便使用能够有力识别嗜铬菌蛋白的抗体 (例如,图 4 a) 可靠地检测蛋白质。然而, 如果感兴趣的目标蛋白表达较低, 可能需要更多的眼睛。如果随后西方印迹组织的裂解不完整 (步骤 4.7), 则添加到样品中的 WTLB 体积可以略有增加, 浓缩样品缓冲量也会相应调整 (步骤 4.9)。对于 RNA 提取, 如果目标是分离大量高质量的 RNA, 则可能需要快速解剖大量的眼睛 (步骤 5.2, 见图 4B)。如果两位掌握果蝇皮眼解剖的科学家合作, 同时解剖这些大量的苍蝇视网膜, 这种潜在的缺点是可以克服的。但是, 所需的 RNA 总量将取决于进行 RNA 分析的机构或设施的要求、RNA 分析或测序的类型以及所使用的 RNA 提取试剂盒。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢扎克鼓和我们的审查人员对手稿的有益评论。这项工作得到了 R15GM114729 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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