Summary
Dit document stelt een chirurgische methode voor het ontleden van Drosophila pop netvlies samen met de protocollen voor de verwerking van weefsels voor RNA-extractie, immunohistochemistry en westelijke analyse.
Abstract
De Drosophila pop netvlies biedt een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van morfogenetische processen tijdens ontwikkeling. In deze paper presenteren we een betrouwbaar protocol voor de dissectie van de delicate Drosophila pop netvlies. Onze chirurgische aanpak maakt gebruik van gemakkelijk verkrijgbare microdissection tools om te openen poppen en juist uitpakken oog-hersenen complexen. Dit kunnen worden vastgesteld, onderworpen aan immunohistochemistry en netvlies dan gemonteerd op Microscoop dia's en beeld als het doel is om het detecteren van cellulaire of subcellular structuren. Anderzijds kunnen nietgefixeerde netvlies worden geïsoleerd van hersenweefsel, lysed in passende buffers en gebruikt voor eiwit gel elektroforese of mRNA extractie (om te beoordelen eiwit of gen expressie, respectievelijk). Aanzienlijke praktijk en geduld kunnen worden verlangd dat de meester van het microdissection-protocol beschreven, maar eenmaal onder de knie, kunnen via het protocol relatief snelle Isolatievan voornamelijk onbeschadigd netvlies.
Introduction
Het netvlies Drosophila bestaat uit ongeveer 750 ommatidia omringd door pigmentcellen gerangschikt in een honingraat rooster1,2,3,4. Elk ommatidium bevat acht fotoreceptor neuronen, vier lens-afscheidende cellen van de kegel en twee primaire pigmentcellen. Rondom elke ommatidium zijn pigment-producerende cellen van het lattice en zintuiglijke bristle groepen. Vanwege haar post mitotische aard en stereotiepe zeshoekige regeling biedt de Drosophila pop netvlies een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van morfogenetische processen, met inbegrip van cel adhesie5,6, 7,8,9,10 en apoptosis11,12,13,14,15.
Aantal gepubliceerde protocollen gebruiken luchtdruk uitpakken van oog-hersenen complexen van Drosophila poppen16,17,18. Het protocol beschreven hier in plaats daarvan maakt gebruik van microdissection tools om zorgvuldig en juist oog-hersenen complexen met als doel het verkrijgen van onbeschadigde retinale weefsel te isoleren. Dit is cruciaal als netvlies willen worden gebruikt voor morfologische, eiwit, of genexpressie analyseert omdat schade aan het netvlies kan resulteren in cellulaire stress of dood, die kan de cellulaire fenotype of gen expressie wijzigen. Bovendien na praktijk kunnen 6 tot 10 oog-hersenen complexen in 10 tot 15 min, vergemakkelijking van het doel van het minimaliseren van de variabiliteit in de leeftijd en ontwikkelingsstadium van ontleed oogweefsel worden geïsoleerd.
De fixatie, immunokleuring en geheel-koppelingsprotocol hieronder beschreven is geschikt voor de bereiding van Drosophila ogen voor fluorescent microscopie. Netvlies kunnen worden geïncubeerd met antilichamen gericht op proteïnen van belang. Bijvoorbeeld kunnen antistoffen tegen onderdelen van de kruising van de adherens worden gebruikt om het visualiseren van de apicale omtrek van cellen, zodat de kenmerken waaronder celtype, vorm en opstelling beoordeeld-19 worden kunnen. Voorafgaand aan de fixatie, kunnen ogen in plaats daarvan worden cleaved van de hersenen met het oog op de winning van proteïne voor westelijke analyse, of RNA voor gebruik in qRT-PCR of RNA-sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de weefsels voorbereiding
- Instellen van Drosophila kruist (zoals eerder beschreven20) of specifieke Drosophila stammen voor poppen van het gewenste genotype cultuur. Om ervoor te zorgen dat een groot aantal poppen zich toevallig voordoen, stellen deze vliegen culturen in tweevoud op voedselrijke voedsel media of standaard voedsel media royaal aangevuld met gist-plakken.
- Handhaven van Drosophila culturen bij 25 ° C. Voor kruisen met behulp van de UAS-GAL4 systeem, is GMR-GAL4 een ideale stuurprogramma uitgedrukt in larvale oog schijf cellen posterieure de morfogenetische furrow en in de hele pop ontwikkeling21,22,23, 24. de Kruis UAS-lacZ X GMR-GAL4 dient als een ideale besturingselement Kruis zoals het drijft expressie van het niet-endogene en inert β-galactosidase-eiwit.
- Gebruik het puntje van een bamboe spalk 6", die al natte met gedestilleerd water zachtjes heffen witte pre poppen (figuur 1B) van de kant van gezonde cultuur flesjes (figuur 1A) en de plaats in een 1,5 mL microcentrifuge buis (Figuur 1 c).
- Plaats de buizen in een plastic pipet tip doos samen met een klein stukje weefsel gedrenkt in gedestilleerd water te handhaven van de zaal bij voldoende vochtigheid aan de poppen beschermen tegen uitdroging (Figuur 1 d). Incubeer de poppen bij 25 ° C tot dissectie.
- Gebruik een droge 6" bamboe spalk om voorzichtig uitduwen de poppen van de buis van de microcentrifuge en op een zwarte ontrafeling van de schotel. Leg een vers stuk dubbelzijdige tape op de ontleden schotel uit de buurt van de poppen.
- Plaats de dorsale zijde van de poppen omhoog (dat wil zeggen, operculums naar boven, figuur 1B) met een paar pincet, zorgvuldig op de tape (figuur 2A). Zorg ervoor dat de poppen ook aan de tape voldoen.
Opmerking: Vocht over de pop zaak zal remmen veilige hechting aan de tape, in welk geval, laat de poppen te drogen alvorens op de dubbelzijdige tape.
2. dissectie van oog-hersenen complexen
- Gebruik pincet te verwijderen van de operculum van elke Verpopping (figuur 2C).
- Gebruik microdissection schaar om te slice of het pop geval van elke Verpopping opengesneden. Klep open de pop aanvraag te onthullen van de kop, borststuk en anterior abdominale segment, de beveiliging van de randen van de pop zaak naar de dubbelzijdige tape (figuur 2C).
Opmerking: Het is niet nodig om volledig onthullen de poppen. - De buik van elke Verpopping doorboren met een scherpe Tang, te begrijpen van het dier, en verwijder deze uit haar pop zaak (figuur 2C).
- Plaats de poppen op de zwarte dissectie schotel, uit de buurt van de tape, en bedek met ongeveer 400 µL van ijskoude fosfaat gebufferde-oplossing (PBS, pH 7.4).
- Elke Verpopping begrijpen door de buik met een tang, en met een microdissection schaar, maken een schone transversale cut door de gehele thorax, de verpopping snijden in de helft (figuur 2D).
- Verwijder de achterste overblijfsel van elk karkas van de PBS en zet aan de ene kant op de ontleden schotel (niet negeren, zie stap 3.2.1).
- Open met twee paar fijne pincet, de borstkas en het hoofd van elke Verpopping te onthullen het oog-hersenen complex (figuur 2E). Om dit te doen, pak de cut-randen van het epitheel van de thorax en geleidelijk scheuren om te openen de thorax en vervolgens hoofd capsule, bloot de oog-hersenen complex en omliggende vetweefsel.
- Zonder grijpen het weefsel, via pincet leiden het oog-hersenen complex uit de buurt van de restanten van de hoofd capsule of schep het oog-hersenen complex van de hoofd heen en weer geslingerd-open-capsule.
Opmerking: Het oog-hersenen complex is halter-vormige, naturel en meer doorschijnend dan het omliggende crème-gekleurde vet (figuur 2B, E). - Met een tang, verwijder zorgvuldig de meeste vet geassocieerd met de oog-hersenen complexen zonder het aanraken van het oogweefsel.
3. de verwerking van weefsels voor immunofluorescentie
- Het ontleden van ten minste 6-10 poppen als beschreven (stappen 2.1-2.9).
Opmerking: Drie tot vier onafhankelijke replicatieonderzoeken van elke dissectie neiging om voldoende gegevens om te testen een hypothese opleveren. -
Wassen en fixatie
- De tip van een P20 of P100 pipette uiteinde met een schone scheermesje te verhogen van de tip-opening tot ~ 1 mm straal en smeren door een mix van PBS en vet op en neer pipetteren knippen. Dit vet kan worden verkregen bij de karkas restanten verwijderd in stap 2.6.
- Breng de oog-hersenen complexen in ~ 400 µL van PBS in een 9-well glazen schotel, op ijs. Het condoom met Uiteinde en een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet gebruiken om te zetten.
Opmerking: Oog-hersenen complexen zal houden op unlubricated tips tijdens pipetteren en worden beschadigd of verloren gegaan. - Verwijder de resterende vet in verband met het oogweefsel door pipetteren de PBS omhoog en omlaag om het zachtjes swirl de oog-hersenen complexen. In dit en alle latere wassen stappen, niet direct Pipetteer oog-hersenen complexen op en neer zoals dit zal schade toebrengen aan de fragiele oogweefsel.
- Overdracht van de oog-hersenen complexen in een minimale volume (< 20 µL) van PBS in ten minste 250 µL van fixeerspray. Meng door pipetteren de oplossing op en neer. Incubeer gedurende 35 min, op ijs.
Opmerking: De dezelfde condoom met tip bereid in stap 3.1.1 kan worden gebruikt voor deze transfer. - Breng de oog-hersenen complexen in een goed met ~ 400 µL van PBS met de dezelfde Pipetteer tip. Meng door de oplossing op en neer pipetteren en incubeer gedurende 5-10 min op het ijs, om te wassen. Herhaal de stap van wassen ten minste tweemaal.
Opmerking: Oog-hersenen complexen kunnen worden gehandhaafd voor enkele uren in de laatste PBS wash, op ijs, of bij 4 ° C, voordat u verdergaat met stap 3.3.1.
-
Antilichaam kleuring
- Voor het blokkeren van het weefsel voorafgaand aan blootstelling aan antilichaam oplossingen, door het oog-hersenen complexen te overbrengen in ~ 400 µL van PBT. Gebruik het condoom met Uiteinde en een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet voor de overdracht. Incubeer gedurende 10 tot 60 min., op ijs.
- Bereid de oplossing van primair antilichaam door verdunning van de antilichamen van de geschikte in PBT. Omdat het oog-hersenen complexen worden geïncubeerd in 10 µL aliquots van antilichaam oplossing, zullen het volume bereid een kopie van 10.
- Aliquot 10 µL van antilichaam oplossing in een schone put voor een 72-well microwell tray (zie discussie).
- Snijd het puntje van een P10 pipette uiteinde met een schone scheermesje smeren door pipetting PBT omhoog en omlaag te verhogen van de tip-opening tot ~0.5 mm in straal.
- Overdracht van niet meer dan 5 oog-hersenen complexen, in een hoeveelheid < 3 µL van PBS, in elke 10 µL van antilichaam oplossing met een P10 lucht verplaatsing micropipet en de condoom met tip.
- Meng de antilichaam-oplossing waarbij de oplossing op en neer. Pipetteer de oog-hersenen complexen omhoog en omlaag niet zoals dit aan het weefsel schade zal.
- Om te minimaliseren van verdamping van de antilichaam-oplossing, plaatst u een klein stukje weefsel gedrenkt in gedestilleerd water in de lade, microwell en verzegel de lade (bijvoorbeeld met het deksel geleverd). Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
- Breng de oog-hersenen complexen uit de lade microwell in ~ 400 µL van PBT in een 9-welled glazen schotel, te wassen. Gebruik een P10 lucht verplaatsing micropipet en de PBT-gesmeerd tip (bereiden zoals beschreven in stap 3.3.4). Meng door pipetteren de oplossing op en neer. Incubeer gedurende 5-10 min op ijs.
- Herhaal de stap van wassen ten minste tweemaal. Gebruik een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet en de PBT-gesmeerd tip voor overdracht van de oog-hersenen-complexen tussen wassen oplossingen.
- Bereid de oplossing van secundair antilichaam door verder verdunnen van passende fluorophore-gelabeld secundaire antilichamen in PBT zoals vereist. 100 µL van secundair antilichaam oplossing volstaat per batch van 6-10 poppen. Aliquot de secundair antilichaam-oplossing in een schotel van de dissectie 9-welled glas.
- Breng de oog-hersenen complexen in secundair antilichaam oplossing. Gebruik een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet en de PBT-gesmeerd tip voor de overdracht.
- Incubeer de oog-hersenen complexen in secundair antilichaam oplossing voor 1-2 uur bij kamertemperatuur, of 3-5 uur bij 4 ° C. Om te voorkomen dat bleken van fluorophores door licht, hebben betrekking op de voorbereiding met folie.
Opmerking: Optimale duur van incubatie in secundair antilichaam oplossing kan verschillen naar gelang van de primaire en secundaire antilichamen gebruikt. - Breng de oog-hersenen complexen in ~ 400 µL van PBT in een 9-well glazen schotel, te wassen. Meng door pipetteren de oplossing op en neer. Incubeer gedurende 5-10 min op ijs. Deze wassen stap moet ten minste tweemaal worden herhaald.
-
Secundaire fixatie
- Voor een secundaire fixatie, de oog-hersenen complexen overdragen aan ten minste 200 µL van fixeer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur of 35 min bij 4 ° C.
Opmerking: Secundaire fixatie verstijft de oogweefsel, die montage (stap 3.5 helpt). - Gebruik een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet en de PBT-gesmeerd tip oog-hersenen complexen overbrengen naar ~ 400 µL van PBT in een 9-well glazen schotel, op ijs, te wassen voor 5 min.
- Herhaal de stap van wassen ten minste eenmaal.
- Gebruik een P20 of de P100 lucht verplaatsing micropipet en de PBT-gesmeerd tip om overdracht van de oog-hersenen complexen in ~ 400 µL van PBS in een 9-well glazen schotel, op ijs, te spoelen voor 1-2 min. houden het weefsel in beweging door pipetting PBS, maar niet het weefsel , op en neer om te voorkomen dat oog-hersenen complexen van regelen en vast te houden aan de glazen schotel tijdens PBS-spoelen.
- Voor een secundaire fixatie, de oog-hersenen complexen overdragen aan ten minste 200 µL van fixeer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur of 35 min bij 4 ° C.
-
Montage
- Breng de oog-hersenen complexen in ~ 200 µL media te monteren. Gebruik een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet en de PBT-gesmeerd tip om over te brengen van de oog-hersenen complexen. Het toestaan van het weefsel te equilibreer in montage van media voor 1-2 h.
- Breng een druppel van de µL 5-8 van verse montage media op een schone microscoopglaasje.
- Snijd een P10-tip met een schone scheermesje gebruiken van dit en een P10 lucht verplaatsing micropipet voor het overbrengen van de oog-hersenen complexen in 5-8 µL van de montage van de media in de daling van de media te monteren op de dia te verhogen van de tip-opening tot ~0.5 mm in straal.
- Gebruik twee wolfraam naalden te scheiden van de ogen van optische kwabben. PIN een oog-hersenen complex aan de dia met een stevige wolfraam naald en elk oog uit de buurt van de bijbehorende optic lobe snijd met een fijn wolfraam naald (figuur 2F).
- Gebruik de fijne wolfraam naald te manoeuvreren van elk van beide ogen op het oppervlak van het microscoopglaasje met het basale oppervlak van elk van beide ogen grenzend aan de dia. Zachtjes lager een schone cover-slip over het weefsel en veilig met nagellak.
Opmerking: De ogen op de dia te schikken zodat ze dicht bij elkaar of in een lijn zal vergemakkelijken latere microscopie. - Het imago van het netvlies met behulp van fluorescerende of confocal microscopie.
Opmerking: Dia's moeten worden opgeslagen bij 4 ° C of zelfs beeld onmiddellijk.
4. voorbereiding van oogweefsel voor het westelijke bevlekken:
- Ontleden van 10-16 poppen (stappen 2.1-2.9) met de volgende wijzigingen: a) verzamelen en ontleden de poppen in twee partijen, 10-15 minuten uit elkaar en b) ontleden in PBS aangevuld met protease en phosphatase inhibitors (PBS + pi).
- Overdracht van de complexen van de oog-hersenen met behulp van een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet en gesmeerd tip (bereid zoals in stap 3.2.1) in ~ 400 µL van PBS + pi in een 9-well glazen schotel, op ijs, te kort spoelen.
Opmerking: Deze condoom met tip kan worden gebruikt voor volgende stappen 4.3 en 4.4. - Herhaal de spoeling stap tweemaal.
- Breng alle oog-hersenen complexen in ~ 400 µL van ijs koud PBS + pi gedecanteerd op een schoon zwart ontleden schotel.
- Verwijder elk van beide ogen van de optische kwabben met behulp van een stevige wolfraam naald (om stabiele het oog-hersenen-complex) en een fijne scheermesje of microdissection scharen om netjes knippen elk van beide ogen toe uit de optiek kwab.
Opmerking: Ogen 'sticky' zijn in dit stadium en licht kunnen houden aan de ontleden schotel. Dit is voordelig omdat het de opheffing vergemakkelijkt van de ogen van de optische kwabben helpen kan (zie discussie). - 'Vegen' alle ogen in een 'stapel' in de PBS + pi op de ontleden schotel, met een lemmet van een fijn paar pincet.
- Knip een puntje van de P10 met een schone scheermesje te verbreden van de tip-opening tot ~0.5 mm in straal en smeer het uiteinde-interieur door pipetting Western weefsel Lysis Buffer (WTLB) op en neer.
- Breng de oog-hersenen complexen in 5 µL van PBS + pi in een 500 µL microcentrifuge buis. Gebruik dit condoom met Uiteinde en een P10 lucht verplaatsing micropipet om te voltooien van de overdracht.
- Plaats de microcentrifuge buis op ijs. Voeg 1 deel (5 µL) van WTLB aan het monster, en 10 µL van 2 x geconcentreerd eiwit monster buffer (of 2,5 µL van 5 x geconcentreerd eiwit monster buffer). Meng door te onttrekken.
- Vortex de microcentrifuge tube kort en spin omlaag monster met behulp van een desktop mini centrifuge.
- Het bewaren van het monster bij-20 ° C tot analyse. Analyseren met standaardprotocollen.
5. bereiding van oogweefsel RNA extractie:
- Het dragen van handschoenen, schone benchtop, Microscoop, dissectie tools en zwarte ontrafeling van schotel eerst met 70% ethanol en vervolgens RNase decontaminatie reagens. Laten drogen.
- Ontleden van 30-40 poppen als beschreven (stappen 2.1-2.9) met de volgende wijzigingen: een) verzamelen en ontleden van 6 tot en met 8 poppen in batches, 15-20 min uit elkaar; b) ontleden in nuclease-vrije PBS en c) isoleren van elke batch van ogen afzonderlijk maar accumuleren alle retinale weefsel in de dezelfde microcentrifuge buis (stap 5.5).
Opmerking: Met twee mensen gelijktijdig ontleden efficiënte isolatie van goede oogweefsel zal versnellen. - Voor elke partij isoleren de oog-hersenen complexen (stappen 2.1-2.9) en overdracht in ~ 400 µL van PBS nuclease-gratis in een 9-well glazen schotel te spoelen in het kort op het ijs, met behulp van een P20 of P100 lucht verplaatsing micropipet en condoom met tip (opgesteld zoals beschreven in stap 3.1.2).
Opmerking: Deze condoom met tip kan worden gebruikt voor volgende stappen 5.4, 5.5 en 5,8. - Herhaal de spoeling stap tweemaal.
- Breng de oog-hersenen complexen in een verse 400 µL druppel ijskoud nuclease-vrije PBS op een schone zwart ontrafeling van de schotel.
- Verwijder elk van beide ogen van de optische kwabben met behulp van een stevige wolfraam naald (om stabiele de complexe oog-hersenen) en een fijne scheermesje of microdissection scharen om netjes knippen elk van beide ogen toe uit de optiek kwab.
Opmerking: Ogen 'sticky' zijn in dit stadium en licht kunnen houden aan de ontleden schotel. Dit is voordelig omdat het de opheffing vergemakkelijkt van de ogen van de optische kwabben helpen kan (zie discussie). - 'Sweep' alle ogen in een 'stapel' in de nuclease-vrije PBS op de ontleden schotel, met een lemmet van een fijn paar pincet.
- De ogen overbrengen in een steriele RNase-vrije microcentrifuge buis en flash-freeze in vloeibare stikstof.
- Herhaal dissectie (stappen 5.3-5.8) van elke batch van poppen. Breng elke batch van ogen in de dezelfde microcentrifuge buis die in vloeibare stikstof (stap 5.5) te accumuleren alle ogen in één buis is gehandhaafd.
- Het bewaren van de monsters bij-80 ° C tot RNA extractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De pop eye is een gemakkelijk toegankelijke weefsel dat als een uitstekend model dient te onderzoeken van ontwikkelingsstoornissen processen dat station morfogenese. Hier, we netvlies hebben ontleed en immunofluorescentie gebruikt voor het detecteren van de apicale adherens-verbindingen (figuur 3A, C) of de Dcp-1 caspase (figuur 3D) dat wordt geactiveerd tijdens apoptosis (Figuur 3)25. Deze benaderingen kunnen men duidelijk cellen te observeren tijdens belangrijke morfogenetische processen, met inbegrip van de aanwerving en de morfogenese van primaire cellen (vanaf 18 h APF), de bekomt voor lattice cellen rond elke ommatidium (18-24 h APF), de oprichting van de tertiaire niche 21-24 h APF, veranderingen in de celgrootte en vorm (van 18 h tot 40 h APF), en apoptose (van 18 tot ~ 33 h APF). De timing van deze morfogenetische gebeurtenissen is afhankelijk van de temperatuur en dus bescheiden in reactie op kleine verschillen in de incubator temperaturen in verschillende laboratorium instellingen zal variëren. Echter door ongeveer 40 h APF, de definitieve rangschikking van cellen wordt gewoonlijk bereikt (figuur 3B, C) en dit is een ideale leeftijd waarop te beoordelen van de gevolgen van genetische mutatie of wijziging van de genexpressie. Bijvoorbeeld volgende ectopische expressie van Diap1, een kern-remmer van apoptosis caspase activering (Figuur 3 c)26, onze aanpak maakt het mogelijk om het kwantificeren van de daaruit voortvloeiende stijging van het aantal lattice cellen ten opzichte van een besturingselement GMR > lacZ netvlies. Een kan ook gemakkelijk apoptosis beoordelen meer direct door met behulp van het antilichaam van de anti-Dcp-1 of andere benaderingen te detecteren stervende cellen (figuur 3D).
Oog lysate kan ondervraagd worden met behulp van westerse analyse om te bepalen van de aanwezigheid en/of de relatieve expressie van proteïnen van belang. Hier tonen we de detectie van DE-cadherine, de belangrijkste component van de kruispunten van de adherens, in het wild type Kanton S netvlies ontleed bij 21 en 40 h APF ogen (figuur 4A). Kwantificering van dit monster westelijke vlek (rechts, figuur 4A) is gebleken dat de relatieve uitdrukking van DE-cadherine, niet onderling aanzienlijke verschillen op deze twee keer-punten, wanneer de intensiteit van de band is genormaliseerd volgens uitdrukking van GAPDH (een kern metabole enzym). Dergelijke analyses zou meestal worden uitgevoerd in drievoudige in plaats van alleen een keer, zoals hier wordt weergegeven.
Het is essentieel om te isoleren van hoge zuiverheid mRNA van Drosophila pop netvlies als iemands beoogt te analyseren met behulp van geavanceerde sequencing toepassingen (bijv. Next-Gen, RNA-seq) genexpressie. We hebben gevonden dat het ontleden van meer dan 60 ogen per genotype of een experimentele voorwaarde optimaal is als je doel is om te isoleren > 1 mg van kwalitatief hoogwaardige RNA (figuur 4B). Hier, laten we een voorbeeld van een extinctie spectra van een RNA geïsoleerd van 57 wild type Kanton S ogen, ontleed bij 40 h APF (figuur 4B, bovenste paneel). De absorptie van de piek bij 260 nm komt overeen met de golflengte van de extinctie van RNA. Ook presenteren we een tabel die als gevolg van de opbrengst van RNA en A260/A280 en A260/A230 zuiverheid-ratio's van zes RNA samples, verzamelden zich bij 21 h of 40 h APF. Deze gegevens geven subtiele verschillen in RNA opleveren wanneer de extractie van RNA.
Figuur 1 : Selectie en de cultuur van poppen voor dissectie. (A) dwalen derde larvale instar (L3) larven en poppen zoeken langs de zijkanten van gezonde Drosophila culturen. (B) pre poppen kunnen worden geïdentificeerd door hun doorschijnende witte kleur als pigment nog heeft moeten worden gegenereerd in de pop beschermkast. Door anterieure en dorsale-ventrale as van de verpopping worden in blauw weergegeven. Een vochtige bamboe spalk wordt gebruikt om te verjagen en pre poppen van de flacon muren te kiezen. (C) poppen worden geplaatst binnen 1,5 mL microcentrifuge buizen die naar behoren zijn geëtiketteerd (genotype, datum van afneming en tijdstip van de winning) en (D) binnen een bevochtigde kamer samengesteld uit een lege pipet-tip doos gekweekt. Vochtigheid wordt onderhouden door het plaatsen van een stukje vochtige weefsel in de doos. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Ontrafeling van het pop oog. (A) poppen dubbelzijdige tape op een zwart ontrafeling van de schotel in acht worden genomen. Dorsal, anterior en posterior coördinaten zijn aangegeven in blauw. (B) te isoleren van de oog-hersenen complexen (een honkslag een is hier afgebeeld), (C) de verpopping wordt eerst verwijderd uit haar pop zaak. Belangrijke stappen in dit proces worden weergegeven. Rode lijnen geven aan waar te scheuren en de pop transactieprobleem nadat de operculum is verwijderd. De poppen worden dan verwijderd uit de gescheurde pop zaak met een tang. (D) een blootgestelde verpopping is het eerste snijdt langs de thorax met microdissection schaar (positie die is aangegeven met rode stippellijn) en het hoofd epithelium vervolgens voorzichtig heen en weer geslingerd open (rode pijlen), zoals in (E) te onthullen het ondoorzichtige oog-hersenen complex. (F) na incubatie met passende antilichamen, netvlies van het oog-hersenen complexen worden gesneden. Belangrijke stappen in dit proces worden weergegeven. De oog-hersenen is gestabiliseerd met een stevige wolfraam naald (links) en het netvlies verwijderd met een fijne wolfraam naald (rechts). Voor eiwitten en RNA analyses, nietgefixeerde netvlies kunnen netjes worden gesneden uit optische kwabben met behulp van een fijne scheermesje of microdissection schaar, in plaats van een fijne wolfraam naald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunofluorescentie van het pop oog. (A) antilichamen tegen DE-cadherine label apicale adherens kruispunten van cellen van het pop oog. Alle afbeeldingen in deelvenster A werden verzameld in de regio Midden een vlek met behulp van de confocal microscopie, minimaal bewerkt met een beeld processing software, en worden gepresenteerd op dezelfde schaal (schaal bar = 5 µm). Opmerking groei en opnieuw rangschikken van de cellen vanaf 18 h APF tot 27 h APF. (B) Cartoon van de apicale weergave van een enkele volledig-patroon ommatidium bij 40 h APF (links) en een ommatidium in doorsnede. Celtypes zijn vergelijkende zoals vermeld in de sleutel. De researchdieren zijn begraven onder de oppervlakte van de pseudostratified neuroepithlium en omgeven door kegel en pigment cellen. Drie groepen van de borstelharen omringen elke ommatidium. (C) kleine regio's van het netvlies van een controle in welke lacZ werd uitgedrukt (links) of Diap1 (rechts) voor de remming van apoptosis van secundaire en tertiaire pigmentcellen. Etikettering van adherens aansluitingen met anti-DE-cadherine maakt de analyse van celaantal, regeling en vorm. Beelden werden gemaakt met behulp van standaard fluorescent microscopie. (D) een hele netvlies geïncubeerd met antilichamen tegen geactiveerd Dcp-1, een caspase geactiveerd tijdens apoptosis, die pruimen van talrijke cellen uit het oog. Opname werd gemaakt met behulp van de confocal microscopie. Witte gestippelde lijn schetst het oog. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Eiwit en gen-expressie analyses van de pop oog. (A) westelijke vlek (links) van 28 ogen ontleed bij 21 h APF of 40 h APF, gesondeerd met antilichamen aan de CAD- en, als een controle-laden, GAPDH. Analyses van eiwit band intensiteiten (rechts) onthult vergelijkbare concentraties van ambtshalve cad aanwezig in deze groepen van netvlies, ten opzichte van GAPDH. (B) één extinctie spectrum van een RNA monster geëxtraheerd uit Kanton S netvlies ontleed bij 40 h APF (boven). Opmerking extinctie piek op 260 nm. Tabel voor het documenteren van de verhoudingen van het bedrag en de zuiverheid van RNA geëxtraheerd uit Kanton S pop netvlies geïsoleerd bij 21 en 40 h APF (onder). Deze gegevens komen voort uit drie onafhankelijke sample sets. Poppen voor elke steekproef set waren aan de orde gesteld en geïncubeerd in dezelfde omstandigheden en ontleed op dezelfde dag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode van Drosophila pop oog dissectie hier beschreven staat voor de isolatie van 6 tot en met 10 oog-hersenen complexen binnen 10 tot 15 min. Echter, geduld en oefening zijn onontbeerlijk voor de dissectie techniek beheersen en verbeteren van de kwaliteit en de snelheid van dissecties. Ditmaal van korte dissectie zorgt ervoor dat elk oog ongeveer de zelfde ontwikkelingsstadium, vermindering van de variabiliteit in het fenotype of gen expressie van het netvlies in een gegevensverzameling. Terwijl alternatieve protocollen minder praktijk te beheersen vereisen kunnen, is ons protocol ontworpen om te isoleren methodisch delicate retinale weefsel terwijl het minimaliseren van het risico op scheuren of scheren, omdat schade aan het oog kan stress traject activering veroorzaken of zelfs de dood van de cel. Wij adviseren beginners aan eerste kapitein de dissectie van poppen gekweekt tot 40 h APF voordat u probeert te ontleden jongere ogen. Het is raadzaam de oprichting repliceren kruist voor alle experimenten (stap 1.1), die zorgen zal dat er altijd voldoende poppen beschikbaar voor collectie (stap 1.3 zijn). Netvlies kunnen worden ontleed bij allerlei timepoints tijdens pop ontwikkeling, afhankelijk van de verschillende morfogenetische gebeurtenissen van belang zijn voor de onderzoeker. Deze kunnen omvatten de aanwerving en de morfogenese van primaire cellen (vanaf 18 h APF), bekomt van lattice cellen (18-24 h APF), inrichting van de tertiaire niche (21-24 h APF), veranderingen in de celgrootte en vorm (van 18 h tot 40 h APF) en apoptosis (van 18 tot ~ 33 h APF) (Figuur 3A).
Als tijdens de eerste opening van de pop geval (stap 2.2, figuur 2C), de thorax van een verpopping is doorboord, moet de onderzoeker wel om door te gaan met de dissectie. Echter, als het hoofd is in eerste instantie doorboord, uitpakken onbeschadigd oog-hersenen complexen kan moeilijk worden. Wanneer het verwijderen van een Verpopping uit haar pop zaak (stap 2.3, figuur 2C, rechter paneel), kan de abdominale pop geval soms verjagen van de dubbelzijdige tape en blijven gewikkeld over de verpopping de buik. Dit is onwaarschijnlijk een belemmering, hoewel de verpopping kan drijven wanneer omringd door PBS tot de buik en aangesloten pop geval zijn gescheiden van de verpopping (stap 2.6). Voor het behoud van de integriteit van het netvlies weefsel, is het noodzakelijk dat het vaste of zo spoedig mogelijk na de eerste lekke band van de poppen bevroren. Daarnaast gebruik ijskoud oplossingen en onderhoud van het weefsel op het ijs (of bij 4 ° C), waar mogelijk in het gehele protocol behouden zal de weefsel- en cellulaire integriteit, wat leidt tot betere immunofluorescentie, eiwit-analyse of RNA-analyse. Voor de laatste toepassingen, is het belangrijk om alle hersenen en vetweefsel van de ogen als deze weefsels zal besmetten analyses (stap 2.9 en 4.3 of 5.4).
Het complex pop oog-hersenen kan voldoen aan de unlubricated Pipetteer tips, glas en dissectie tools niet vastgelegde of tijdens PBS wast/gespoeld, wat leidt tot weefselbeschadiging. Om dit te voorkomen, raden wij nauwgezet smering van Pipetteer tips en niet 9-well glazen afwassen met ethanol (afwasmiddel moet ook worden vermeden). In plaats daarvan gewoon schoon glas gerechten met gedestilleerd H2O en smeren, indien nodig, met een PBT spoeling voorafgaand aan gebruik. Dissectie pincet, schaar en naalden moeten ook vooral gereinigd worden met gedestilleerd H2O, behalve bij de voorbereiding van deze voor RNA-extractie dissecties (stap 5.1). Lichte hechting tussen het netvlies en glas Microscoop dia's kan echter helpen bij openspringen van ogen en plaats deze op dia's wanneer het scheiden van ogen van optische kwabben tijdens montage (stap 3.5.4 en 3.5.5). Ook lichte hechting van ogen zwart ontrafeling van gerechten kan worden gebruikt om plat en zeer licht stretch analyseert het weefsel dat schone versnijden van oog-optic kwab verbindingen vergemakkelijkt wanneer isoleren netvlies voor eiwit of RNA (stap 4,5 en 5.6). We hebben gevonden dat microdissection schaar of een fijne scheermesje zijn uitstekende tools om snel en netjes klieven nietgefixeerde ogen van optische kwabben.
Tijdens de primair antilichaam kleuring, in plaats van het broeden van oog-hersenen complexen in 72-well micro-well laden (stap 3.3.5), kan een 9-well glazen schotel in plaats daarvan worden gebruikt. Om te voorkomen dat 's nachts de verdamping van de antilichaam-oplossing, moet de glazen schotel putjes met een cover slip of dia van het GLB. Deze aanpak vergt echter 40-50 µL van primair antilichaam oplossing voor een partij van 6-10 oog-hersenen complexen geïncubeerd in een put van 9-well glazen schotel, in plaats van 20 µL van primair antilichaam oplossing verdeeld over 2 putten van de lade van een 72-well micro-well.
Secundaire fixatie van het oog-hersenen complexen (stap 3.4) vóór montage ogen op Microscoop dia's (stap 3.5) zal het weefsel marginaal opstijven, zodat is het makkelijker om de ogen van optische kwabben klieven en de ogen minder waarschijnlijk zijn te vouwen of houden aan dissectie naalden. Na een 1-2 h incubatie in montage medium (stap 3.5.1) worden de oog-hersenen complexen enigszins ondoorzichtig en dus gemakkelijker te zien terwijl montage. Bovendien, na 1-2 h in montage medium, zal meeste secundaire antilichamen worden voldoende beschermd tegen foto-bleken tijdens fluorescerende imaging. Netvlies overnachting in montage media aan het broeden voordat montage wordt niet aanbevolen omdat dit netvlies zachte maakt, ontkenning van het effect van de verstijving van secundaire fixatie.
Voor westerse analyses, de lysate van ten minste 20 ogen moet betrouwbaar detecteren eiwitten met behulp van antilichamen die krachtig Drosophila eiwitten (bijvoorbeeld figuur 4A herkennen). Niettemin, kan een groter aantal ogen worden verlangd als er lage expressie van de doel-proteïne van belang is. Als lysis van het weefsel voor het latere westelijke bevlekken is onvolledig (stap 4,7), de hoeveelheid WTLB toegevoegd aan het monster marginaal kan worden verhoogd en de hoeveelheid geconcentreerde steekproef buffer aangepast (stap 4.9). Voor RNA extractie, snelle dissectie van een aanzienlijk aantal ogen kan worden verlangd als het doel is om te isoleren van een grote hoeveelheid hoogwaardige RNA (stap 5.2, Zie figuur 4B). Dit potentiële nadeel kan worden overwonnen als twee wetenschappers die onder de knie hebben Drosophila pop-eye dissectie samenwerken om deze grote aantallen vliegen netvlies tegelijk te ontleden. Echter, het totale bedrag van RNA vereist zal afhangen van de eisen van de instelling of het uitvoeren van de analyse van het RNA, het type van RNA analyse of sequencing, faciliteit en de RNA extractie kit die wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Zack Drum en onze recensenten voor nuttige opmerkingen op het manuscript. Dit werk werd gesteund door R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
