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Developmental Biology

Immunohistochemistry, पश्चिमी विश्लेषण, और आरएनए अलगाव के लिए Drosophila प्यूपल रेटिना का विच्छेदन

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/59299
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Wesleyan University

Summary

इस कागज immunohistochemistry, पश्चिमी विश्लेषण, और आरएनए निष्कर्षण के लिए ऊतक के प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल के साथ साथ Drosophila प्यूपल retinas विदारक के लिए एक शल्य चिकित्सा पद्धति प्रस्तुत करता है ।

Abstract

ड्रोसोफिला प्यूपल रेटिना विकास के दौरान मॉरफोजेनेटिक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करता है । इस पत्र में, हम नाजुक Drosophila प्यूपल रेटिना के विच्छेदन के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हमारे शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण आसानी से उपलब्ध microdissection उपकरण का इस्तेमाल करने के लिए खुला प्यूपे और ठीक आंख मस्तिष्क परिसरों निकालने । ये तय किया जा सकता है, immunohistochemistry के अधीन है, और retinas तो माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार और imaged अगर लक्ष्य सेलुलर या subcellular संरचनाओं का पता लगाने के लिए है । वैकल्पिक रूप से, अनिर्धारित retinas मस्तिष्क के ऊतकों से अलग किया जा सकता है, उचित बफ़र्स में लीजड ड और प्रोटीन जेल ट्रो या mrna निष्कर्षण के लिए उपयोग (प्रोटीन या जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए, क्रमशः) । महत्वपूर्ण अभ्यास और धैर्य का वर्णन microdissection प्रोटोकॉल मास्टर करने के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन एक बार महारत हासिल है, प्रोटोकॉल मुख्य रूप से अक्षतिग्रस्त retinas के अपेक्षाकृत जल्दी अलगाव सक्षम बनाता है ।

Introduction

Drosophila रेटिना एक छत्ते जाली1,2,3,4में व्यवस्थित वर्णक कोशिकाओं से घिरा लगभग ७५० ommatidia से बना है । प्रत्येक नेत्रांशक में आठ फोटोरिसेप्टर ंयूरॉंस, चार लेंस स्राटिंग शंकु कोशिकाओं, और दो प्राथमिक वर्णक कोशिकाओं शामिल हैं । प्रत्येक नेत्रांशक आसपास वर्णक-जाली कोशिकाओं और संवेदी बाल खड़े समूहों का उत्पादन कर रहे हैं । अपनी पोस्ट-मिटिक प्रकृति और बाहुबली हेक्सागोनल व्यवस्था के कारण, ड्रोसोफिला प्यूपल रेटिना कोशिका आसंजन5,6सहित संरचनाविकासी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करता है, 7,8,9,10 और अपोप्टोसिस11,12,13,14,15।

कई प्रकाशित प्रोटोकॉल हवा के दबाव का उपयोग करने के लिए आंख निकालने drosophila प्यूपा16,17,18से मस्तिष्क परिसरों । प्रोटोकॉल यहां वर्णित बजाय microdissection उपकरण का इस्तेमाल करने के लिए ध्यान से और ठीक आंख को अलग-अक्षतिग्रस्त रेटिना ऊतक प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ मस्तिष्क परिसरों । यह महत्वपूर्ण है अगर retinas को morphological, प्रोटीन, या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा रहा है के बाद से रेटिना को नुकसान सेलुलर तनाव या मौत है, जो सेलुलर phenotype या जीन अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकते में परिणाम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, अभ्यास के बाद, 6 से 10 आंख मस्तिष्क परिसरों 10 से 15 मिनट में अलग किया जा सकता है, उम्र में परिवर्तनशीलता को ंयूनतम करने के लक्ष्य को सुविधाजनक बनाने और विच्छेद नेत्र ऊतक के विकासात्मक चरण ।

निर्धारण, immunostaining, और पूरे-माउंट प्रोटोकॉल नीचे वर्णित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए Drosophila आंखों की तैयारी के लिए उपयुक्त है । Retinas एंटीबॉडी के साथ इंयूबेटेड किया जा सकता है ब्याज के प्रोटीन लक्ष्यीकरण । उदाहरण के लिए, संधि घटकों का पालन करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं की अंतिम परिधि की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है ताकि कोशिका प्रकार, आकृति और व्यवस्थासहित विशेषताओं का मूल्यांकन किया जा सके । निर्धारण करने से पहले, आंखों के बजाय qRT-पीसीआर या आरएनए अनुक्रमण में उपयोग के लिए पश्चिमी विश्लेषण, या आरएनए के लिए प्रोटीन निकालने के उद्देश्य के लिए मस्तिष्क से cleaved किया जा सकता है ।

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Protocol

1. ऊतक तैयारी

  1. drosophila की स्थापना को पार (पहले20वर्णित के रूप में) या संस्कृति विशिष्ट drosophila उपभेदों वांछित जीनोटाइप के प्यूपे प्राप्त करने के लिए । यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्यूपे की एक बड़ी संख्या घुमते हुए उभरने, पोषक तत्वों से भरपूर खाद्य मीडिया या मानक खाद्य मीडिया उदारता खमीर के साथ पूरक पर डुप्लिकेट में इन मक्खी संस्कृतियों की स्थापना पेस्ट ।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस पर Drosophila संस्कृतियों को बनाए रखने । यूएएस-GAL4 प्रणाली का उपयोग पार करने के लिए, Gmr-GAL4 एक आदर्श लार्वा नेत्र डिस्क कोशिकाओं में व्यक्त की है, जो मॉर्फोजेनेटिक फ़रो के पीछे और प्यूपल डेवलपमेंट के दौरान21,22,23, 24. क्रॉस यूएएस-Lacz X gmr-GAL4 एक आदर्श नियंत्रण क्रॉस के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह गैर-अंतर्जात और अयुक्त β-गैलेक्टोसिडेस प्रोटीन की अभिव्यक्ति चलाता है ।
  3. एक 6 "बांस खपच्ची कि आसुत पानी के साथ गीला किया गया है की नोक का प्रयोग करें धीरे सफेद पूर्व-pupae (चित्रा 1b) स्वस्थ संस्कृति शीशियों की ओर से लिफ्ट (चित्रा 1a) और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह (चित्रा 1c) ।
  4. एक प्लास्टिक पिपेट टिप बॉक्स में ट्यूबों जगह आसुत पानी में लथपथ ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ पर्याप्त नमी पर कक्ष बनाए रखने के लिए सुखाना से प्यूपे की रक्षा (चित्रा 1 डी) । प्यूपाए को विच्छेदन तक 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं ।
  5. एक सूखी 6 "बांस खपच्ची का प्रयोग करने के लिए धीरे से microcentrifuge ट्यूब से बाहर प्यूपे धक्का और एक काले विदारक पकवान पर । पुपे से दूर विदारक पकवान पर दोहरे पक्षीय टेप का एक नया टुकड़ा रखना ।
  6. forceps की एक जोड़ी का उपयोग कर, ध्यान से प्यूपे पृष्ठीय ओर जगह (यानी, operculums ऊपर का सामना करना पड़, चित्र 1b) टेप पर (चित्रा 2a) । सुनिश्चित करें कि प्यूपे टेप करने के लिए अच्छी तरह से पालन ।
    नोट: कोशित मामले पर नमी टेप करने के लिए सुरक्षित आसंजन को रोकना होगा, जो मामले में, डबल तरफा टेप पर रखने से पहले प्यूपे हवा सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं ।

2. आंख की विच्छेदन-मस्तिष्क परिसरों

  1. प्रत्येक प्यूपा के ऑपरक्यूलम को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें (चित्र 2c) ।
  2. प्रत्येक प्यूपा के प्यूपल केस को खोलने के लिए माइक्रोडिस्सेक्शन कैंची का प्रयोग करें । प्रालंब सिर, वक्ष, और पूर्वकाल उदर खंड को प्रकट करने के लिए पुपल के मामले को खोलने के लिए, पुपल मामले के किनारों को दोहरा-पक्षीय टेप को सुरक्षित (चित्र 2c) ।
    नोट: यह आवश्यक नहीं है पूरी तरह से pupae प्रकट करने के लिए ।
  3. पियर्स प्रत्येक प्यूपा के पेट तेज forceps के साथ, पशु समझ, और इसे अपने कोशित मामले से हटाने (चित्र 2c) ।
  4. काली विच्छेदन पकवान पर प्यूपे प्लेस, टेप से दूर है, और बर्फ के बारे में ४०० μl के साथ कवर-ठंडा फॉस्फेट-buffered-समाधान (pbs, पीएच ७.४) ।
  5. संदंश के साथ पेट से प्रत्येक प्यूपा समझ, और microdissection कैंची के साथ, एक साफ पार-पूरी छाती के माध्यम से सेक्शनल कटौती करते हैं, आधा में प्यूपा काटने (चित्रा 2d) ।
  6. पीबीएस से प्रत्येक व्यक्ति के पीछे अवशेष निकालें और विदारक पकवान पर एक तरफ करने के लिए डाल (त्याग नहीं करते, 3.2.1 कदम देखें) ।
  7. ठीक forceps के दो जोड़े का उपयोग करना, आंख मस्तिष्क परिसर (चित्रा 2E) प्रकट करने के लिए प्रत्येक प्यूपा के वक्ष और सिर खुला । ऐसा करने के लिए, वक्ष उपकला के कट-किनारों को काबू में और धीरे से छाती और फिर सिर कैप्सूल खोलने के लिए आंसू, आंख मस्तिष्क जटिल और आसपास के वसा ऊतक को उजागर ।
  8. ऊतक लोभी के बिना, आंख-मस्तिष्क परिसर सिर कैप्सूल के अवशेष से दूर मार्गदर्शन करने के लिए संदंश का उपयोग करें या फटे खुले सिर कैप्सूल से आँख मस्तिष्क परिसर स्कूप.
    नोट: आंख मस्तिष्क परिसर dumbbell के आकार का है, बंद सफेद, और आसपास के क्रीम रंग का वसा से अधिक पारभासी (चित्रा 2B, ई) ।
  9. संदंश के साथ, ध्यान से आंख के ऊतकों को छूने के बिना आंख मस्तिष्क परिसरों के साथ जुड़े सबसे वसा को हटा दें ।

3. इमयूनोफ्लोरेंस के लिए ऊतक के प्रसंस्करण

  1. (चरण 2.1-2.9) के रूप में वर्णित कम से कम 6-10 प्यूपे काटना ।
    नोट: प्रत्येक विच्छेदन के तीन से चार स्वतंत्र प्रतिकृति एक परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त डेटा उपज करते हैं ।
  2. धुलाई और स्थिरीकरण
    1. एक P20 या P100 पिपेट टिप की नोक को बढ़ाने के लिए एक साफ उरेर ब्लेड के साथ कट ~ 1 मिमी त्रिज्या में और PBS और वसा का मिश्रण और ऊपर और नीचे से चिकनाना को चिकना । यह वसा चरण २.६ में निकाले गए लोथ अवशेष से प्राप्त किया जा सकता है ।
    2. नेत्र मस्तिष्क परिसरों में एक 9 में PBS के ~ ४०० μL हस्तांतरण-अच्छी तरह से गिलास पकवान, बर्फ पर । हस्तांतरण करने के लिए lubricated टिप और एक P20 या P100 एयर विस्थापन micropipette का उपयोग करें ।
      ध्यान दें: नेत्र-मस्तिष्क परिसरों को पाइपयुक्त करने के दौरान और क्षतिग्रस्त या खो unlubricated सुझावों का पालन करेंगे ।
    3. PBS को पिख्ता करके आँख के ऊतकों से संबंधित बची हुई चर्बी को हटाकर धीरे से आँख-मस्तिष्क परिसरों को घूमता है । इस में और सभी बाद धोने कदम, सीधे नहीं पिपेट आंख मस्तिष्क परिसरों ऊपर और नीचे के रूप में इस नाजुक आंख ऊतक को नुकसान होगा ।
    4. नेत्र-मस्तिष्क परिसरों को एक न्यूनतम मात्रा (< 20 μL) में पीबीएस के अंतरण को कम से २५० μL की फिक्टिव में । घोल को ऊपर और नीचे से पिख्ता करके मिक्स करें । ३५ मिनट के लिए इनसेबेट, बर्फ पर ।
      नोट: एक ही lubricated कदम 3.1.1 में तैयार की युक्ति इस हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    5. एक ही पिपेट टिप के साथ, एक अच्छी तरह से युक्त में आंख मस्तिष्क परिसरों हस्तांतरण ~ ४०० μL PBS. ऊपर और नीचे और 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते, धोने के लिए समाधान pipetting द्वारा मिक्स । वाशिंग स्टेप को कम से दो बार दोहराएं ।
      नोट: आंख मस्तिष्क परिसरों के लिए अंतिम PBS धोने में कई घंटे के लिए बनाए रखा जा सकता है, बर्फ पर, या 4 ° c पर, 3.3.1 कदम आगे बढ़ने से पहले.
  3. प्रतिदेह अभिरंजक
    1. एंटीबॉडी समाधानों के लिए जोखिम से पहले ऊतक ब्लॉक करने के लिए, नेत्र मस्तिष्क परिसरों को PBT के ~ ४०० μL हस्तांतरण । हस्तांतरण के लिए lubricated टिप और एक P20 या P100 एयर विस्थापन micropipette का प्रयोग करें । 10 से ६० मिनट के लिए, बर्फ पर सेते ।
    2. पीबीटी में उपयुक्त एंटीबॉडी को हल्का करके प्राथमिक एंटीबॉडी सॉल्यूशन तैयार करें । आंख के बाद से मस्तिष्क परिसरों एंटीबॉडी समाधान के 10 μL aliquots में इनक्बाटेड हैं, तैयार की मात्रा 10 की एक प्रतिकृति हो जाएगा ।
    3. एक ७२-अच्छी तरह से microwell ट्रे (चर्चा देखें) के एक साफ अच्छी तरह से एंटीबॉडी समाधान के 10 μL Aliquot ।
    4. एक साफ उरेर ब्लेड के साथ एक P10 पिपेट टिप की नोक में कटौती करने के लिए टिप खोलने के लिए ~ त्रिज्या में ~ ०.५ मिमी और PBT ऊपर और नीचे पाइपयुक्त द्वारा चिकनाना ।
    5. कोई अधिक से अधिक 5 आंख मस्तिष्क परिसरों, PBS के 3 μL < की मात्रा में, एंटीबॉडी समाधान के प्रत्येक 10 μL अच्छी तरह से एक P10 हवा विस्थापन micropipette और lubricated टिप का उपयोग कर में स्थानांतरण ।
    6. समाधान को ऊपर और नीचे पिख्ता करके एंटीबॉडी समाधान को समरूप करें । आंख-मस्तिष्क परिसरों को ऊपर और नीचे पिपेट न करें क्योंकि इससे ऊतक को नुकसान होगा ।
    7. एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण को कम करने के लिए, microwell ट्रे में आसुत पानी में लथपथ ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा जगह और ट्रे मुहर (उदाहरण के लिए, प्रदान की ढक्कन के साथ) । 4 ° c पर रातोंरात सेते ।
    8. आंख-मस्तिष्क परिसरों को माइक्रोवेल ट्रे से एक 9 में पीबीटी के ~ ४०० μL में, धोने के लिए पडे काँच के व्यंजन में अंतरण करें । एक P10 एयर विस्थापन micropipette और PBT-lubricated टिप का प्रयोग करें (चरण 3.3.4 में वर्णित के रूप में तैयार). घोल को ऊपर और नीचे से पिख्ता करके मिक्स करें । बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए इनसेबेट ।
    9. वाशिंग स्टेप को कम से दो बार दोहराएं । धोने के समाधान के बीच आंख मस्तिष्क परिसरों के हस्तांतरण के लिए एक P20 या P100 एयर विस्थापन micropipette और PBT-lubricated टिप का प्रयोग करें ।
    10. आवश्यक के रूप में PBT में उपयुक्त फ्लोटोफोर-टैग द्वितीयक एंटीबॉडी को हल्का करके द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के १०० μL 6-10 pupae के प्रति बैच पर्याप्त है । एक 9 में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान Aliquot-गिलास विच्छेदन पकवान पडे ।
    11. नेत्र मस्तिष्क परिसरों माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में स्थानांतरण । हस्तांतरण के लिए एक P20 या P100 एयर विस्थापन micropipette और PBT-lubricated टिप का उपयोग करें ।
    12. नेत्र मस्तिष्क परिसरों के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में 1-2 h के लिए कमरे के तापमान पर, या 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 ज सेते । प्रकाश द्वारा फ्लोरोफोरेज़ के ब्लीचिंग को रोकने के लिए, पन्नी के साथ तैयारी को कवर ।
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में ऊष्मायन की इष्टतम अवधि के प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल के अनुसार अलग हो सकता है ।
    13. आंख-मस्तिष्क परिसरों में एक 9-अच्छी तरह से गिलास पकवान, धोने के लिए PBT के ~ ४०० μL में स्थानांतरण । घोल को ऊपर और नीचे से पिख्ता करके मिक्स करें । बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए इनसेबेट । इस वाशिंग स्टेप को कम से दो बार दोहराया जाना चाहिए.
  4. द्वितीयक नियतन
    1. एक द्वितीयक निर्धारण के लिए, नेत्र-मस्तिष्क परिसरों को कम से २०० μL को स्थिर और सेने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट या 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५ मिनट के लिए स्थानांतरित करें ।
      नोट: द्वितीयक स्थिरीकरण नेत्र ऊतक, जो बढ़ते एड्स (कदम ३.५) stiffens ।
    2. एक P20 या P100 हवाई विस्थापन micropipette और PBT-lubricated टिप का उपयोग करने के लिए नेत्र मस्तिष्क परिसरों में ~ ४०० μL PBT के एक 9-अच्छी तरह से गिलास पकवान में, बर्फ पर, 5 मिनट के लिए धोने के लिए ।
    3. धोने के कदम को कम से कम एक बार दोहराएं ।
    4. एक P20 या P100 हवाई विस्थापन micropipette और PBT-lubricated टिप का उपयोग करने के लिए आंख-मस्तिष्क परिसरों में PBT के ~ ४०० μL में एक 9-अच्छी तरह से गिलास पकवान, बर्फ पर, 1-2 मिनट के लिए कुल्ला करने के लिए । पीबीएस को पाइपयुक्त करके ऊतकों को गति में रखें, लेकिन ऊतक नहीं , ऊपर और नीचे बसने और PBS-कुल्ला के दौरान कांच पकवान का पालन करने से आंख मस्तिष्क परिसरों को रोकने के लिए ।
  5. बढ़ते
    1. बढ़ते मीडिया के ~ २०० μL में आंख मस्तिष्क परिसरों स्थानांतरण । आँख-मस्तिष्क परिसरों को स्थानांतरित करने के लिए एक P20 या P100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-स्नेलेटेड टिप का प्रयोग करें । 1-2 h के लिए बढ़ते मीडिया में ऊतक equilibrate की अनुमति दें ।
    2. एक स्वच्छ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ताजा बढ़ते मीडिया की एक 5-8 μL ड्रॉप प्लेस ।
    3. एक साफ उरेर ब्लेड के साथ एक P10 टिप में कटौती करने के लिए टिप खोलने ~ त्रिज्या में ~ ०.५ मिमी और इस का उपयोग करें और एक P10 हवा विस्थापन micropipette के 5-8 μL में बढ़ते मीडिया की बूंद में मस्तिष्क परिसरों स्थानांतरण करने के लिए स्लाइड पर बढ़ते मीडिया ।
    4. ऑप्टिक पालियों से आंखों को अलग करने के लिए दो टंगस्टन सुई का प्रयोग करें । एक मजबूत टंगस्टन सुई के साथ स्लाइड के लिए एक आँख मस्तिष्क जटिल पिन और एक ठीक टंगस्टन सुई के साथ अपने जुड़े ऑप्टिक पालि से दूर प्रत्येक आँख टुकड़ा (चित्रा 2F).
    5. स्लाइड के निकट प्रत्येक आँख की बेसल सतह के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड की सतह पर प्रत्येक आँख पैंतरेबाज़ी करने के लिए ठीक टंगस्टन सुई का प्रयोग करें । धीरे से कम एक साफ कवर-ऊतक पर पर्ची और नेल पॉलिश के साथ सुरक्षित ।
      नोट: स्लाइड पर आंखों की व्यवस्था ताकि वे एक दूसरे के करीब है या एक पंक्ति में बाद माइक्रोस्कोपी की सुविधा होगी ।
    6. प्रतिदीप्त या संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रेटिना छवि ।
      नोट: स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए अगर तुरंत imaged नहीं है ।

4. पश्चिमी Blotting के लिए नेत्र ऊतक की तैयारी:

  1. विच्छेदन 10-16 प्यूपे (कदम 2.1-2.9) निंनलिखित संशोधनों के साथ: एक) इकट्ठा और दो बैचों, 10-15 मिनट के अलावा और बी) पीबीएस में टुकड़े करना में प्यूपे काटना प्रोटेज़ और फॉस्फेट inhibitors के साथ पूरक (pbs + pi) ।
  2. एक P20 या P100 हवा विस्थापन micropipette और lubricated टिप का उपयोग कर आंख मस्तिष्क परिसरों स्थानांतरण (3.2.1 चरण में के रूप में तैयार) में PBS के ~ ४०० μL + pi में एक 9-अच्छी तरह से गिलास पकवान, बर्फ पर, संक्षेप कुल्ला करने के लिए ।
    नोट: यह lubricated टिप बाद के चरणों ४.३ और ४.४ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. कुल्ला कदम दो बार दोहराएं ।
  4. सभी नेत्र-मस्तिष्क परिसरों को बर्फ के ठंडे पीबीएस के ~ ४०० μL में स्थानांतरित करना + pi एक साफ काले विदारक पकवान पर decanted ।
  5. एक मजबूत टंगस्टन सुई का उपयोग कर ऑप्टिक lobes से प्रत्येक आंख को हटा दें (आंख को स्थिर करने के लिए-मस्तिष्क परिसर) और एक ठीक उरेज़र ब्लेड या microdissection. कैंची साफ करने के लिए ऑप्टिक पालि से प्रत्येक आँख काट.
    नोट: आँखें इस स्तर पर ' चिपचिपा ' कर रहे हैं और विदारक पकवान को हल्के से पालन कर सकते हैं. यह लाभप्रद है क्योंकि यह ऑप्टिक पालियों से आंखों के हटाने की सुविधा में मदद कर सकते है (चर्चा देखें) ।
  6. ' झाडू ' PBS में एक ' ढेर ' में सभी आँखें + विदारक पकवान पर pi, एक ठीक जोड़ी के एक ब्लेड का उपयोग कर ।
  7. एक साफ उरेर ब्लेड के साथ एक P10 टिप में कटौती करने के लिए टिप खोलने को चौड़ा करने के लिए ~ त्रिज्या में ~ ०.५ मिमी और पश्चिमी ऊतक Lysis बफर (WTLB) के ऊपर और नीचे पिख्ता द्वारा टिप-इंटीरियर चिकनाना ।
  8. नेत्र-मस्तिष्क परिसरों को पीबीएस के 5 μL में ५०० μL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अंतरित कर दीजिये । इस lubricated टिप और एक P10 एयर विस्थापन micropipette का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण पूरा करें ।
  9. बर्फ पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें । 1 खंड (5 μL) का नमूना करने के लिए WTLB, और 2x केंद्रित प्रोटीन नमूना बफ़र की 10 μL (या 5x केंद्रित प्रोटीन नमूना बफ़र की २.५ μL) जोड़ें । दोहन से मिक्स ।
  10. भंवर microcentrifuge ट्यूब संक्षेप में और एक डेस्कटॉप मिनी-सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर नमूना नीचे स्पिन ।
  11. विश्लेषण तक-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर । मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर विश्लेषण करें ।

5. आरएनए निष्कर्षण के लिए नेत्र ऊतक की तैयारी:

  1. दस्ताने पहने हुए, साफ बेंच, माइक्रोस्कोप, विच्छेदन उपकरण, और काले विदारक पकवान पहले ७०% इथेनॉल और फिर rnase विसंदूषण अभिकर्मक के साथ । सूखने के लिए अनुमति दें ।
  2. विच्छेदन 30-40 प्यूपे के रूप में वर्णित (कदम 2.1-2.9) निंनलिखित संशोधनों के साथ: एक) बटोरना और 6 से 8 प्यूपे बैचेस, 15-20 मिनट के अलावा में काटना; b) नाभिक में विच्छेदन-मुक्त पीबीएस और सी) आंखों के प्रत्येक बैच अलग पृथक लेकिन एक ही microcentrifuge ट्यूब में सभी रेटिना ऊतक जमा (चरण ५.५).
    नोट: दो लोगों को एक साथ काटना समवर्ती अच्छी आंख ऊतक के कुशल अलगाव में तेजी लाने जाएगा ।
  3. प्रत्येक बैच के लिए, आंख मस्तिष्क परिसरों (कदम 2.1-2.9) को अलग और एक 9-अच्छी तरह से ग्लास डिश में न्यूक्लेस के ~ ४०० μL में स्थानांतरण एक P20 या P100 हवा विस्थापन micropipette और lubricated टिप का उपयोग कर, बर्फ पर, संक्षेप में कुल्ला करने के लिए (के रूप में तैयार कदम 3.1.2 में वर्णित) ।
    नोट: यह lubricated टिप अनुवर्ती चरण ५.४, ५.५ और ५.८ के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
  4. कुल्ला कदम दो बार दोहराएं ।
  5. एक साफ काले विदारक पकवान पर बर्फ ठंड nuclease मुक्त पीबीएस की एक ताजा ४०० μL ड्रॉप में नेत्र मस्तिष्क परिसरों स्थानांतरण ।
  6. एक मजबूत टंगस्टन सुई का उपयोग कर ऑप्टिक lobes से प्रत्येक आंख को हटा दें (नेत्र मस्तिष्क परिसर स्थिर करने के लिए) और एक ठीक उरेज़र ब्लेड या microdissection. कैंची साफ करने के लिए ऑप्टिक पालि से प्रत्येक आँख काट.
    नोट: आँखें इस स्तर पर ' चिपचिपा ' कर रहे हैं और विदारक पकवान को हल्के से पालन कर सकते हैं. यह लाभप्रद है क्योंकि यह ऑप्टिक पालियों से आंखों के हटाने की सुविधा में मदद कर सकते है (चर्चा देखें) ।
  7. ' एक ढेर ' में ' झाडू ' सभी आंखें nuclease में मुक्त PBS-विदारक पकवान पर, एक ठीक जोड़ी के एक ब्लेड का उपयोग कर forceps ।
  8. एक बाँझ RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब और फ्लैश-तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करने के लिए आँखें स्थानांतरण.
  9. पुपे के प्रत्येक बैच के विच्छेदन (चरण 5.3-5.8) दोहराएं । एक ही माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब है कि तरल नाइट्रोजन (चरण ५.५) में बनाए रखा गया है एक ट्यूब में सभी आंखें जमा में आंखों के प्रत्येक बैच स्थानांतरण ।
  10. RNA निष्कर्षण तक-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।

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Representative Results

प्यूपल नेत्र एक आसानी से सुलभ ऊतक है कि विकास की प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है कि morphogenesis ड्राइव । यहां, हम रेटिनाज़ dissected और इस्तेमाल किया इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए (चित्रा 3a, सी) या डीसीपी-1 caspase (चित्रा3ए) apoptosis के दौरान सक्रिय है कि शीर्ष पंसनों जंक्शनों (चित्रा)25। इन दृष्टिकोणों को स्पष्ट रूप से प्राथमिक कोशिकाओं की भर्ती और संरचनाविकासी (18 एच apf से), प्रत्येक नेत्रांशक (18-24 एच apf) के आसपास जाली कोशिकाओं के अंतर्निवेशन, की स्थापना सहित प्रमुख संरचनाविकासी प्रक्रियाओं के दौरान कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति तृतीयक आला (21-24 एच APF), सेल आकार और आकार में परिवर्तन (18 से एच ४० एच APF), और apoptosis (से 18 से ~ ३३ एच APF) । इन संरचनाविकासी घटनाओं के समय तापमान पर निर्भर है और इसलिए अलग प्रयोगशाला सेटिंग्स में इनसेबेटर तापमान में मामूली अंतर के जवाब में मामूली भिंन होगा । हालांकि, लगभग ४० एच apf द्वारा, कोशिकाओं की अंतिम व्यवस्था आमतौर पर (चित्रा 3b, सी) प्राप्त की है और यह एक आदर्श उंर है जिस पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन या संशोधित जीन अभिव्यक्ति के परिणामों का आकलन है । उदाहरण के लिए, Diap1 की अस्थानिक अभिव्यक्ति के बाद, एक कोर अवरोध करनेवाला अपोप्टोसिस caspase सक्रियण (चित्रा 3C)26, हमारे दृष्टिकोण एक नियंत्रण जीएमआर की तुलना में जब जाली कोशिकाओं की संख्या में परिणामी वृद्धि को निर्धारित करने के लिए एक की अनुमति देता है > lacZ रेटिना. एक भी आसानी से अपोप्टोसिस का आकलन कर सकते है और सीधे विरोधी डीसीपी-1 एंटीबॉडी या अंय तरीकों का उपयोग करके मर कोशिकाओं का पता लगाने (चित्रा 3 डी) ।

नेत्र lysate पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग करने के लिए उपस्थिति और ब्याज के प्रोटीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति निर्धारित पूछताछ की जा सकती है । यहां, हम डी-कैधेइन का पता लगाने के लिए, संपंनता जंक्शनों के मुख्य घटक, जंगली प्रकार Canton एस retinas में 21 और ४० एच apf आंखों में dissected (चित्र 4ए) दिखाते हैं । इस नमूने का परिमाणन पश्चिमी ब्लॉट (दाएँ, चित्र 4a) से पता चला कि डी-कैधेर्न की सापेक्ष अभिव्यक्ति, इन दो समय-बिंदुओं पर काफी भिन्न नहीं थी, जब बैंड तीव्रता को गप्ध की अभिव्यक्ति के अनुसार सामान्यीकृत किया जाता है (एक कोर चयापचय एंजाइम). इस तरह के विश्लेषण आमतौर पर केवल एक बार के बजाय तपसिल में किया जाएगा, के रूप में यहां दिखाया गया है ।

यह Drosophila प्यूपल retinas से उच्च शुद्धता mrna अलग करने के लिए आवश्यक है अगर एक उद्देश्य के लिए उंनत अनुक्रमण अनुप्रयोगों का उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण है (जैसे, अगली पीढ़ी, आरएनए seq) । हमने पाया है कि अधिक से अधिक ६० आंखों के जीनोटाइप या प्रयोगात्मक स्थिति विदारक है इष्टतम अगर एक लक्ष्य को अलग करने के लिए है > 1 उच्च गुणवत्ता आरएनए के मिलीग्राम (चित्रा 4B) । यहां, हम ५७ जंगली प्रकार Canton एस आंखों से अलग एक आरएनए नमूना के एक absorbance स्पेक्ट्रा का एक उदाहरण दिखाने के लिए, ४० एच apf (चित्रा 4b, शीर्ष पैनल) पर dissected । २६० एनएम पर पीक अवशोषण आरएनए के अवशोषण तरंग दैर्ध्य से मेल खाती है । हम भी एक सारणी प्रस्तुत आरएनए उपज और A260/A280 और छह आरएनए नमूनों की A260/A230 शुद्धता अनुपात, या तो 21 एच या ४० एच APF पर इकट्ठे हुए । ये डेटा आरएनए उपज में सूक्ष्म मतभेदों को प्रतिबिंबित जब आरएनए निष्कर्षण ।

Figure 1
चित्रा 1 : चयन और विच्छेदन के लिए प्यूपे की संस्कृति । (क) तीसरे लार्वा इंटार (L3) लार्वों और प्यूपे को घूमते हुए स्वस्थ ड्रोसोफिला संस्कृतियों के किनारों के साथ ढूंढ रहे हैं । (ख) प्री-प्यूपा की पहचान उनके पारभासी श्वेत रंग से की जा सकती है क्योंकि संरक्षी पुपल मामले में वर्णक अभी भी सृजित किया जाना है । प्यूपा के अग्र-पश् चवर्ती तथा पृष् ठ-अधर अक्ष को नीले रंग में दर्शाया गया है । एक नम बांस की खपच्ची को विखंडित करने और शीशी दीवारों से पूर्व प्यूपे लेने के लिए प्रयोग किया जाता है । (ग) प्यूपे को १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के अंदर रखा जाता है जिसे उचित रूप से लेबल किया जाता है (जीनोटाइप, कलेक्शन की तारीख, और कलेक्शन का समय) और (घ) एक खाली पिपेट टिप बॉक्स से इकट्ठे किए गए एक हमिडिफाइड चैंबर के अंदर । नमी बॉक्स के अंदर नम ऊतक का एक टुकड़ा रखने के द्वारा बनाए रखा है ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : पूपल आँख विदारक. (क) एक काले विदारक पकवान पर दोहरे तरफा टेप का पालन किया जाता है । पूर्वकाल, पश् चवर्ती और पृष् ठ निर्देशांक नीले रंग में दर्शाए गए हैं. (ख) नेत्र मस्तिष्क परिसरों को अलग करने के लिए (एक एकल यहां दिखाया गया है), (ग) प्यूपा पहले अपने पुपल मामले से हटा दिया जाता है । इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम दिखाए गए हैं. लाल रेखाएँ इंगित करते हैं कि प्रच्छद के निकलने के बाद प्पल मामले को कहाँ तक फाड़ने और खोलते हैं. इसके बाद पुपाए को टकराते हुए फटे प्पल केस से निकाल दिया जाता है । (घ) एक अल्पायु प्यूपा पहली बार सूक्ष्म विच्छेदन कैंची (डैश्ड रेड लाइन के साथ दर्शाई गई स्थिति) और सिर उपकला के साथ वक्ष के साथ काटा जाता है, फिर ध्यान से खुले (लाल तीर), जैसा कि (इ) में दिखाया गया है, अपारदर्शी नेत्र-मस्तिष्क परिसर को प्रकट करता है । (च) उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद, रेटिना नेत्र-मस्तिष्क परिसरों से कटा हुआ है । इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम दिखाए गए हैं. आंख मस्तिष्क एक तगड़ा टंगस्टन सुई के साथ स्थिर है (बाएँ) और एक ठीक टंगस्टन सुई के साथ हटा दिया retinas (दाएँ). प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण के लिए, अनिर्धारित retinas एक ठीक रेज़र ब्लेड या microdissection कैंची, बजाय एक ठीक टंगस्टन सुई का उपयोग कर ऑप्टिक lobes से सफाई से काट दिया जा सकता है ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्यूपल आँख का इमयूनोफ्लोरदीप्ति. (क) पूपाल नेत्रों के प्रकोष्ठों के कैधेरइन लैबल-ऐपिकल पंजनाओं के लिए एंटीबॉडी । पैनल ए में सभी छवियों संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक रेटिना के मध्य क्षेत्र में इकट्ठे हुए थे, ंयूनतम एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ संशोधित, और एक ही पैमाने पर प्रस्तुत कर रहे है (स्केल बार = 5 μm) । नोट विकास और कोशिकाओं की पुनर्विन्यास 18 एच APF से 27 एच APF. (ख) ४० एच एपीएफ (बाएं) में एक पूर्णतया नमूनों वाले ओम्मतीडियम और क्रॉस-सेक्शन में एक ओममतीडियम के एक एकल दृश्य का कार्टून । कक्ष प्रकार कुंजी में सूचीबद्ध के रूप में रंग-कोडेड हैं । फोटोरेसेक्टर कूटस्तरित neuroepithlium की सतह के नीचे दबे हुए हैं और शंकु और वर्णक कोशिकाओं से घिरे हुए हैं । तीन बाल खड़े समूहों प्रत्येक ommatidium चारों ओर । (ग) एक नियंत्रण रेटिना के छोटे क्षेत्रों में जो lacz व्यक्त किया गया था (बाएं) या Diap1 (दाएं) माध्यमिक और तृतीयक वर्णक कोशिकाओं के apoptosis को बाधित करने के लिए. एंटी-डे-कैधेरइन के साथ पालन करने वाले जंक्शनों का लेबलिंग कक्ष संख्या, व्यवस्था और आकार के विश्लेषण को सक्षम करता है । छवियां मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । (घ) एक पूरे रेटिना को सक्रिय डीसीपी-1, एपोटोप्सिस के दौरान सक्रिय एक caspase, जो आंख से कई कोशिकाओं prunes के लिए एंटीबॉडी के साथ इनयूबेटेड । छवि संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कब्जा कर लिया था । सफ़ेद डॉटेड रेखा नेत्र को बाह्यरेखांकित करती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : पुपल नेत्रों का प्रोटीन और जीन व्यंजक जोडकर । (क) 21 एच apf या ४० एच apf पर विच्छेद की गई 28 आंखों का वेस्टर्न ब्लॉट (बायां), डी-सीएडी के एंटीबॉडी के साथ जांच और एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में, गपध । प्रोटीन बैंड तीव्रता का विश्लेषण (दाएं) डी-सीएडी के तुलनीय सांद्रता पता चलता है retinas के इन समूहों में मौजूद है, GAPDH के सापेक्ष । (ख) कैंटन एस रेटिनस से निकाले गए आरएनए नमूने का एकल अवशोषक स्पेक्ट्रम ४० एच एपीएफ (ऊपर) में विच्छेद किया गया है । नोट अवशोषक पीक at २६० nm. तालिका 21 और ४० एच APF (नीचे) में पृथक केंटन एस प्यूपल retinas से निकाली गई आरएनए की राशि और शुद्धता अनुपात का दस्तावेजीकरण । ये डेटा तीन स्वतंत्र नमूना सेट से उत्पन्न होते हैं । प्रत्येक नमूना सेट के लिए प्यूपे उठाए गए थे और एक ही स्थिति में और उसी दिन विच्छेदित में इनसेटेड थे. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

Drosophila प्यूपल नेत्र विच्छेदन की विधि यहां वर्णित 10 से 15 मिनट के भीतर 6 से 10 नेत्र मस्तिष्क परिसरों के अलगाव के लिए अनुमति देता है । हालांकि, धैर्य और अभ्यास विच्छेदन तकनीक में महारत हासिल करने के लिए और विखंडता की गुणवत्ता और गति में सुधार करने के लिए आवश्यक हैं । इस छोटे विच्छेदन समय सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक आंख लगभग एक ही विकासात्मक चरण है, एक डेटा सेट में retinas के phenotype या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता को कम करने. Whilst वैकल्पिक प्रोटोकॉल कम अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है मास्टर करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल को प्रक्रिया नाजुक रेटिना ऊतक को अलग करते हुए फाड़ या shearing के जोखिम को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, क्योंकि आंख को नुकसान तनाव मार्ग सक्रियण पैदा कर सकता है या यहां तक कि कोशिका मृत्यु । हम पहले की सलाह शुरुआती गुरु प्यूपे के विच्छेदन के लिए ४० एच apf को सभ्य छोटी आंखें काटना प्रयास से पहले । हम अनुशंसा करते हैं प्रतिकृति क्रॉस सभी प्रयोगों के लिए (चरण १.१) जो यह सुनिश्चित करेगा कि हमेशा पर्याप्त प्यूपे संग्रह के लिए उपलब्ध है (चरण १.३) । रेटिना कोशित विकास के दौरान timepoints की एक किस्म पर विच्छेदित किया जा सकता है, शोधकर्ता के लिए ब्याज की विशिष्ट संरचनाविकासी घटनाओं पर निर्भर करता है । इनमें प्राथमिक प्रकोष्ठों (18 एच apf), जालक कोशिकाओं (18-24 एच apf), तृतीयक आला (21-24 एच apf) की स्थापना, सेल आकार और आकार में परिवर्तन (18 एच से ४० एच apf) और apoptosis (18 से ~ ३३ एच apf) की भर्ती और संरचनाविकास शामिल हो सकते हैं (चित्र 3A) ।

यदि प्यूपल मामले (चरण २.२, चित्र 2c) के प्रारंभिक खोलने के दौरान, एक प्यूपा के वक्ष पंचर है, शोधकर्ता अभी भी विच्छेदन के साथ आगे बढ़ने में सक्षम होना चाहिए । हालांकि, अगर सिर शुरू में पंचर हो गया है, अक्षुतग्रस्त आंख-मस्तिष्क परिसरों निकालने मुश्किल हो सकता है । जब अपने प्यूपल मामले (चरण २.३, चित्र 2c, सही पैनल) से एक प्यूपा निकालते हैं, उदर प्यूपल मामले कभी भी डबल पक्षीय टेप से हटाना और प्यूपा के पेट के बारे में लिपटे रह सकते हैं । यह संभावना नहीं है एक बाधा है, हालांकि प्यूपा जब पीबीएस से घिरा हुआ जब तक पेट और संलग्न प्यूपल प्रकरण प्यूपा से विच्छेद कर रहे है (चरण २.६) । रेटिना ऊतक की अखंडता को बनाए रखने के लिए, यह आवश्यक है कि यह निश्चित या जमे हुए के रूप में जल्दी से संभव के रूप में pupae के प्रारंभिक पंचर के बाद । इसके अलावा, बर्फ ठंडा समाधान का उपयोग कर और बर्फ पर ऊतक बनाए रखने (या 4 डिग्री सेल्सियस पर) जहां भी संभव प्रोटोकॉल में ऊतक और सेलुलर अखंडता की रक्षा करेगा, बेहतर immunofluorescence, प्रोटीन विश्लेषण या आरएनए विश्लेषण करने के लिए अग्रणी. उत्तरार्द्ध अनुप्रयोगों के लिए, यह सभी मस्तिष्क और वसा ऊतक आंखों से हटाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में इन ऊतकों विश्लेषण (कदम २.९ और ४.३ या ५.४) दूषित होगा ।

प्यूपल नेत्र मस्तिष्क परिसर unlubricated पिपेट युक्तियों का पालन कर सकते हैं, कांच और विच्छेदन उपकरण जब unfixed या पीबीएस washes के दौरान/ इस को रोकने के लिए, हम पिपेट सुझावों की सावधानीपूर्वक स्नेहन की सलाह देते हैं और नहीं धोने 9-अच्छी तरह से ग्लास व्यंजन इथेनॉल के साथ (डिश साबुन भी परहेज किया जाना चाहिए) । इसके बजाय, बस आसुत एच2ओ और चिकनाई के साथ ग्लास व्यंजन साफ है, अगर जरूरत है, एक pbt कुल्ला के साथ प्रयोग करने से पहले । विच्छेदन forceps, कैंची और सुई भी मुख्य रूप से डिस्टिल्ड एच2ओ के साथ साफ किया जाना चाहिए, सिवाय जब rna के लिए इन की तैयारी-निष्कर्षण विच्छेदों (कदम ५.१) । हालांकि, retinas और कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच प्रकाश आसंजन आंखें फहराकर में सहायता कर सकते है और उंहें स्लाइड पर स्थिति जब बढ़ते (कदम 3.5.4 और 3.5.5) के दौरान ऑप्टिक lobes से आंखें अलग । इसी प्रकार, आंखों के प्रकाश आसंजन काले विदारक व्यंजन को समतल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बहुत हल्के ऊतक जो आंख ऑप्टिक पालि कनेक्शन की साफ विच्छेद जब प्रोटीन या आरएनए विश्लेषण के लिए retinas अलग करने की सुविधा खिंचाव (चरण ४.५ और ५.६) । हमने पाया है कि माइक्रोडिस्सेक्शन कैंची या एक ठीक रेज़र ब्लेड जल्दी और सफाई से ऑप्टिक lobes से अनिर्धारित आंखों से सट करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं ।

प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला के दौरान, बजाय आंख-७२ में मस्तिष्क परिसरों-अच्छी तरह से माइक्रो-अच्छी तरह से ट्रे (step 3.3.5), एक 9-अच्छी तरह से कांच पकवान के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । एंटीबॉडी समाधान रात भर के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, एक कवर पर्ची या स्लाइड के साथ कांच पकवान कुओं कैप करने के लिए सुनिश्चित करें । हालांकि, इस दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी 40-50 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के एक बैच के लिए 6-10 नेत्र-मस्तिष्क परिसरों में एक अच्छी तरह से 9-अच्छी तरह से कांच पकवान, बजाय 20 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 2 कुओं के बीच वितरित एक ७२-अच्छी तरह से माइक्रो-अच्छी तरह से ट्रे ।

नेत्र-मस्तिष्क परिसरों का द्वितीयक नियतन (स्टेप ३.४) माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते हुए आँखों से पहले (स्टेप ३.५) मामूली रूप से ऊतक को कड़ा कर देगा ताकि ऑप्टिक पालियों से आँखों को सट पाना आसान हो जाए और आँखें कम होने या विच्छेदन सुइयों का पालन करने की संभावना हो. बढ़ते मध्यम (3.5.1 कदम) में एक 1-2 एच ऊष्मायन के बाद, आंख मस्तिष्क परिसरों थोड़ा अपारदर्शी हो और इसलिए बढ़ते whilst देखने के लिए आसान है । इसके अलावा, बढ़ते माध्यम में 1-2 एच के बाद, सबसे माध्यमिक एंटीबॉडी उपयुक्त फोटो से प्रतिदीप्त इमेजिंग के दौरान ब्लीचिंग संरक्षित किया जाएगा । बढ़ते मीडिया में रात भर रेटिनस बढ़ती से पहले की सिफारिश के रूप में यह नरम retinas renders, माध्यमिक निर्धारण के stiffening प्रभाव नकारने नहीं है ।

पश्चिमी विश्लेषण के लिए, कम से 20 आंखों के lysate के लिए मज़बूती से एंटीबॉडी है कि रोही Drosophila प्रोटीन को पहचानने का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक है (जैसे, चित्र 4a) । हालांकि, आंखों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता हो सकती है अगर वहां ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति कम है । यदि बाद में पश्चिमी सोख्ता के लिए ऊतक के lysis अधूरा है (चरण ४.७), wtlb की मात्रा नमूना जोड़ा जा सकता है मामूली वृद्धि हुई है और केंद्रित नमूना बफर की मात्रा तदनुसार समायोजित (कदम ४.९) । आरएनए निष्कर्षण के लिए, तेजी से विच्छेदन आंखों की एक महत्वपूर्ण संख्या की आवश्यकता हो सकती है यदि लक्ष्य उच्च गुणवत्ता आरएनए (चरण ५.२, चित्रा 4Bदेखें) की एक बड़ी राशि को अलग करने के लिए है । इस संभावित खामी को दूर किया जा सकता है अगर दो वैज्ञानिकों, जो Drosophila प्यूपल-नेत्र विच्छेदन में महारत हासिल है के लिए एक साथ उड़ान भरने वाली retinas के इन बड़ी संख्या को काटना करने के लिए सहयोग । हालांकि, RNA की कुल राशि की आवश्यकता पर निर्भर करेगा संस्था की आवश्यकताओं या RNA विश्लेषण प्रदर्शन सुविधा, RNA विश्लेषण या अनुक्रमण के प्रकार, और RNA निष्कर्षण किट का उपयोग किया जाता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जैक ड्रम और पांडुलिपि पर सहायक टिप्पणियों के लिए हमारे समीक्षक धंयवाद । इस काम को R15GM114729 ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe Photoshop Adobe Image processing software
Bamboo splints, 6"  Ted Pella Inc 116
Beta mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Beta-glycerol phosphate Sigma-Aldrich 50020
Black dissecting dish Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder Fine Science Tools 10053
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501) Carl Zeiss or similar microscope
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 40718
Double-sided tape 3M 665
Drosophila food media, nutrient-rich  7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila food media, standard Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758
Fixative solution 4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) Leica Microsystems or similar microscope
Forceps  Fine Science Tools 91150-20 Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde Thermo Scientific 28908
Glass 9-well dishes  Corning 7220-85 Also known as 9-well dishes 
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) Fisher Scientific 12-550-413
Glass petri dish Corning 3160-100BO
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Image Studio software version 5.2.5 LI-COR Biosciences Image processing software for quantitation of Western blots.
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions.
Lane marker reducing sample buffer  ThermoFisher Scientific 39000 5X concentrated protein sample buffer.
Microcentrigure tubes  Axygen MCT-175-C
Microdissection scissors  Fine Science Tools 15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells) Nunc 438733
Mounting media 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate Sigma-Aldrich P3130
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Sigma-Aldrich P5368 Prepare according to manufacturer's instructions
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.  
PBT 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder Fine Science Tools 26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH Imgenex IMG-3073 For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 Cell signaling 9578S For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad Developmental Studies Hybridoma Bank DCAD2 For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 DCAD1  Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit  Promega Z6110
Rnase decontamination reagent (RNase Away) Molecular BioProducts 7002
Scalpel blades Fine Science Tools 10050 Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated  donkey anti-rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 712-545-153 For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-165-144 For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Cell Signaling Technology 7077 For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 305-035-003 For Western blotting. Used at 1:3000
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 215309
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 50860
Spectrophotometer (NanoDrop) ThermoFisher Scientific 2000c 
Stereo dissecting microscope (M60 or M80) Leica Microsystems or similar microscope
Sylgard (black) Dow Corning SYLG170
Sylgard (transparent) Dow Corning SYLG184 Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes KIMTECH 34120
TritonX Sigma-Aldrich T8787
Trizma hydrochloride pH7.5 Sigma-Aldrich T5941
Tungsten needle, fine Fine Science Tools 10130-10 Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy Fine Science Tools 10130-20 Insert into pin holder
WTLB (western tissue lysis buffer) 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.
Yeast paste (local supermarket) Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १४५ Drosophila प्यूपा नेत्र रेटिना विच्छेदन immunohistochemistry पश्चिमी BLOTS आरएनए निष्कर्षण माइक्रोस्कोपी
Immunohistochemistry, पश्चिमी विश्लेषण, और आरएनए अलगाव के लिए <em>Drosophila</em> प्यूपल रेटिना का विच्छेदन
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DeAngelis, M. W., Johnson, R. I.… More

DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. Exp. (145), e59299, doi:10.3791/59299 (2019).

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