Summary
이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.
Abstract
초파리 번데기 망막 개발 하는 동안 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 이 종이에 선물이 섬세 한 초파리 번데기 망막의 해 부에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜. 외과 접근 pupae를 열고 정확 하 게 추출 눈 두뇌 단지를 쉽게 사용할 수 서 도구를 활용 합니다. 이러한 수 고정, 들어서는 immunohistochemistry, 망막에 다음 현미경 슬라이드에 장착 되며 목표 세포 또는 subcellular 구조를 감지 하는 경우를 몇 군데. 또는, 떼어낸된 망막 뇌 조직에서 분리, 적절 한 버퍼에 lysed 고 단백질 젤 전기 이동 법 또는 mRNA 추출 (각각 단백질 또는 유전자 식 평가)에 대 한 활용. 상당한 연습과 인내심, 기정 프로토콜을 마스터 해야 할 수 있습니다 하지만 일단 마스터, 프로토콜 수 주로 손상된 망막의 상대적으로 빠른 절연 있습니다.
Introduction
초파리 망막 색소 세포 벌집 격자1,2,,34배열에 의해 포위 하는 약 750 ommatidia 구성 됩니다. 각 ommatidium 8 포토 리셉터 신경, 4 렌즈 은닉 원추 세포, 그리고 두 가지 기본 안료 세포에 포함 되어 있습니다. 각 ommatidium를 주변 안료 생산 격자 세포와 감각 강 모 그룹 있습니다. 포스트 mitotic 자연 및 틀에 박힌 6 각형 배열, 초파리 번데기 망막 세포 접착5,6,를 포함 하 여 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공 7,8,9,10 및 apoptosis11,12,13,,1415.
여러 게시 프로토콜 초파리 번데기16,,1718에서 눈 뇌 단지 추출 공기 압력을 이용 한다. 프로토콜 설명 여기 대신 활용 하 서 도구를 신중 하 고 정확 하 게 격리 눈-뇌 손상된 망막 조직을 얻기의 목적으로 단지. 이것은 망막에 대 한 활용 하는 경우 중요 한 형태학, 단백질, 또는 유전자 발현 분석 때문에 망막 손상 세포 스트레스 또는 죽음, 세포 표현 형 또는 진 식을 수정할 수 발생할 수 있습니다. 또한, 연습 후, 6 ~ 10 눈 두뇌 단지 10 ~ 15 분, 나이 및 해 부 눈 조직의 발달 단계에서 가변성을 최소화의 목표를 용이 하 게 고립 될 수 있다.
고정, immunostaining, 및 아래에 설명 된 전체 마운트 프로토콜은 형광 현미경 검사 법에 대 한 초파리 눈의 준비에 적합 하다. 망막은 관심사의 단백질을 대상으로 하는 항 체와 알을 품을 수 있다. 예를 들어 외화 접합 부품에 항 체 특성 셀을 포함 하 여, 모양 및 배치 평가19될 수 있도록 셀의 꼭대기 크기를 시각화 하기 위해 활용할 수 있습니다. 고정, 이전 서쪽 분석, 단백질 또는 RNA qRT-PCR에 사용 하기 위해 또는 RNA 시퀀싱을 추출 하기 위해 뇌에서 눈 죽 습 수 대신 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 조직 준비
- 초파리 를 설정 (앞에서 설명한20) 십자가 또는 원하는 유전자 형의 번데기를 특정 초파리 긴장 문화. 되도록 많은 pupae coincidently 등장, 그 영양소 풍부한 음식 미디어 또는 표준 식품 미디어 아낌없이 효 모-붙여넣기 보충에 중복이 비행 문화를 확립.
- 25 ° c.에 초파리 문화 유지 십자가 UAS GAL4 시스템을 활용 하 여, GMR GAL4 애벌레 눈 디스크 세포 후부 번데기 개발21,,2223, 를 통해 전체적 밭 고 랑을 표현 하는 이상적인 드라이버입니다. 24. 이상적인 제어 크로스 UAS lacZ X GMR GAL4 역할 크로스 비 생 및 불활성 β-galactosidase 단백질의 표현을 드라이브.
- 6"대나무 부 목 젖어 증류수 부드럽게 백색 사전 pupae (그림 1B) 건강 한 문화 튜브 (그림 1A)의 측면에서 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (그림 1C)에 배치 된 팁을 사용 합니다.
- 튜브 건조 (그림 1D)에서 번데기를 보호 하기 위해 충분 한 습도 챔버를 유지 하기 위해 증류수에 배어 조직의 작은 조각 함께 플라스틱 피 펫 팁 상자에 놓습니다. 해 부까지 25 ° C에서 번데기를 품 어.
- 건조 6"대나무 부 목 사용 하 여 부드럽게 밀어 번데기 microcentrifuge 튜브에서와 해 부 접시 블랙에. 번데기에서 해 접시에 양면 테이프의 새로운 조각을 하다.
- 신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여, 테이프 (그림 2A)에 번데기 등 쪽 (즉, operculums 향하도록, 그림 1B)를 배치 합니다. 번데기는 테이프에 잘 고착 확인 합니다.
참고: 번데기 사건에 수 분 억제 보안 접착 테이프, 어떤 경우에, 이중 면 테이프에 배치 하기 전에 건조 하 pupae 허용 것 이다.
2입니다. 눈-두뇌 단지의 해 부
- 집게를 사용 하 여 각 번데기 (그림 2C)의 operculum 제거.
- 서가 위를 사용 하 여 슬라이스 또는 각 번데기의 번데기 케이스를 자르면. 플랩 머리, 흉부, 그리고 이중 면 테이프 (그림 2C) 번데기 케이스의 가장자리를 확보 하는 앞쪽 복 부 세그먼트 공개 번데기 케이스를 엽니다.
참고: 그것은 전적으로 번데기를 밝힐 필요가 아니다. - 날카로운 집게, 동물, 파악 된 각 번데기의 복 부를 관통 하 고 번데기의 경우 (그림 2C)에서 그것을 제거 합니다.
- 검은 해 부 접시, 테이프에서에 번데기를 놓고 차가운 인산 염-버퍼링-솔루션 (PBS, pH 7.4)의 약 400 µ L로 커버 합니다.
- 복 각 번데기 잡고 집게와 서가 위, 반에 번데기를 절단 전체 흉부를 통해 깨끗 한 횡단면 컷 (그림 2D).
- PBS에서 각 시체의 후부 잔재를 제거 하 고 해 접시에 한쪽에 넣어 (할 하지, 단계 3.2.1 참조).
- 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 열고 흉부 눈 두뇌 복잡 한 (그림 2E)을 각 번데기의 머리. 이렇게 하려면 흉부 상피의 잘라 가장자리를 파악 하 고 점차적으로 흉부를 열고 캡슐, 눈-뇌 복잡 하 고 주변 지방 조직의 노출 머리를 찢 어.
- 조직 파악 없이 집게를 사용 하 여 머리 캡슐의 나머지에서 눈 뇌 복잡 한 가이드 또는 찢어진 오픈 헤드 캡슐에서 눈 뇌 복잡 한 특 종.
참고: 눈-두뇌 복잡 한 아령 모양의 오프 화이트, 그리고 주변 크림 지방 (그림 2B, E) 보다 더 반투명입니다. - 집게, 신중 하 게 대부분 지방 눈 조직을 건드리지 않고 눈 두뇌 단지와 관련 된 제거.
3. 면역 형광 검사에 대 한 조직의 처리
- 설명된 (2.1-2.9 단계)으로 적어도 6 10 pupae를 해 부.
참고: 각 해 부의 3 ~ 4 독립적인 복제 가설 테스트를 충분 한 데이터를 얻을 경향이 있다. -
세척 및 고정
- p 20의 끝 또는 P100 피 펫 팁 반경 m m ~ 1 팁 열기 고 PBS와 지방 위쪽 및 아래쪽의 믹스를 pipetting으로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라. 이 지방 단계 2.6에서에서 제거 하는 시체 잔해에서 얻을 수 있습니다.
- 얼음 9 잘 유리 접시에 PBS의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송.
참고: 눈-두뇌 단지 것 이다 pipetting 동안 unlubricated 팁 준수 및 수 손상 또는 손실. - 아래로 부드럽게 눈 두뇌 단지 소용돌이에 PBS에 pipetting 여 눈 조직와 관련 된 나머지 지방을 제거 합니다. 이에 모든 후속 세척 단계, 할 하지 직접 플라스틱 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지가 연약한 눈 조직 손상 것입니다.
- 최소 볼륨에서 눈 뇌 단지 전송 (< 20 µ L) 정착 액의 적어도 250 µ L로 PBS의. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 35 분, 얼음에 품 어.
참고: 단계 3.1.1에서에서 준비 같은 윤 활된 팁이이 전송에 대 한 사용할 수 있습니다. - 동일한 피 펫 팁, PBS의 잘 포함 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 전송. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 씻어 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다.
참고: 눈-두뇌 단지 최종 PBS 세척, 얼음, 또는 3.3.1 단계로 진행 하기 전에 4 ° C에서에서 몇 시간 동안 유지할 수 있습니다.
-
항 체 얼룩이 지기
- 차단 항 체 솔루션에 노출 이전 조직, 눈-두뇌 단지 ~ 400 µ L PBT의 전송. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 전송. 10 ~ 60 분, 얼음에 품 어.
- PBT에 적절 한 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다. 눈-두뇌 단지 항 체 솔루션의 10 µ L aliquots에서 알을 품는, 준비 볼륨 10의 복제 됩니다.
- 72-잘 microwell 쟁반의 깨끗 한 우물에 항 체 솔루션의 aliquot 10 µ L (내용 참조).
- 반경에 ~0.5 m m 팁 열기 고 pipetting PBT에 의해 아래로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 P10 피 펫 팁의 끝을 잘라.
- 전송의 볼륨에 더 이상 5 눈-두뇌 단지 < P10 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁을 사용 하 여 항 체 솔루션의 각 10 µ L로 PBS의 3 µ L.
- 솔루션을 위아래로 pipetting으로 항 체 솔루션을 균질. 이 조직에 손상을 것입니다 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지 플라스틱 하지 않습니다.
- 항 체 해결책의 증발을 최소화 하려면 microwell 쟁반으로 증류수에 배어 조직의 작은 조각을 놓고 (예를 들어, 함께 제공 하는 뚜껑) 트레이 인감. 4 ° c.에서 밤새 품 어
- 씻고 9 던 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 microwell 트레이에서 전송. P10 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 (준비 단계 3.3.4에에서 설명 된 대로)를 사용 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어.
- 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다. 세척 솔루션 사이 눈 두뇌 단지를 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.
- 적절 한 fluorophore 태그 2 차 항 체 PBT에서 필요에 따라를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 100 µ L 6-10 pupae의 배치 당 충분 하다. 약 수 9 던 유리 해 부 접시에 이차 항 체 솔루션.
- 눈-두뇌 단지 이차 항 체 솔루션에 전송 합니다. 전송에 대 한 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.
- 실 온에서 1-2 시간 또는 3-5 h 4 ° c.에 대 한 이차 항 체 솔루션에서 눈 뇌 단지 품 어 빛에 의해 fluorophores의 표백 방지 하기 위해 호 일 준비 커버.
참고: 이차 항 체 솔루션에 외피의 최적의 기간 사용 하는 차 및 2 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다. - 씻고 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 이 세척 단계는 두 번 이상 반복 한다.
-
보조 고정
- 보조 고정을 위한 정착 액의 적어도 200 µ L 눈 두뇌 단지 전송 하 고 실내 온도에 또는 4 ° c.에 35 분 20 분 동안 품 어
참고: 보조 고정 장착 (3.5 단계) 에이즈 눈 조직 자나. - 눈-두뇌 단지 5 분 동안 씻어 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.
- 세척 단계를 한 번 이상 반복 합니다.
- 사용은 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 ~ 400 µ L 1-2 분에 대 한 린스에 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBS의 눈-두뇌 단지 소프트웨어인 모션 pipetting PBS에 의해 조직 하지만 조직 하지 유지 눈-두뇌 단지 정착 하 고 PBS 린스 중 유리 접시에 고착에서 방지 하기 위해 아래로.
- 보조 고정을 위한 정착 액의 적어도 200 µ L 눈 두뇌 단지 전송 하 고 실내 온도에 또는 4 ° c.에 35 분 20 분 동안 품 어
-
장착
- 미디어를 마운트의 ~ 200 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 눈-두뇌 단지 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 1-2 h에 대 한 미디어의 장착에 equilibrate을 조직을 수 있습니다.
- 깨끗 한 현미경 슬라이드에 신선한 설치 미디어의 5-8 µ L 드롭 장소.
- P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 열기를 증가 하 고이 고 P10 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 슬라이드에 미디어를 마운트의 드롭에 미디어를 장착의 5-8 µ L에서 눈 뇌 단지 전송를 깨끗 한 면도날으로 잘라.
- 두 개의 텅스텐 바늘을 사용 하 여 시 돌출부에서 눈을 분리. 견고한 텅스텐 바늘으로 슬라이드에 복잡 한 눈-뇌를 고정 하 고 좋은 텅스텐 바늘 (그림 2F)의 연결된 시 엽 멀리 각 눈을 슬라이스.
- 좋은 텅스텐 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 인접 한 각 눈의 기저 표면으로 현미경 슬라이드의 표면에 각 눈 기동. 부드럽게 조직을 통해 깨끗 한 커버 슬립을 낮은 및 매니큐어와 보안.
참고: 그렇게 그들은 서로 가까이 또는 라인에서 슬라이드에 눈 정리 후속 현미경을 촉진할 것 이다. - 형광 또는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 망막을 이미지.
참고: 슬라이드 해야 될 4 ° C에서 저장 아니라면 즉시 몇 군데 있습니다.
4. 서 부 럽 눈 조직의 준비:
- 10-16 pupae (단계 2.1-2.9) 다음 수정 해 부: a) 수집 및 두 개의 배치, 10-15 분 간격에 번데기를 해 부 및 b) PBS (PBS + pi) 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제와 보충에서 해 부.
- 눈-두뇌 단지는 p 20을 사용 하 여 전송 또는 P100 변위 micropipette 공기와 PBS + 얼음, 9 잘 유리 접시에 파이 씻어 짧게 ~ 400 µ L로 팁 (단계 3.2.1에서 준비)을 윤 활.
참고:이 윤 활된 팁 4.3 및 4.4 후속 단계에 사용할 수 있습니다. - 두 번 린스 단계를 반복 합니다.
- 모든 눈-두뇌 단지 얼음 차가운 PBS + 깨끗 한 검은 해 접시에 decanted pi ~ 400 µ L로 전송 합니다.
- 각 눈 (눈 뇌 복잡 한 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서.
참고: 눈이이 단계에서 '스티커'는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다. - ' 청소 ' 모든 눈 '더미'에 PBS + 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여 해 접시에 pi.
- P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 개방을 확대 하 여 아래로 팁 내부에 의해 pipetting 서 조직 세포의 용 해 버퍼 (WTLB)에 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라.
- 5 µ L의 PBS + pi에서 눈 뇌 단지 500 µ L microcentrifuge 튜브로 전송 합니다. 이 윤 활된 팁과 P10 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송 완료.
- 얼음에 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 샘플, WTLB 그리고 2 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 10 µ L (또는 5 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 2.5 µ L)의 1 볼륨 (5 µ L)를 추가 합니다. 두 드려서 믹스.
- 소용돌이 microcentrifuge 짧게 튜브 고 데스크탑 미니 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 아래로 회전.
- 분석까지-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 표준 프로토콜을 사용 하 여 분석 합니다.
5. 눈 조직의 RNA 추출 준비:
- 입고 장갑, 깨끗 한 벤치탑, 현미경, 해 부 도구, 블랙 후 RNase 오염 제거 시 약 70% 에탄올으로 처음 요리를 해 부. 건조를 허용 합니다.
- 30-40 번데기 단계로 설명 (2.1-2.9) 다음 수정 해 부:는) 수집 및 배치, 15-20 분;에 6 ~ 8 pupae를 해 부 b) nuclease 무료 PBS와 c 해 부) 눈의 각 일괄 처리를 별도로 분리 하지만 모든 망막 조직 같은 microcentrifuge 튜브 (단계 5.5)으로 축적.
참고: 두 사람이 동시에 해 부를 데 좋은 눈 조직의 효율적인 분리를 가속화할 것 이다. - 각 일괄 처리에 대 한 눈-두뇌 단지 (단계 2.1-2.9)와 얼음, 짧게, 린스를 9 잘 유리 접시에 nuclease 무료 PBS의 ~ 400 µ L로 전송 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁 (준비 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로)를 사용 하 여 격리 합니다.
참고:이 윤 활된 팁 5.4, 5.5-5.8 후속 단계에 사용할 수 있습니다. - 두 번 린스 단계를 반복 합니다.
- 깨끗 한 검은 해 부 접시에 얼음 처럼 차가운 nuclease 무료 PBS의 신선한 400 µ L 드롭 눈 두뇌 단지 전송할.
- (복잡 한 눈 두뇌 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 각 눈을 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서.
참고: 눈이이 단계에서 '스티커'는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다. - ' 청소 ' 모든 눈 '더미'로 nuclease 무료 PBS 해 접시에 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여에서.
- 살 균 RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 눈 전송 및 액체 질소에 플래시 동결.
- Pupae의 각 배치의 해 부 (5.3-5.8 단계)를 반복 합니다. 액체 질소 (단계 5.5)를 축적 한 튜브에 모든 눈에서에서 유지 관리 하는 동일한 microcentrifuge 튜브에 눈의 각 일괄 처리를 전송 합니다.
- RNA 추출까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
번데기 눈은 그 드라이브 morphogenesis 발달 과정을 조사 하는 우수한 모델 역할을 쉽게 액세스할 수 있는 조직 이다. 여기, 우리 망막 해 부는 면역 형광 꼭대기 외화 접합 (그림 3A, C) 또는 apoptosis (그림 3)25동안 활성화 되는 Dcp-1 caspase (그림 3D)를 감지 하는데. 이러한 방식을 명확 하 게 모집 등 (18 h APF)에서 1 차 셀의 morphogenesis 키 전체적 과정 동안 세포를 관찰 할 수, 격자의 윤 각 ommatidium (18-24 h APF), 주위 세포의 설립은 3 차 틈새 (21-24 h APF), 셀 크기와 모양 (18 h 40 h APF)에서 및 apoptosis (18 ~ 33 h APF)에서 변경 합니다. 이러한 전체적 이벤트의 타이밍 온도 의존 이며 따라서 달라질 겸손 하 게 다른 실험실 설정에서 인큐베이터 온도 있는 사소한 차이에 대 한 응답. 그러나, 약 40 h APF, 셀의 최종 배치는 일반적으로 달성 (그림 3B, C)이 유전자 변이의 결과 평가 하는 이상적인 나이 또는 유전자 발현을 수정. 예를 들어 Diap1, apoptosis caspase 활성화 (그림 3C)26의 코어 억제제, 우리의 접근 방법의 다음 소성 식 계량 제어 GMR에 비해 격자 셀의 수에 따른 증가를 수합니다 > lacZ 망막. 하나는 또한 쉽게 안티-Dcp-1 항 체 또는 다른 방법 (그림 3D) 죽어가는 셀을 검출을 이용 하 여 직접 apoptosis를 평가할 수 있습니다.
눈 lysate를 사용 하 여 서 부 분석은 존재 또는 관심사의 단백질의 상대적 표현을 결정 심문 수 있습니다. 여기, 우리 드 cadherin 감지 표시 외화 접합, 야생 타입 구획 S 망막에서의 핵심 구성 요소 해 부 21와 40 h APF에서 눈 (그림 4A). 이 샘플의 서쪽 오 점의 정량화 (오른쪽, 그림 4A) 상대 표현의 드 Cadherin이 두 시간 점에서 밴드 강도 GAPDH (핵심의 표현에 따르면 정규화 때 실질적으로 다 하지 않았다 밝혀 대사 효소)입니다. 다음과 같이 triplicate 보다는 그냥 한 번, 같은 분석 수행 일반적으로 것 이다.
하나의 목표 고급 시퀀싱 응용 프로그램 (예: 다음-겐, RNA-seq)를 사용 하 여 유전자 발현을 분석 하는 경우 초파리 번데기 망막에서 고 순도 mRNA를 분리 하는 필수적 이다. 우리 유전자 형 또는 실험 조건 당 60 개 이상의 눈을 해 부하는 하나의 목표를 분리 하는 경우 최적의 발견 > 1 mg의 높은-품질 RNA (그림 4B). 여기, 우리는 40 h APF (그림 4B, 맨 위 패널)에서 해 부 57 야생 타입 구획 S 눈에서 격리 하는 RNA 샘플의 흡 광도 스펙트럼의 예를 보여줍니다. 260에서 최대 흡 광도 nm RNA의 흡 광도 파장에 해당. 우리는 또한 RNA 수율 및 A260/A280 A260/A230 21 h 또는 40 h APF에 모여 6 RNA 샘플의 순도 비율을 반영 하는 테이블을 제시. 이러한 데이터는 RNA에 미묘한 차이가 생성 RNA를 추출할 때 반영 합니다.
그림 1 : 선택과 해 부에 대 한 번데기의 문화. (A) 건강 한 초파리 문화의 측면을 따라 애벌레와 번데기 찾아 방황 하는 세 번째 애벌레 탈피 (L3). (B) 사전 pupae 안료 아직 보호 번데기 케이스에서 생성 되는 그들의 반투명 백색 색깔에 의해 식별할 수 있습니다. 번데기의 앞쪽 후부 및 등 쪽 복 부 축 파란색으로 표시 됩니다. 젖은 대나무 부 목은 꺼내 유리병 벽에서 사전 pupae를 선택 하는 데 사용 됩니다. (C) Pupae 적절 하 게 표시는 1.5 mL microcentrifuge 튜브 내부에 배치 됩니다 (유전자 형, 컬렉션의 컬렉션의 날짜와 시간) 및 (D) 교양 내부 습도 챔버는 빈 피 펫 팁 상자에서 조립. 습도 상자 안에 젖은 티슈의 조각을 배치 하 여 유지 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 번데기 눈 해 부. (A) 번데기 요리를 해 부 한 블랙에 양면 테이프를 준수. 앞쪽, 후부, 그리고 등 쪽 좌표는 파란색으로 표시 됩니다. (B) 눈-두뇌 단지 (단일 하나 여기에 표시 됩니다), (C) 번데기를 분리 하는 번데기 케이스에서 먼저 제거 됩니다. 이 과정에서 중요 한 단계가 표시 됩니다. 레드 라인 눈물과 operculum 제거 후 번데기 케이스를 열고 위치를 나타냅니다. 번데기는 집게와 다음 찢어진된 번데기 케이스에서 제거 됩니다. (D)는 노출 된 번데기 먼저 서가 위 (빨간색 점선으로 표시 되는 위치)와 머리 상피 다음 신중 하 게 찢어진 오픈 (빨간색 화살표), 불투명 한 눈-두뇌 복잡 한 공개 (E)에서 같이 가슴을 따라 절단 됩니다. (F) 망막 눈 두뇌 단지에서 슬라이스는 적절 한 항 체를 가진 외피, 다음. 이 과정에서 중요 한 단계가 표시 됩니다. 눈-뇌 (왼쪽) 견고한 텅스텐 바늘으로 안정 고 좋은 텅스텐 바늘 (오른쪽)는 망막 제거. 단백질 및 RNA 분석, 고정 되지 않은 망막 깔끔하게 잘 면도날 또는 서가 위, 보다는 오히려 좋은 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 자를 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 번데기 눈의 면역 형광 검사. (A) 항 체 드 cadherin 레이블 꼭대기 외화 접합 번데기 눈의 세포의. 모든 패널 A에에서 최소한 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 수정 하는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 망막의 중앙 영역에 모았다 영상과 같은 눈금에 표시 됩니다 (눈금 막대 = 5 µ m). 참고 성장과 27 h APF 18 h APF에서에서 셀의 재배치. 단일 완전히 꽃무늬 ommatidium 40 h APF (왼쪽)와 횡단면에는 ommatidium의 꼭대기 볼의의 (B) 만화 종류는 키에 나열 된 색상으로 구분 됩니다. 대뇌 pseudostratified neuroepithlium의 표면 아래에 묻혀 있으며 콘 및 안료 세포. 3 강 모 그룹 각 ommatidium를 둘러싸고 있습니다. (C)에 있는 lacZ 했다 (왼쪽) 또는 Diap1 (오른쪽) 2 차 및 3 차 색소 세포의 apoptosis를 억제 하기 위해 제어 망막의 작은 영역입니다. 안티-드-cadherin와 외화 접합의 라벨 셀 번호, 배열, 및 모양의 분석을 수 있습니다. 이미지 표준 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 점령 했다. (D)는 전체 망막에 항 체와 incubated Dcp-1, apoptosis, 눈에서 수많은 셀을 정리 하는 동안 활성화 된 caspase 활성화. 이미지는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 체포 됐다. 흰색 점선 눈을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 번데기 눈의 단백질 및 유전자 표정 분석. 서쪽 오 점 (왼쪽) (A) 항 체와 조사 28 눈 21 h APF 또는 40 h APF에서 해 부, 드 cad 및 로드 제어, GAPDH로. 단백질 밴드 농도 (오른쪽)의 분석의 비교 가능한 농도 드 cad를 GAPDH 상대적인 망막의이 그룹에 보여준다. 구획 S 망막 40 h APF (위)에 해 부에서 추출한 RNA 샘플의 (B) 단일 흡 광도 스펙트럼. 참고 흡 광도 피크 260 nm. 21, 40 h APF (아래)에서 격리 된 구획 S 번데기 망막에서 추출한 RNA의 양과 순도 비율을 문서화 하는 테이블입니다. 이러한 데이터는 3 개의 독립적인 샘플 세트에서 발생 한다. Pupae 각 샘플 집합에 대 한 제기와 동일한 조건에서 incubated 되었고 같은 날에 해 부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 초파리 번데기 눈 해 부 방법 10 ~ 15 분 이내 6-10 눈 두뇌 단지의 격리에 대 한 수 있습니다. 그러나, 인 내와 연습 절 개 기술을 지배 품질 및 해의 속도 향상 시키기 위해 필수적입니다. 이 짧은 해 부 시간 각 눈 약 동일한 개발 단계, 표현 형 또는 유전자 표현의 데이터 집합에서 망막에 있는 가변성을 감소를 통해. 우리의 프로토콜은 조직적으로 찢 어 또는 깎기, 눈에 손상을 수 있는 스트레스 통로 활성화를 유도 또는 때문에의 위험을 최소화 하면서 섬세 한 망막 조직을 분리 하도록 대체 프로토콜 마스터를 덜 연습 해야, 하는 동안 세포 죽음입니다. 우리는 초보자 첫 번째 마스터 pupae 젊은 눈 해 부를 하기 전에 40 h APF 경작의 해 부를 조언. 거기는 항상 충분 한 pupae 컬렉션 (1.3 단계)에 사용할 수 있도록 것입니다 모든 실험 (단계 1.1)에 대 한 복제 설정 교차 하는 것이 좋습니다. 망막은 번데기 개발 연구원에 관심의 뚜렷한 전체적 이벤트에 따라 다양 한 timepoints에서 해 부 수 있습니다. 이러한 모집 및 1 차 셀 (18 h APF)에서 격자 셀 (18-24 h APF)의 윤, 차 틈새 (21-24 h APF)의 설립, 셀 크기와 모양 (18 h 40 h APF)에서 변화 및 apoptosis (18 ~ 33 h APF)에서 morphogenesis 포함 될 수 있습니다. (그림 3A)입니다.
번데기 케이스 (2.2, 그림 2C단계)의 초기 오프닝 동안는 번데기의 가슴 구멍은, 연구원 한다 해 부 진행 수 여전히. 그러나, 경우 머리는 처음 구멍을, 손상 되지 않은 눈-두뇌 단지 추출 어려울 수 있습니다. 번데기의 경우 (2.3, 그림 2C, 오른쪽 패널 단계)에서 번데기를 제거 하는 경우 복 부 번데기 케이스 수 때로는 이중 면 테이프에서 꺼내와 번데기의 복 부에 대 한 래핑된 유지. 이것은 가능성이 방해, a 번데기 (2.6 단계)에서 번데기 케이스는 절단 번데기 때 복 부까지 PBS에 의해 포위 하 고 연결 된 플 로트 수 있습니다 비록. 망막 조직의 무결성을 유지 하는 고정 또는 번데기의 초기 펑크 후 가능한 한 빨리 냉동 필수적입니다. 또한, 얼음 솔루션을 사용 하 여 하 고 조직과 세포 무결성, 더 나은 면역 형광 검사, 이어지는 가능한 프로토콜에 걸쳐 유지 됩니다 어디 얼음에 (4 ° C에서) 조직 유지 분석 단백질 또는 RNA 분석. 후자의 응용 프로그램에 대 한 모든 두뇌를 제거 하는 것이 중요 하다 고이 조직으로 눈에서 지방 조직 분석 (2.9 및 4.3 또는 5.4 단계) 오염.
번데기 눈-두뇌 복잡 한 수 있습니다 준수 unlubricated 피 펫 팁, 유리 및 해 부 도구 떼어낸 때 또는 PBS 세척/린스, 조직 손상으로 이어지는 중. 이러한 문제를 방지 하려면 좋습니다 피 펫 팁 및 하지 에탄올 세척 9 잘 유리 접시의 세심 한 윤 활 (접시 비누도 피해 야 한다). 대신, 단순히 증류수 H2O 유리 접시를 청소 하 고 기름칠, PBT 린스 사용 하기 전에 필요한 경우. 해 부 집게가 위, 바늘도 수 주로 청소 한다 증 류 된 H2O, 제외 하 고 이러한 RNA 추출 해 (단계 5.1)에 대 한 준비를 할 때. 그러나, 망막 및 유리 현미경 슬라이드 사이 빛 접착 팔 랑 눈 (단계 3.5.4 3.5.5)를 설치 하는 동안 광학 돌출부에서 눈을 분리 하는 때 슬라이드에 그들을 위치에 지원할 수 있습니다. 마찬가지로, 요리를 해 부 검은 눈의 빛 접착을 평평 하 게 사용할 수 있습니다 그리고 아주 가볍게 스트레칭 단백질 또는 RNA에 대 한 망막 분리 눈 광 엽 연결의 깨끗 한 절단을 용이 하 게 하는 조직 분석 (4.5와 5.6 단계). 우리 서가 위 또는 좋은 면도날은 훌륭한 도구를 신속 하 고 깔끔하게 시 돌출부에서 떼어낸된 눈을 쪼개 발견 했다.
1 차적인 항 체 얼룩이 지기, 하는 동안 72-잘 마이크로-잘 쟁반 (3.3.5), 단계에서에서 눈 뇌 단지 잠복기 보다 9 잘 유리 접시 대신 사용할 수 있습니다. 밤새 항 체 해결책의 증발을 방지 하기 위해 커버 슬립 또는 슬라이드 유리 접시 우물 뚜껑을 해야 합니다. 그러나,이 방법은 기본 항 체 솔루션의 72-잘 마이크로-잘 트레이 2 우물 사이 분산의 20 µ L 보다 40-50 µ L 6-10 눈 두뇌 단지 9 잘 유리 접시의 한 잘에서 incubated의 일괄 처리에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션의 필요 합니다.
현미경 슬라이드 (3.5 단계)에 눈을 장착 하기 전에 눈 두뇌 단지 (단계 3.4)의 2 차 고정 시 돌출부에서 눈을 쪼개 다 쉽게 하 고 눈은 배 또는 해 부 바늘을 준수 가능성이 조직을 경직 소폭 것입니다. 장착 매체 (3.5.1 단계)에 1-2 h 외피 후 눈 두뇌 단지 약간 불투명 하 고 따라서 설치 하는 동안 볼을 쉽게 된다. 또한, 설치 중간에 1-2 h, 후 대부분 2 차 항 체 적당 하 게 보호 됩니다 형광 이미징 동안 사진 표백에서. 장착은 권장 하지 않습니다이 부드러운 망막을 렌더링 하기 전에 설치 미디어에서 하룻밤 망막 잠복기, 보조 고정 스티프닝 효과 부정 합니다.
서쪽 분석, 대 한 lysate 20 눈의 필요 단백질 초파리 단백질 (예를 들어, 그림 4A)를 견고 하 게 인식 하는 항 체를 사용 하 여 안정적으로 검출 합니다. 그러나, 낮은 식 관심의 대상 단백질의 경우 눈을 더 많이 필요할 수 있습니다. 이후 서 부 럽에 대 한 조직의 세포 불완전 (4.7 단계) 이면 WTLB 샘플에 추가의 볼륨 소폭 증가 될 수 있다 집중된 샘플 버퍼 적절 하 게 조정 (단계 4.9)의 볼륨. RNA 추출에 대 한 눈의 상당한 수의 급속 한 절 개 경우 필요할 수 있습니다 많은 양의 양질의 RNA 분리 하는 목표는 (5.2 단계, 그림 4B참조). 초파리 번데기 눈 해 부 마스터 두 과학자 비행 망막의이 다 수를 동시에 해 부를 공동 작업 하는 경우에,이 잠재적인 단점을 극복할 수 있습니다. 그러나, 필요한 RNA의 총계는 기관 또는 시설 RNA 분석, 유형 RNA 분석 또는 시퀀싱, 실행의 요구 사항에 따라 달라 집니다 그리고 사용 되는 RNA 추출 키트.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 원고에 잭 드럼과 도움이 의견에 대 한 우리의 검토 감사합니다. 이 작품은 R15GM114729에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
