Summary
Bu kağıt doku immünhistokimya, Batı analiz ve RNA-ekstraksiyon için işlenmesi için protokolleri ile birlikte Drosophila pupa retina dissekan için cerrahi bir yöntem sunuyor.
Abstract
Drosophila pupa retina bir mükemmel model sistemi geliştirme sırasında morfogenetik işlemler çalışma için sağlar. Bu yazıda, biz hassas Drosophila pupa retina diseksiyon için güvenilir bir iletişim kuralı mevcut. Bizim cerrahi yaklaşım pupa açmak ve tam olarak ayıklayın göz-beyin kompleksleri için gönüllülük elde edilebilir mikrodiseksiyon araçları kullanır. Bunlar sabit, immünhistokimya ve retina tabi o zaman mikroskop slaytlar monte edilebilir ve hedef hücre veya hücre altı yapıları algılamak için ise görüntüsü. Alternatif olarak, sabitlenmemiş retina olabilir beyin dokusundan izole, uygun arabellekleri lysed ve (protein veya gen ifadesi, sırasıyla değerlendirmek) protein Jel Elektroforez veya mRNA çıkarma için kullanılmaktadır. Önemli uygulama ve sabır açıklanan mikrodiseksiyon Protokolü master için gerekli olabilir, ama hakim sonra protokol çoğunlukla hasarsız retina nispeten hızlı yalıtım sağlar.
Introduction
Drosophila retina pigment hücreleri bir petek kafes1,2,3,4' te düzenlenen çevrili yaklaşık 750 ommatidia oluşur. Her ommatidium sekiz photoreceptor nöronlar, dört lens salgılayan koni hücreleri ve iki birincil pigment hücreleri içerir. Her ommatidium çevreleyen pigment üreten kafes hücreleri ve duyusal kıl grupları vardır. Onun sonrası Mitotik doğa ve klişeleşmiş altıgen düzenleme nedeniyle, Drosophila pupa retina morfogenetik süreçleri hücre adezyon5,6de dahil olmak üzere çalışma için bir mükemmel model sistemi sağlar, 7,8,9,10 ve Apoptozis11,12,13,14,15.
Birkaç yayımlanmış protokol hava basıncı Drosophila pupa16,17,18--dan göz-beyin kompleksleri ayıklamak için kullanmak. Açıklanan protokol burada yerine mikrodiseksiyon araçlar için dikkatli bir şekilde kullanır ve tam olarak göz-beyin kompleksleri hasarsız retina doku elde etme amacı ile izole. Bu retina için kullanılmak üzere iseniz çok önemlidir morfolojik, protein veya gen ekspresyonu inceliyor retina hasar hücresel stres veya hücresel fenotip veya gen ifade değişiklik olabilir ölüm neden olabilir beri. Ayrıca, antrenmandan sonra 6-10 göz-beyin kompleksleri 10-15 dk, yaş ve gelişim aşaması disseke göz dokusunun değişkenlik minimize amacı kolaylaştırmak izole.
Fiksasyon, immunostaining ve aşağıda açıklanan bütün Dağı Protokolü floresan mikroskopi Drosophila gözleri hazırlanması için uygundur. Retina protein ilgi hedefleme antikorlar ile inkübe. Örneğin, antikorlar adherens junction bileşenlerine hücrelerinin apikal circumferences böylece hücre türü de dahil olmak üzere özellikleri, şekil ve düzenleme biçilen19olabilir görselleştirmek için yararlı olabilir. Fiksasyon önce gözleri onun yerine--dan Batı analiz için protein veya RNA qRT-PCR kullanımda veya RNA-sıralama çekme amacıyla beyin i ciddi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. doku hazırlık
- Drosophila kurmak haçlar (20daha önce açıklandığı gibi) veya istenen genotip pupa elde etmek için belirli Drosophila suşları kültür. Emin olmak için çok sayıda pupa rastlantısal ortaya, bu sinek kültürler içinde yinelenen besin açısından zengin gıda medya veya standart gıda medya cömertçe Maya-yapıştır ile desteklenmiş kurarsınız.
- 25 ° C'de Drosophila kültürleri korumak UAS-GAL4 sistemi kullanan haçlar için GMR-GAL4 posterior morfogenetik karık ve pupa geliştirme21,22,23, boyunca larva göz disk hücrelerdeki ifade bir ideal sürücüsüdür 24. bu etkisiz ve endojen β-galaktozidaz protein ifade ediyor gibi ideal bir denetim olarak çapraz UAS lacZ X GMR-GAL4 hizmet vermektedir çapraz.
- Kullanım yavaşça beyaz ön pupa (şekil 1B) sağlıklı kültür tüpleri (şekil 1A) taraftan kaldırın ve 1.5 mL microcentrifuge tüp (şekil 1 c) içine yerleştirmek için distile su ile ıslak oldu bir 6" Bambu tahta ucu.
- Tüpler doku odası, Pupa kuruma (şekil 1 d) korumak için yeterli nem korumak için distile su batırılmış küçük bir parça ile birlikte plastik pipet ucu kutusunun içine koyun. Pupa 25 ° c kadar diseksiyon kuluçkaya.
- Yavaşça microcentrifuge tüp ve çanak dissekan siyah üzerine dışarı pupa itmek için bir kuru 6" Bambu tahta kullanın. Çift taraflı bant taze bir parçası uzak pupa diseksiyon çanak üzerine yatıyordu.
- Forseps bir çift kullanarak, dikkatli bir şekilde (yani, operculums şekil 1B, karşı karşıya) pupa dorsal tarafa teyp (şekil 2A) yerleştirin. Pupa teybe de uymasını sağlamak.
Not: Nem pupa davasında güvenli yapışma teybe, bu durumda inhibe, Pupa çift taraflı bant koymadan önce kurumasını sağlar.
2. göz-beyin kompleksleri diseksiyon
- Forseps her pupa (şekil 2C) operculum kaldırmak için kullanın.
- Dilim veya her pupa pupa olgusu kesmek için mikrodiseksiyon makas kullanın. Flep baş, göğüs ve çift taraflı bant (şekil 2C) pupa çalışmasına kenarlarını güvenliğini sağlama ön karın segmentinde ortaya çıkarmak için pupa dava açın.
Not: Tamamen pupa ortaya çıkarmak gerekli değildir. - Hayvan, kavramak için keskin Forseps ile her pupa karın işlemek ve çıkarmak o kendi pupa halinde (şekil 2C).
- Pupa kaseti uzak siyah diseksiyon çanak üzerine yerleştirin ve buz gibi fosfat tamponlu-çözüm (PBS, pH 7,4) yaklaşık 400 µL ile kaplayın.
- Her pupa karın tarafından mikrodiseksiyon makas ve Forseps ile kavramak, pupa yarıda kesme tüm Toraks ile temiz kesitsel bir kesme yapmak (şekil 2B).
- PBS her karkas posterior kalıntısı çıkarın ve parçalara çanak üzerinde bir yana koymak (değil atmak, adım 3.2.1 bakınız).
- İki çift iyi forseps kullanarak, Toraks ve baş-in göz-beyin kompleksi (şekil 2E) ortaya çıkarmak için her pupa açın. Bunu yapmak için Toraks epitel kesim kenarlarını kavramak ve yavaş yavaş Toraks açın ve sonra kapsül, göz-beyin karmaşık ve çevresindeki yağ dokusu açığa kafa için gözyaşı.
- Doku açgözlü olmadan, forseps göz-beyin karmaşık baş kapsül kalıntıları uzak Kılavuzu veya yırtık-açık kafa Kapsül dan göz-beyin karmaşık Kepçe için kullanın.
Not: Göz-beyin karmaşık dumbbell şeklinde, off-beyaz ve daha şeffaf çevreleyen krem rengi FAT (şekil 2B, E). - Forseps ile dikkatlice göz doku dokunmadan göz-beyin kompleksleri ile ilişkili çoğu yağ çıkarmak.
3. doku ayirt için işlenmesi
- En az 6-10 pupa açıklanan (Adım 2,1 2,9) incelemek.
Not: 3-4 bağımsız çoğaltır kandan her bir hipotezi test etmek için yeterli veri verim eğilimindedir. -
Çamaşır ve fiksasyon
- Bir P20 ucu veya P100 pipet ucu ~ 1 mm çapındaki ipucu açılışına artırmak ve PBS ve yukarı ve aşağı yağ karışımı pipetting tarafından yağlamak için temiz bir tıraş bıçağı ile kesti. Bu yağ adım 2.6 kaldırıldı karkas kalıntıları elde edilebilir.
- Göz-beyin kompleksleri ~ 400 µL PBS buzda bir 9-şey cam tabak, içine aktarın. Yağlanmış ipucu ve P20 veya P100 hava deplasman micropipette aktarmak için kullanın.
Not: Göz-beyin kompleksleri pipetting sırasında unlubricated keyif-e doğru uymak ve bozulabilir veya kayıp. - Yukarı ve aşağı yavaşça göz-beyin kompleksleri girdap PBS pipetting tarafından göz doku ile ilişkili kalan yağ çıkarmak. Bu kırılgan göz doku zarar bu ve tüm sonraki çamaşır adımları, doğrudan göz-beyin kompleksleri yukarı ve aşağı pipet değil.
- Asgari miktar göz-beyin kompleksleri transfer (< 20 µL), PBS sabitleştirici en az 250 µL içine. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından karıştırın. Buz üzerinde 35 dk için kuluçkaya.
Not: 3.1.1. adımda hazırlanan aynı yağlanmış ipucu bu transfer için kullanılabilir. - Aynı pipet ucu ile göz-beyin kompleksleri PBS bir de içeren ~ 400 µL aktarın. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından mix ve 5-10dk buzda yıkamak için kuluçkaya. En az iki kez çamaşır adımı yineleyin.
Not: Göz-beyin kompleksleri birkaç saat son PBS yıkama, buz üzerinde veya adım 3.3.1 geçmeden önce 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
-
Antikor boyama
- Antikor çözümler maruz önce doku engellemek için göz-beyin kompleksleri PBT ~ 400 µL için transfer. Yağlanmış ipucu ve P20 veya P100 hava deplasman micropipette transferi için kullanın. 10-60 dakika, buz üzerinde kuluçkaya.
- Birincil antikor çözüm PBT uygun antikor sulandrarak hazırlayın. Göz-beyin kompleksleri antikor çözüm 10 µL aliquots içinde inkübe, hazırlanan birim bir çoğaltma 10 olacaktır.
- 72-şey microwell tepsi temiz bir kuyuya antikor çözümün aliquot 10 µL (konuya bakın).
- P10 pipet ucu ~0.5 mm çapındaki ipucu açılışına artırmak ve pipetting PBT tarafından yukarı ve aşağı yağlamak için temiz bir tıraş bıçağı ile ucu kesilmiş.
- Hayır daha--dan 5 göz-beyin kompleksleri, bir ses aktarım < PBS, 3 µL de antikor çözüm P10 hava deplasman micropipette ve yağlama ipucu kullanarak her 10 µL içine.
- Antikor çözüm çözüm yukarı ve aşağı pipetting tarafından lunaparkçı. Bu doku zarar verir gibi yukarı ve aşağı göz-beyin kompleksleri pipette değil.
- Antikor çözüm buharlaşma en aza indirmek için doku distile su içine microwell tepsi batırılmış küçük bir parça yer ve belgili tanımlık tepsi (sağlanan Örneğin, kapak ile) mühür. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
- Göz-beyin kompleksleri microwell tepsiden PBT 9 benzetti cam tabak yıkama ~ 400 µL aktarın. Bir P10 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu (3.3.4. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın) kullanın. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından karıştırın. 5-10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- En az iki kez çamaşır adımı yineleyin. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu göz-beyin kompleksleri yıkama çözümleri arasında aktarmak için kullanın.
- İkincil antikor çözüm uygun fluorophore öğesini ikincil antikor PBT gerektiği gibi sulandrarak hazırlayın. İkincil antikor çözeltinin 100 µL 6-10 pupa toplu yeterlidir. Aliquot ikincil antikor çözüm 9 benzetti cam diseksiyon çanak içine.
- Göz-beyin kompleksleri ikincil antikor çözüm aktarın. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve ipucu PBT yağlanır transferi için kullanmak.
- 1-2 h oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 3-5 h için ikincil antikor çözümde göz-beyin kompleksleri kuluçkaya Fluorophores ışık tarafından beyazlatma önlemek için hazırlık folyo ile kapak.
Not: Kuluçka ikincil antikor çözümünde en uygun süresi kullanılan birincil ve ikincil antikorları göre farklı olabilir. - Göz-beyin kompleksleri PBT bir 9-şey cam tabak yıkama ~ 400 µL aktarın. Yukarı ve aşağı belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından karıştırın. 5-10 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Bu çamaşır adım en az iki kez yinelenmelidir.
-
İkincil fiksasyon
- İkincil bir fiksasyon için sabitleştirici en az 200 µL için göz-beyin kompleksleri aktarmak ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 35 dk. 20 dk için kuluçkaya
Not: İkincil fiksasyon montaj (Adım 3.5) AIDS göz doku stiffens. - P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu göz-beyin kompleksleri için 5 dk yıkamayı PBT buz üzerinde bir 9-şey cam tabak ~ 400 µL içine aktarmak için kullanın.
- En az bir kez yıkama adımı yineleyin.
- Kullanım bir P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve göz-beyin kompleksleri için 1-2 dk. durulama için PBS buz üzerinde bir 9-şey cam tabak ~ 400 µL içine aktarmak için ipucu PBT yağlanır pipetting PBS yanında devinim dokusunda ama doku olmadığı tutmak , yukarı ve aşağı yerleşme ve cam yemek için PBS-durulama sırasında kalarak göz-beyin kompleksleri önlemek için.
- İkincil bir fiksasyon için sabitleştirici en az 200 µL için göz-beyin kompleksleri aktarmak ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 35 dk. 20 dk için kuluçkaya
-
Montaj
- Göz-beyin kompleksleri medya montaj ~ 200 µL aktarın. P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve PBT yağlanır ipucu göz-beyin kompleksleri aktarmak için kullanın. 1-2 h için ortam takma equilibrate doku sağlar.
- 5-8 µL damla taze montaj medya temiz mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
- P10 ucu ile temiz jilet ~0.5 mm çapındaki ipucu açılışına artırmak ve bu ve bir P10 hava deplasman micropipette 5-8 µL ortam slayt üzerinde takma damla içine medya montaj göz-beyin kompleksleri aktarmak için kullanın kesin.
- İki tungsten iğneler gözleri optik loblar ayırmak için kullanın. Slayda bir göz-beyin karmaşık bir sağlam tungsten iğne ile pin ve onun ilişkili optik LOB uzak her gözün iyi tungsten iğne (şekil 2F) ile dilim.
- Her göz mikroskop slayt yüzeyine her göz için slayt bitişik Bazal yüzeyi ile manevra için iyi tungsten iğne kullanın. Yavaşça temiz kapak notu üzerinde doku düşürmek ve oje ile güvenli.
Not: böylece onlar birbirlerine yakın veya bir çizgi vardır gözleri slayt üzerinde düzenleme sonraki mikroskobu kolaylaştıracaktır. - Floresan veya confocal mikroskobu kullanılarak retina görüntü.
Not: Slaytlar 4 ° C'de depolanan değilse hemen görüntüsü.
4. Western Blot hazırlığı Eye doku:
- 10-16 pupa (Adım 2.1-2,9) aşağıdaki değişiklikler ile incelemek: a) toplamak ve pupa 10-15 dk arayla iki gruplar halinde incelemek ve b) fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile (PBS + pi) takıma PBS incelemek.
- Bir P20 kullanarak göz-beyin kompleksleri aktarmak veya P100 deplasman micropipette hava ve PBS + pi buz üzerinde bir 9-şey cam tabak kısaca durulama için ~ 400 µL (Adım 3.2.1 olduğu gibi hazır) ipucu yağlanır.
Not: Sonraki adımlar 4.3 ve 4.4 yağlama bu uç kullanılabilir. - Durulama adım iki kez tekrarlayın.
- Tüm göz-beyin kompleksleri ~ 400 µL buz soğuk PBS + pi temiz siyah bir diseksiyon yemek çıkarmak içine aktarın.
- Her gözün optik (sürekli göz-beyin kompleksi için) sağlam tungsten iğne kullanarak loblar kaldırmak ve bir güzel tıraş bıçağı veya mikrodiseksiyon temiz kesim her gözün optik LOB makas.
Not: Gözleri bu aşamada 'yapışkan' olan ve hafifçe diseksiyon yemek için uygun. (Konuya bakın) optik loblar gözlerinden kaldırılması kolaylaştıracak yardımcı olabilir gibi avantajlıdır. - 'Tüm gözler 'yığınına' Tarama' PBS + forseps iyi bir çifti bir bıçak kullanarak pi diseksiyon çanak üzerinde.
- P10 bahşiş ~0.5 mm çapındaki ipucu açılışına genişletmek ve yukarı ve aşağı uç-iç tarafından pipetting Western doku lizis arabellek (WTLB) yağlamak için temiz bir tıraş bıçağı ile kesti.
- PBS + pi 5 µL göz-beyin kompleksleri bir 500 µL microcentrifuge tüp içine aktarın. Bu yağlama uç ve P10 hava deplasman micropipette transferi tamamlamak için kullanın.
- Microcentrifuge tüp Buza koyun. 1 birim (5 µL) örnek, WTLB ve 2 x yoğun protein örnek arabelleği 10 µL (veya 5 x yoğun protein örnek arabelleği 2.5 µL) ekleyin. Dokunarak karıştırın.
- Girdap microcentrifuge kısaca tüp ve bir masaüstü Mini santrifüj kullanarak örnek spin.
- -20 ° C'de örnek analiz kadar saklayın. Standart protokolleri kullanarak analiz.
5. hazırlık göz dokusunun RNA çıkarılması için:
- Eldiven, temiz benchtop, mikroskop, diseksiyon araçları ve çanak ilk % 70 etanol ve ardından RNase dekontaminasyon reaktif dissekan siyah giyiyor. Kurumasını sağlar.
- 30-40 pupa gibi tarif (adımlar 2,1 2,9) aşağıdaki değişiklikler ile incelemek: bir) toplamak ve incelemek 6-8 pupa gruplar halinde, 15-20 dk ayrı; b) teşrih nükleaz ücretsiz PBS ve c) ayrı ayrı her toplu göz izole ama tüm retina doku aynı microcentrifuge tüpüne (Adım 5.5) birikir.
Not: iki kişi aynı anda parçalara sahip verimli yalıtım iyi göz dokusunun hızlanır. - Her toplu işlem için göz-beyin kompleksleri (Adım 2.1-2,9) ve bir P20 veya P100 hava deplasman micropipette ve yağlama ipucu (3.1.2. adımda açıklandığı gibi hazırlanmış) kullanarak transfer içine ~ 400 µL PBS bir 9-şey cam tabak nükleaz ücretsiz kısaca, buzda, durulama, izole etmek.
Not: Sonraki adımlar için 5,4, 5.5 ve 5,8 yağlama bu uç kullanılabilir. - Durulama adım iki kez tekrarlayın.
- Göz-beyin kompleksleri çanak dissekan siyah üzerinde temiz bir buz gibi PBS nükleaz ücretsiz taze 400 µL damla aktarın.
- Her gözün optik (karmaşık göz beyin sürekli için) sağlam tungsten iğne kullanarak loblar kaldırmak ve bir güzel tıraş bıçağı veya mikrodiseksiyon temiz kesim her gözün optik LOB makas.
Not: Gözleri bu aşamada 'yapışkan' olan ve hafifçe diseksiyon yemek için uygun. (Konuya bakın) optik loblar gözlerinden kaldırılması kolaylaştıracak yardımcı olabilir gibi avantajlıdır. - 'Tüm gözler 'yığınına' forseps iyi bir çifti bir bıçak kullanarak nükleaz ücretsiz PBS içinde parçalanmış çanak üzerinde süpürme'.
- Gözleri bir steril RNase free microcentrifuge tüp için aktarmak ve flash-sıvı azot kıpırdama.
- Diseksiyon (Adım 5,3 5,8) her toplu işleminin pupa yineleyin. Gözlerin her toplu iş iş bir tüp içinde tüm gözler biriktirmek için sıvı azot (Adım 5.5) muhafaza edilmiştir aynı microcentrifuge tüp içine aktarın.
- -80 ° C'de örnekleri RNA ayıklama kadar saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pupa göz gelişimsel süreçleri araştırmak için mükemmel bir model hizmet veren bu sürücü morfogenez kolayca erişilebilir bir dokudur. Burada, retina disseke ve ayirt apikal adherens kavşaklar (şekil 3A, C) veya apoptosis (şekil 3)25sırasında aktif Dcp-1 caspase (şekil 3D) algılamak için kullanılan. Bu yaklaşımlar açıkça işe alım ve morfogenetik Primer hücre (dan 18 h APF) dahil olmak üzere önemli morfogenetik işlemleri sırasında hücreler gözlemlemek izin, kafes enterkalasyon kurulması her ommatidium (18-24 h APF), hücreleri Tersiyer niş (21-24 h APF), değişiklikler hücre boyutu ve şekli (dan 18 h için 40 h APF) ve Apoptozis (18 ~ 33 h APF) dan. Morfogenetik bu olayların zamanlaması sıcaklık bağımlıdır ve bu nedenle alçakgönüllülükle yanıt kuluçka sıcaklıklarda farklı laboratuvar ayarlarında küçük farklılıklar olarak değişir. Ancak, yaklaşık 40 h tarafından APF, hücre son düzenleme genellikle elde edilir (şekil 3B, C) ve bu genetik mutasyon sonuçlarını değerlendirmek için ideal bir yaşta veya gen ekspresyonu değiştirilmiş. Örneğin, aşağıdaki Ektopik ifade Diap1, bir çekirdek inhibitörü apoptosis caspase harekete geçirmek (şekil 3 c)26, bizim yaklaşım bir denetime GMR karşılaştırıldığında kafes hücre sayısı sonucu artış ölçmek sağlar > lacZ retina. Bir de kolayca apoptosis daha doğrudan anti-Dcp-1 antikor veya ölmek üzere olan hücreleri (3D şekil) algılamak için diğer yaklaşımlar kullanarak değerlendirebilirsiniz.
Göz lysate varlığı ve/veya göreli ifade ilgi proteinlerin belirlemek için Batı analizi kullanılarak sorguya çekilmeyi. Burada, biz DE-cadherin, tespiti göstermek adherens kavşaklar, vahşi türü Canton S retina çekirdek bileşenidir 21 ve 40 h APF gözler (4A rakam) kesmiştim. Bu örnek Western blot miktar (düzgün şekil 4A) DE-Cadherin, göreli bir ifade farklı değildir ki önemli ölçüde bu iki zaman-nokta, ne zaman bant yoğunluk GAPDH (bir çekirdek ifade göre Normalleştirilmiş, ortaya metabolik enzim). Bu tür analizler genellikle onaylatılacak yerine sadece bir kez içinde burada gösterildiği gibi yapılacak.
Bir gen ekspresyonu Gelişmiş sıralama uygulamaları (örneğin, Next-Gen, RNA-seq) kullanarak analiz etmek istiyorsanız yüksek saflıkta mRNA Drosophila pupa retina dan izole etmek için esastır. Genotip veya deneysel durumu başına 60'tan fazla göz Anatomi kişinin hedef izole etmek için ise en iyi olduğunu bulduk > yüksek kaliteli RNA (şekil 4B) 1 mg. İşte, bir Absorbans spectra gözlerinden 40 h APF (4B rakam, üst panel) disseke 57 vahşi türü Canton S , izole bir RNA örnek bir örnek göstermektedir. 260 tepe Absorbans nm karşılık gelen RNA Absorbans dalga boyu için. Biz de RNA verim ve A260/A280 ve A260/A230 saflık oranları 21 h ya da 40 h APF toplanan altı RNA örneklerini yansıtan bir tablo mevcut. Bu veriler RNA ayıklanan RNA ince farklılıkları verim yansıtır.
Resim 1 : Seçim ve pupa diseksiyon için kültür. (A)Üçüncü larva biçim (L3) dolaşıp larva ve pupa sağlıklı Drosophila kültürler kenarları boyunca bulun. Pigment henüz koruyucu pupa durumda oluşturulacak olduğu gibi (B) ön pupa onların yarı saydam beyaz renk tarafından tespit edilebilir. Pupa önünde-arka ve dorsal ventral ekseninin mavi renkle gösterilir. Bir nemli Bambu tahta çıkarmak ve şişe duvarlarından ön pupa almak için kullanılır. (C) pupa uygun şekilde etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüpler yerleştirilir (genotip, koleksiyonunun Tarih ve saat toplama) ve (D) kültürlü bir oksijen odasına monte bir boş pipet ucu kutusundan iç. Nem kutusunun içini nemli doku bir parça yerleştirerek korunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Pupa göz Anatomi. (A)pupa çanak anatomi bir siyah çift taraflı teybe yapıştırılır. Ön, arka ve dorsal koordinatları mavi renkle gösterilir. (Göz-beyin kompleksleri (bir tek bir burada gösterilir), (C) pupa izole etmek için,B) pupa onun davadan önce kaldırılır. Önemli bu işlemdeki adımlar gösterilir. Kırmızı çizgiler, gözyaşı ve operculum kaldırıldıktan sonra pupa dava açmak nereye gösteriyor. Pupa Forseps ile yırtık pupa davadan sonra kaldırılır. (D) maruz bir pupa ilk mikrodiseksiyon makas (kesikli kırmızı çizgi ile belirtilen konumu) ve daha sonra dikkatlice açık yırtık kafa epitel (Kırmızı oklar), (opak göz-beyin kompleksi ortaya çıkarmak için,E) gösterildiği gibi göğüs kesilir. (F) uygun antikorlar ile kuluçka retina göz-beyin kompleksleri dilimlenmiş. Önemli bu işlemdeki adımlar gösterilir. Göz-beyin sağlam tungsten iğne ile (solda) stabil ve retina iyi tungsten iğne (sağda) ile kaldırıldı. Protein ve RNA analizleri için sabitlenmemiş retina optik loblar iyi tungsten iğne yerine iyi bir jilet veya mikrodiseksiyon makas kullanarak temiz bir şekilde kesebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Pupa göz ayirt. DE-cadherin etiket apikal adherens kavşaklar pupa göz hücrelerinin antikor(a). Tüm görüntüler panelinde A confocal mikroskobu, en az bir görüntü işleme yazılımı ile modifiye kullanarak bir retina merkezi bölgesinde toplanan ve aynı ölçekte sunulur (ölçek çubuğu 5 mikron =). Büyüme ve yeniden 18 h APF hücre 27 h APF unutmayın. Bir tek tam desenli ommatidium 40 h APF (solda) ve bir ommatidium kesit içinde apikal görünümünün (B) karikatür. Hücre tipleri anahtar içinde listelendiği gibi renk kodlu. Photoreceptors pseudostratified neuroepithlium yüzeyinin altında gömülü ve koni ve pigment hücreleri tarafından çevrili. Üç kıl grup her ommatidium çevreleyen. (C) hangi lacZ (solda) ifade edildi ya da ikincil ve üçüncül pigment hücrelerinin apoptosis etkisizleştirmek için Diap1 (sağda) denetim retinada küçük bölgelerinde. Adherens kavşak anti-DE-cadherin ile etiketlerine göre cep telefonu numarasını, düzenleme ve şekil analizi sağlar. Görüntüleri standart floresan mikroskopisi kullanılarak ele geçirildi. (D) bir tüm retina antikorlar ile inkübe Dcp-1, çok sayıda hücre göz kuru erik apoptosis sırasında aktif bir caspase aktif. Görüntü confocal mikroskobu kullanarak ele geçirildi. Beyaz noktalı çizgi göz özetliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Protein ve gen ifade analizleri pupa göz. (A)Western blot (solda) 21 h APF ya da 40 h APF disseke 28 gözünde probed antikorlar ile de-cad için ve yükleme denetimi, GAPDH olarak. Analizleri protein grubu yoğunluklarını (sağda) karşılaştırılabilir konsantrasyonları retina, GAPDH göre bu gruplar mevcut de-cad ortaya koymaktadır. (B) tek Absorbans spektrum Canton S retina çıkarılan bir RNA örnek 40 h APF (üst) kesmiştim. Not Absorbans tepe 260 nm. Tablo 21 ve 40 h APF (alt) izole Canton S pupa retina çıkarılan RNA miktarı ve saflık oranları belgeleyen. Bu veriler üç bağımsız örnek kümelerinden ortaya çıkmaktadır. Pupa her örnek kümesi için kaldırdı ve aynı koşullarda inkübe ve aynı gün disseke. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila pupa göz diseksiyon burada açıklanan yöntemi 6-10 göz-beyin kompleksleri 10-15 dakika içinde yalıtım olanak sağlar. Ancak, sabır ve uygulama diseksiyonu tekniği master ve diseksiyonu hızını ve kalitesini geliştirmek için gereklidir. Bu kısa diseksiyon kez her gözün retina bir veri kümesindeki fenotip veya gen ifadesi değişkenliği azaltmak yaklaşık aynı gelişimsel sahne, sağlanır. Alternatif iletişim kuralları daha az pratik master için gerekli olabilir ederken, bizim iletişim kuralı sistemli bir şekilde hassas retina doku yırtılma veya yamultma, çünkü göz hasarı stres yolu harekete geçirmek neden ya da bile riskini en aza indirerek yalıtmak için tasarlanmıştır hücre ölümü. Yeni başlayanlar için ilk master genç gözler teşrih girişiminde bulunmadan önce 40 h APF kültürlü pupa diseksiyon tavsiye ediyoruz. Olduğu her zaman yeterli pupa koleksiyonu (Adım 1.3) için kullanılabilir sağlayacaktır tüm deneyler (Adım 1.1) için REPLICATE kurma haçlar tavsiye ediyoruz. Retina timepoints çeşitli bağlı olarak araştırmacı ilgi farklı morfogenetik etkinlik pupa geliştirme sırasında disseke. Bunlar işe alım ve morfogenetik Primer hücre (dan 18 h APF), enterkalasyon kafes hücre (18-24 h APF), üçüncül niş (21-24 h APF) kurulması, hücre boyutu ve şekli (dan 18 h için 40 h APF) değişiklikler ve Apoptozis (dan 18 ~ 33 h APF) içerebilir (Şekil 3A).
Pupa durumda (Adım 2.2, şekil 2C) ilk açılışı sırasında bir pupa Toraks delinmiş Eğer araştırmacı hala diseksiyon ile devam etmek gerekir. Ancak, başından başlangıçta delinmiş, hasarsız göz-beyin kompleksleri ayıklanması zor olabilir. Bir pupa kendi pupa halinde (Adım 2.3, şekil 2C, doğru kapı aynası) kaldırırken karın pupa durumda bazen çift taraflı bant çıkarmak ve pupa'nın karın hakkında sarılı kalır. Bu pek mümkün değildir bir engel, pupa karın kadar PBS tarafından çevrili ve bağlı savrulabilir rağmen pupa durumda kopmuş pupa (Adım 2.6). Retina dokusunun bütünlüğünün korunması için bu sabit veya mümkün olduğunca çabuk pupa ilk delik sonra dondurulmuş zorunludur. Buna ek olarak, buz gibi çözümleri kullanarak ve her yerde mümkün protokol boyunca doku ve daha iyi ayirt için önde gelen hücresel bütünlüğü korur doku buz üzerinde (veya 4 ° C'de) Bakımı protein-analiz veya RNA-analiz. İkinci uygulamalar için tüm beyin kaldırmak önemlidir ve bu doku olarak gözlerinden yağ dokusu analizleri (Adım 2,9 ve 4.3 ya da 5,4) kontamine.
Pupa göz-beyin karmaşık unlubricated pipet ipuçları, cam ve diseksiyon araçları sabitlenmemiş ya da sırasında PBS yıkar/durular, doku hasarı için önde gelen uygun. Bunu önlemek için pipet ipuçları ve etanol ile 9-şey cam bulaşıkları yıkama titiz yağlama öneririz (bulaşık deterjanı da kaçınılmalıdır). Bunun yerine, sadece cam yemekleri ile distile H2O temiz ve yağlamak, gerekirse, PBT durulama ile kullanmak için önceden. Diseksiyon pens, makas ve iğneler de esas olarak distile H2ile O, dışında bunlar RNA-ekstraksiyon diseksiyonu (Adım 5.1) için hazırlanırken temizlenmelidir. Ancak, retina ve cam mikroskop slaytlar arasında ışık yapışma gözleri açılıyor ve onları (Adım 3.5.4 ve 3.5.5) montaj sırasında optik loblar gözlerini ayıran zaman slaytlar üzerinde konumlandırma yardımcı olabilir. Benzer şekilde, yemekler dissekan siyah gözlere hafif yapışma düzleştirmek için kullanılabilir ve çok hafif streç temiz göz optik LOB bağlantı kesilmesinin retina protein veya RNA için izole zaman kolaylaştıran doku (Adım 4.5 ve 5.6) inceliyor. Biz mikrodiseksiyon makas ya da iyi bir tıraş bıçağı sabitlenmemiş gözleri optik loblar hızlı ve temiz bir şekilde ayırmak için mükemmel araçlar bulduk.
Birincil antikor boyama sırasında göz-beyin kompleksleri (3.3.5. adım) 72-şey mikro-şey kasetlerine kuluçka yerine bir 9-şey cam tabak yerine kullanılabilir. Antikor çözüm gecede buharlaşma önlemek için cam tabak wells bir kapak notu veya slayt ile kap emin olun. Ancak, bu yaklaşım 20 µL 72-şey mikro-şey tepsi 2 kuyu arasında dağıtılmış birincil antikor çözüm yerine, 40-50 µL 9-şey cam tabak bir kuyuda inkübe 6-10 göz-beyin konut projeleri bir dizi için birincil antikor çözüm gerektirir.
Gözleri mikroskop slaytlarda (Adım 3.5) montaj önce göz-beyin kompleksleri (Adım 3.4) ikincil fiksasyonu marjinal böylece gözler optik loblar ayırmak daha kolaydır ve gözleri katlamayın veya diseksiyonu iğneler için uygun daha az olasılığı doku pekiştirmek. Montaj orta (Adım 3.5.1) 1-2 h kuluçka sonra biraz opak ve bu nedenle daha kolay montaj ederken görmek göz-beyin kompleksleri haline. Buna ek olarak, montaj orta 1-2 h sonra çoğu ikincil antikorlar uygun floresan görüntüleme sırasında fotoğraf beyazlatma gelen korunacaktır. Bu retina yumuşak işler gibi montaj tavsiye edilmez önce retina montaj medyada gecede kuluçka, ikincil fiksasyon sertleşme etkisi inkâr.
Batı analizleri için lysate en az 20 göz güvenilir sağlam Drosophila proteinler (örn., şekil 4A) tanımak antikorları kullanarak proteinler algılamak için gerekir. Ancak, hedef protein ilgi düşük ifade ise gözler daha çok sayıda gerekli olabilir. Sonraki Western Blot için doku lizis eksik (Adım 4.7) ise, WTLB örnek için eklendi hacmi marjinal arttırılabilir ve konsantre örnek arabellek (Adım 4,9) buna göre ayarlanabilir hacmi. Eğer amaç çok miktarda yüksek kaliteli RNA yalıtmak için RNA çıkarma için gözleri önemli sayıda hızlı diseksiyon gerekli olabilir (Adım 5.2, şekil 4Bbakınız). Drosophila göz pupa diseksiyon hakim olması iki bilim adamları bu sayıda sinek retina aynı anda incelemek için işbirliği bu potansiyel dezavantajı üstesinden. Ancak, kurum veya performans RNA analizi, RNA analizi veya sıralama, tesis gereksinimlerini temel gerekli RNA toplam miktarına bağlıdır ve kullanılan RNA ekstraksiyon kiti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
El yazması üzerinde Zack davul ve bizim yorumcular yararlı yorumlar için teşekkür ederiz. Bu eser R15GM114729 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
