Summary
Nematode Caenorhabditis elegans er en fremragende model for dissekere vært-patogen interaktioner. Beskrevet her er en protokol til at inficere orm med medlemmer af mitis gruppe streptokokker og bestemme aktivering af oxidative stress reaktion mod H2O2 produceret af denne gruppe af organismer.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), en fritlevende nematode, fremstod som en attraktiv model til at studere vært-patogen interaktioner. Den præsenterede protokol bruger denne model til at bestemme patogenicitet forårsaget af mitis gruppe streptokokker via produktion af H2O2. Mitis gruppe streptokokker er en spirende trussel, der forårsager mange menneskelige sygdomme såsom bakteriæmi, endocarditis, og orbital cellulitis. Beskrevet her er en protokol til at bestemme overlevelse af disse orme som svar på H2O2 produceret af denne gruppe af patogener. Ved at bruge gen skn-1 kodning for en oxidativ stress reaktion transskription faktor, er det vist, at denne model er vigtige for at identificere vært gener, der er væsentlige mod streptokok infektion. Desuden er det vist, at aktivering af oxidative stressrespons kan overvåges i nærværelse af disse patogener ved hjælp af en transgene reporter orm stamme, hvor SKN-1 er sammenvokset til grøn fluorescerende proteiner (NGL). Disse assays giver mulighed for at studere oxidative stress reaktionen på H2O2 afledt af en biologisk kilde i modsætning til eksogent tilføjet reaktive ilt arter (ROS) kilder.
Introduction
Mitis gruppe streptokokker er menneskelige latente i svælg cavity1. Men, disse organismer kan undslippe denne niche og forårsage en række invasive sygdomme2. Infektioner forårsaget af disse mikroorganismer omfatter bakteriæmi, endocarditis, og orbital cellulitis2,3,4,5,6. Desuden, de dukker op som agenser af infektioner i blodet i immunkompromitterede, neutropeni, og kræftpatienter, der har undergået kemoterapi5,7,8,9 .
Mekanismerne underliggende mitis gruppe patogenesen er uklare, fordi få virulens faktorer er blevet identificeret. Gruppen mitis er kendt for at producere H2O2, som har vist sig for at spille en vigtig rolle i mundtlig mikrobielle samfund10. For nylig, flere undersøgelser har fremhævet en rolle for H2O2 som en cytotoxin, der inducerer epitelcelle død11,12. S. lungebetændelse, der tilhører denne gruppe, har vist sig at producere høje niveauer af H2O2 der inducerer DNA-skader og apoptose i alveolær celler13. Ved hjælp af en akut lungebetændelse dyremodel, vist de samme forskere, at produktionen af H2O2 af bakterier giver en virulens fordel. Undersøgelser på pneumokok-meningitis har også vist, at patogenet-afledte H2O2 virker synergistisk med pneumolysin til at udløse neuronal celle død14. Disse observationer fastsætter klart, at H2O2 produceret af denne gruppe af bakterier er vigtig for deres sygdomsfremkaldende evne.
Interessant, har det også vist sig at medlemmer af mitis gruppe S. mitis og S. oralis medføre døden af den ødelægge C. elegans via produktion af H2O215,16. Denne fritlevende nematode har været brugt som en enkel, genetisk tractable model til at studere mange biologiske processer. Mere nylig, ormen er opstået som en model til at studere vært-patogen interaktioner17,18. Derudover har flere undersøgelser fremhævet vigtigheden af at studere oxidativt stress ved hjælp af denne organisme19,20,21. Dens korte livscyklus, evne til knockdown gener af interesse af RNAi og brug af grønne fluorescerende proteiner (NGL)-sammensmeltet reportere til overvågning af genekspression er nogle af de attributter, der gør det til en attraktiv modelsystem. Endnu vigtigere, er de veje, der regulerer oxidativ stress og medfødt immunitet i ormen meget bevaret med pattedyr20,22.
I denne protokol, er det vist hvordan C. elegans til at belyse patogenicitet forårsaget af streptokok-afledte H2O2. En modificeret overlevelse assay er vist, og medlemmer af gruppen mitis er i stand til at dræbe ormene hurtigt via produktion af H2O2. Ved hjælp af medlemmer af gruppen mitis, en vedvarende biologisk kilde af reaktive ilt arter er (ROS) fastsat, i modsætning til kemiske kilder, der inducerer oxidativt stress i worms. Endvidere, bakterier er at kolonisere orme hurtigt, hvilket gør til H2O2 rettes direkte til tarmens celler (sammenlignet med andre kilder, der er nødt til at krydse flere barrierer). Analysen er valideret, enten 1) ved fastsættelsen overlevelse af skn-1 mutant stamme eller 2) ved at banke ned skn-1 ved hjælp af RNAi i orme i forhold til N2 vildtype og vektor kontrol behandles orme. SKN-1 er en vigtige transkriptionsfaktor, der regulerer oxidative stressrespons i C. elegans23,24,25. Ud over overlevelsen assays bruges en orm stamme at udtrykke en SKN-1B/C::GFP transgene reporter til at overvåge aktivering af oxidative stress respons via produktion af H2O2 af gruppen mitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af THY (Todd-Hewitt gærekstrakt) Agar plader
- 1 L medier, tilføje 30 g af Todd-Hewitt pulver, 2 g af gærekstrakt og 20 g agar til en 2 L erlenmeyerkolben. 970 mL deioniseret vand tilsættes til kolbens indhold og omfatter en røre bar. Autoklave medier ved en temperatur på 121 ° C og tryk på 15 lb/tommer2 til 30 min. Derefter indstille medierne på en røre pladen og mulighed for køling med blid omrøring.
- Hæld medierne i passende størrelse sterile petriskåle (100 mm x 15 mm retter for vækst og vedligeholdelse af bakterier, 35 mm x 10 mm retter for at dræbe assays) under en laminar flow. Give medierne til at tørre i 2 h under laminar kølerhjelmen. Derefter kan pladerne opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
2. forberedelse af ødelægge vækstmediet (NGM) og RNAi fodring plader (NGM RNAi)
- Bruger en røre bar, Opløs 2,5 g pepton og 3 g NaCl i 970 mL deioniseret vand i en 2 L erlenmeyerkolben. Tilsættes 20 g agar til medierne. Autoklave medier ved en temperatur på 121 ° C og tryk på 15 lb/tommer2 til 30 min. sæt medierne på en røre pladen og mulighed for køling med blid omrøring.
- Tilføj følgende løsninger til medier for forberedelse af NGM plader: 25 mL 1 M kalium fosfat buffer (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL 95% ethanol) kolesterol , 1 mL (10% v/w i ethanol) nystatin, og 1 mL af 25 mg/mL streptomycin.
- Tilføj følgende løsninger til medier for forberedelse af NGM RNAi fodring plader: 25 mL 1 M kalium fosfat buffer (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL 95% ethanol) kolesterol , 1 mL (10% v/w i ethanol) nystatin, 1 mL 50 mg/mL carbenicillin og 1 mL af IM IPTG.
- Hæld medierne i 60 mm x 15 mm sterile petriskåle under laminar flow. Give medierne til at tørre i 2 h under laminar kølerhjelmen. Efterfølgende, kan pladerne opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
3. vedligeholdelse af C. elegans
- Frø NGM plader af spotting 50 µL af natten vokset E. coli OP50 i midten af pladerne. E. coli kultur er udarbejdet tidligere i Luria-Bertani (LB) medier og opbevares ved 4 ° C i flere måneder. Dække pladerne og lade dem tørre i 24 timer under en laminar hætte og derefter gemme pladerne i polystyren container.
- Under et dissekere mikroskop, afhente 10 til 12 fælderne voksne ved hjælp af en steril orm pick og overføre orme til en E. coli OP50 seedet NGM plade. Inkuber plader ved 20 ° C natten over.
- Den næste dag, fjerne de voksne ved hjælp af en steril orm pick og tillade embryoner at udvikle til L4 larver ved 20 ° C (~2.5 dage).
4. forberedelse af synkron befolkning af orme
-
Vaske fælderne voksne fra to til fire NGM plader ved hjælp af M9W og samle dem i en 15 mL konisk slange.
- At forberede M9W: Kombiner 3 g NaCl, 6 g Na2HPO4og 3 g KH2PO4 og opløses i en endelige mængden af 1 L deioniseret vand. Autoklave løsningen og tilsættes 1 mL 1 M MgSO4.
- Spin tube på 450 x g i 1 min., derefter dekanteres samtidig med at orm pelleten forbliver intakt.
- Tilføj 400 µL af 8,25% natriumhypochlorit (husstand blegemiddel) og 100 µL af 5 N NaOH til at forberede orm lysis løsning. Tilføje lysis løsning til orm pellet og blande indholdet af svippede røret indtil 70% af de voksne orm er mængden. Periodisk overholde indholdet af rør under et dissekere mikroskop for at sikre, at der er ingen overbleaching af æggene.
- Fortynd blegemiddel blandingen ved at føje 10 mL af M9W til indholdet af den koniske rør.
- Spin rør ved 450 x g i 1 min. Decant supernatanten, hvorefter der tilsættes 10 mL af M9W.
- Gentag trin 4.5 to gange mere.
- Resuspenderes resulterende æg i 3-5 mL af M9W. Røret anbringes på en tube rotator. Tillad rør til at rotere med en hastighed på 18 rpm ved stuetemperatur (RT) natten over.
- Den næste dag, spin rør ved 450 x g i 1 min til pellet L1 larver. Fjerne de fleste af M9W ved aspiration, efterlod ~ 250 µL af væske i røret. Resuspend L1 larver og sted tre 5 µL dråber af ormen suspension på en petriskål låg, så skøn antallet af orme pr. µL ved hjælp af en dissekere mikroskop.
5. induktion af RNAi i Worms
- Ved hjælp af en steril loop eller pluk, streak ud de ønskede stammer af RNAi-holdige E. coli fra frosne lagre (Ahringer og Vidal biblioteker) på 100 mm x 15 mm LB agar plader der indeholder 50 µg/mL carbenicillin og 15 µg/mL tetracyclin. Inkuber plader ved 37 ° C i 24 timer.
- Pluk og podes en isoleret koloni fra den ønskede RNAi stamme i sterile 15 mL konisk rør indeholdende 2 mL af LB suppleret med 50 µg/mL carbenicillin. Inkuber rør ved 37 ° C i 16 h i en orbitalryster på 150 rpm.
- Den næste dag, sprede 150 µL af overnight dyrket kultur på 65 mm x 15 mm NGM RNAi fodring plader ved hjælp af en steril sprederen. Inkuber plader ved 37 ° C i 24 timer.
- Tillad plader køle af til RT efter inkubation ved 37 ° C. Tilføje et passende volumen af M9W indeholdende ~ 200 L1 larver (fremstillet af den synkrone befolkning af orme trin) til E. coli seedede NGM RNAi fodring plader. Inkuber plader ved 20 ° C, indtil larverne når L4 fase (~2.5 dage).
6. forberedelse af Mitis gruppe streptokokker for infektion
- Streak ud ønskede stammer af streptokokker på 100 mm x 15 mm THY agar (hvis plader var opbevares ved 4 ° C, før varme plader til 37 ° C før striber de respektive stammer), derefter inkuberes plader ved 37 ° C natten over (~ 18 h) i en candle krukke giver en microaerophilic en vironment for vækst af streptokokker (stribet pladerne kan opbevares i en uge ved 4 ° C).
- For at udbrede kliniske isolater af streptokokker, brug tryptic soja blod agar. Inkuber plader ved 37 ° C i en candle krukke natten over (~ 18 h).
- Den næste dag, fjerne pladerne fra stearinlys krukken og vælge isolerede kolonier ved hjælp af en steril løkke. Podes 15 mL sterilt koniske rør indeholdende 2 mL af THY bouillon. For at udbrede kliniske isolater af streptokokker, supplere THY bouillon med 5% v/v får blod. Lukke hætter stramme og inkuberes rør ved 37 ° C under statiske betingelser.
7. overlevelse Assays
Bemærk: De forskellige trin i denne analyse er afbildet i figur 1. For at demonstrere, at H2O2 afledt af mitis gruppe er ansvarlig for drabet på ormen, supplere medier med katalase, eller mutant stamme ΔspxB og supplere stamme ΔspxB; spxB + S. gordonii kan bruges. SpxB koder til en pyruvat oxidase, som er ansvarlig for produktionen af H2O2 i gruppen mitis.
- Pre varme 35 mm x 10 mm THY plader til 37 ° C. Tilsættes 80 µL af overnight dyrket kulturer af de ønskede stammer af streptokokker og sprede bakterier helt på tværs af agar overfladen ved hjælp af en steril sprederen. Inkuber plader ved 37 ° C i en candle krukke natten over (~ 18 h). Som kontrol, frø to 35 mm x 10 mm NGM plader med 80 µL af overnight dyrket kulturer af E. coli OP50. Inkuber plader ved 37 ° C natten over.
- For at bekræfte, at H2O2 produceret af gruppen mitis er ansvarlig for drabet på ormene, tilføje 50 µL indeholdende 1.000 enheder af katalase c på THY plade. Sprede katalase løsning ved hjælp af en steril sprederen og tillade pladerne tørre i laminar flow i 30 min. frø plader derefter med de respektive streptococcus stammer som beskrevet i trin 7.1.
- Den næste dag, Fjern pladerne fra stearinlys krukken og lad plader køle af til RT for 10-15 min. ved hjælp af en steril orm pick, overførsel 30 L4 larver fra NGM eller NGM RNAi fodring plader til streptococcus seedede THY plader. Brug to seedede THY plader med i alt 60 orme pr. stamme af streptococcus. Inkuber plader ved 25 ° C.
- Ved hjælp af en dissekere mikroskop, tælle antallet af levende og døde L4 larver på hver plade på flere timepoints. I første omgang, score orme som døde eller levende hvert 30 min. Derefter, når orme hurtigt begynder at dø, score dem med 15 min. intervaller. Brug steril orm pick til at forsigtigt prod orme og afgøre, om de er død eller levende. En orm anses døde, hvis der ikke er nogen bevægelse i den kraftig tilskyndelse.
- Analysen vil tage 5-6 h at fuldføre. Gentage forsøget to gange mere. Efter færdiggørelsen af analysen, samle data fra de to plader. Input data fra hver gruppe, sammenligne overlevelse kurver og udføre Kaplan-Meier overlevelses analyse ved hjælp af statistisk software.
8. forberedelse af Agarosen puder til mikroskopi
- Opløs 2% w/v i Agarosen i ionbyttet vand ved opvarmning løsning i en mikrobølgeovn. Et volumen på 5 mL af opløsning er tilstrækkelig til at forberede 20 dias.
- Stick lab tape på langs to glas lysbilleder. Dette vil bestemme tykkelsen af Agarosen puder. Placere et rent glas dias mellem de to tapede dias.
- Plads 100 µL af smeltet Agarosen på midten af den rene dias. Umiddelbart placerer en anden rene glas på toppen af den smeltede Agarosen og tryk forsigtigt ned til at gøre en pad. Tillad Agarosen at størkne og efterfølgende fjerne den øverste dias. Agarosen pad er klar til brug.
9. observation af SKN-1 lokalisering i svar til Streptococcus smitte
Bemærk: De forskellige trin i denne analyse er afbildet i figur 2. Lokalisering af SKN-1 blev bestemt ved hjælp af SKN-1B/C::GFP transgene orm stamme. For at demonstrere lokalisering af SKN-1 produktion af H2O2 af gruppen mitis, wild-type (WT), ΔspxB, og de supplerer stamme ΔspxB; spxB + S. gordonii blev brugt. Derudover blev transgene reporter stamme SKN-1B/C::GFP og RNAi indblanding teknik brugt til at påvise, at komponenter af p38 MAPK pathway regulere lokalisering af SKN-1.
- Pre varme 35 mm x 10 mm THY plader til 37 ° C. Tilsættes 80 µL af overnight dyrket kulturer af de ønskede stammer af streptococcus og sprede bakterier helt på tværs af agar overfladen ved hjælp af en steril sprederen. Inkuber plader ved 37 ° C i en candle krukke natten over (~ 18 h). Som kontrol, frø tre 35 mm x 10 mm NGM plader med 80 µL af overnight dyrket kulturer af E. coli OP50. Ruger disse plader ved 37 ° C i ~ 18 h.
- Den næste dag, Fjern plader fra stearinlys krukken og lad plader køle af til RT for 10-15 min. vask L4 larver ved hjælp af M9W fra NGM og NGM RNAi fodring plader. Indsamle orme i 15 mL konisk rør.
- Spin rør på 450 x g i 1 min. Decant supernatanten og der tilsættes 10 mL af M9W.
- Gentag trin 9.3 tre flere gange.
- Resuspend orme i ~ 250 µL af M9W og sted tre 5 µL dråber orm suspension på en ren petriskål låg og estimere antallet af orme pr. µL ved hjælp af en dissekere mikroskop.
- Tilføje ~ 100 L4 larver til hvert THY streptococcus seedede og NGM E. coli seedede plader. Brug tre plader pr. stamme af bakterier. Inkuber plader i 2 til 3 timer ved 25 ° C.
- Derefter fjerne pladerne fra rugemaskinen, vaske dem med M9W, og indsamle orme i 15 mL konisk rør.
- Vaske orme 3 x som beskrevet i trin 9.3.
- Fjerne de fleste af M9W ved aspiration og tilføje 500 µL af M9W indeholdende 2 mM natrium indeholder eller 2 mM tetramisole hydrochlorid til orm pellet. Dette vil bedøver orme, at sikre, at ingen bevægelse opstår når afbildet under mikroskop.
Forsigtighed: Bruge personlige værnemidler (PPE), når du håndterer natriumazid. Forberede indeholder løsning under en kemisk hætte. - Inkuber orm pellets på RT for 15 min. Derefter, spot 15 µL af ormen suspension på en rede Agarosen pad. Anbring forsigtigt en no. 1,5 coverslip over Agarosen pad indeholdende de bedøvede orme.
- Bruger et mikroskop for fluorescerende, visualisere lokalisering af SKN-1 udnytte FITC og DAPI filtre. Billede orme på 10 x og 20 x forstørrelse.
- Score ormene baseret på niveauet for lokalisering af SKN-1. Ingen nukleare lokalisering, lokalisering af SKN-1B/C::GFP i den forreste eller bageste af ormen og nukleare lokalisering af SKN-1B/C::GFP i alle tarmcellerne er kategoriseret som low, medium og høje niveauer af lokalisering, henholdsvis.
- Efter scoring de fluorescerende micrographs, bestemme de statistiske forskelle af chi-kvadreret og Fisher eksakt test ved hjælp af statistisk software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medlemmer af mitis gruppe S. mitis, S. oralis, og S. gordonii hurtigt dræbt orme, i modsætning til S. mutans, S. salivarius, og ikke-sygdomsfremkaldende E. coli OP50 (fig. 3A). Den mediane overlevelse for S. mitis, S. oralis, og S. gordonii var 300 min, 300 min. og 345 min, henholdsvis. For at bestemme, hvis drab blev formidlet af H2O2, blev katalase suppleret til THY agar. Drabet på ormene blev afskaffet i overværelse af katalase (fig. 3B). Du kan yderligere bekræfte om streptokok afledte H2O2 medieret drab af orme, overlevelse på ΔspxB mutant stamme, WT stamme og supplement stamme ΔspxB; spxB + S. gordonii blev analyseret. Død af orme blev ikke observeret på ΔspxB mutant stamme i forhold til wild-type og supplere stammer (figur 3C). Disse data tyder på, at H2O2 produceret af gruppen mitis medierer drab af orme. Vi har også observeret lignende drab kinetik når ormene blev udsat for kliniske isolater af mitis gruppe streptokokker fremstilles af blod fra kræftpatienter (figur 3D). Baseret på data, blev patogenicitet forårsaget af H2O2 produceret af mitis gruppe streptokokker vurderet.
For at identificere vært gener, der er væsentlige mod streptokok infektioner, skn-1 blev slået ned, som koder for oxidative stress reaktion transskription faktoren i C. elegans. Derefter, overlevelse i forhold til vektor kontrol behandles orme blev sammenlignet. En betydelig nedgang i overlevelse af skn-1 knockdown orme blev observeret i forhold til vektor kontrol behandles orme (figur 4A). Disse data blev yderligere valideret ved hjælp af en skn-1 mutant stamme, og dens overlevelse blev sammenlignet med N2 vildtype orm. Vi observerede en lignende drab fænotype som skn-1 mutant, som set med skn-1 knockdown, demonstrerer, at SKN-1 påvirket overlevelsen af orme på gruppen mitis (fig. 4B).
Dernæst blev det fastslået, om H2O2 produceret af gruppen mitis forårsaget lokalisering af SKN-1B/C::GFP i worms. Lokalisering af SKN-1B/C::GFP blev observeret i orme udsættes for wild-type og supplement pletter og ikke som reaktion på ΔspxB mutant stamme af S. gordonii (figur 5A, B). Desuden, for at bestemme aktivering af SKN-1, komponenter af p38 MAPK pathway blev slået. Reduceret lokalisering af SKN-1B/C::GFP i nsy-1, sek-1, pmk-1, og skn-1 knockdown orme i forhold til vektor kontrol behandles orme blev observeret. Data tyder p38 MAPK er nødvendige for aktivering af SKN-1 som svar på H2O2 produceret af gruppen mitis (figur 5C, D).
Figur 1 : Rutediagram skildrer de forskellige trin i forberedelsen af overlevelse assays. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Rutediagram skildrer trin involveret i lokalisering af SKN-1 under infektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : H2O2-medieret aflivning af C. elegans af mitis gruppe streptokokker. Kaplan-Meier overlevelse kurver af L4 larver udsat for (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, og E. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, og E. coli OP50 på THY plader i overværelse af 1.000 U af katalase. (C) S. gordonii WT, ΔspxB mutant og ΔspxB; spxB + supplement stammer på N2 L4 larver. (D) S. oralis (Verlagsgesellschaften #3), S. oralis (Verlagsgesellschaften #4), S. mitis (Verlagsgesellschaften #10), S. mitis (Verlagsgesellschaften #13) og E. coli OP50. Data er repræsentative for eksperimenter gentages to eller flere gange, med n = 60 orme for hver betingelse. Kaplan-Meier log rank analyse blev brugt til at sammenligne overlevelse kurver og beregne den mediane overlevelse. P værdier < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Dette tal er blevet ændret og tilpasset med tilladelse15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : SKN-1 er nødvendig for overlevelse af orme på S. gordonii. (A) overlevelse af vektor kontrol behandles og skn-1 knockdown orme udsættes for S. gordonii. (B) overlevelse af N2 og skn-1(zu67) mutant orm fodret på S. gordonii. Data er repræsentative for eksperimenter gentages to eller flere gange, med n = 60 orme for hver betingelse. Kaplan-Meier log rank analyse blev brugt til at sammenligne overlevelse kurver og beregne den mediane overlevelse. P værdier < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Dette tal er blevet ændret og tilpasset med tilladelse15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Streptokok H2O2 medieret aktivering af SKN-1 er afhængig af p38 MAPK pathway. (A) repræsentative billeder af lokalisering af SKN-1B/C::GFP i orme udsættes for WT, ΔspxB mutant og ΔspxB; spxB + supplement stammer af S. gordonii. Nærbilleder er vist i de øverste højre hjørner af hvert billede. Skalalinjen = 100 µm. (B) graden af nukleare lokalisering af SKN-1B/C::GFP og procentdel af orme i hver kategori fodret på WT, ΔspxB mutant og ΔspxB; spxB + supplement stammer af S. gordonii. Betydelig blev lave niveauer af nukleare lokalisering af SKN-1B/C::GFP observeret i ΔspxB mutant (p < 0,0001) i forhold til WT og ΔspxB; spxB + supplement stammer af S. gordonii. (C) repræsentative billeder af lokalisering af SKN-1B/C::GFP i nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown og vektor kontrol behandles orme på S. gordonii. Nærbilleder er vist i de øverste højre hjørner af hvert billede. Skalalinjen = 100 µm. (D) graden af SKN-1B/C::GFP nukleare lokalisering og procentdel af orme i hver kategori fodret på nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown og vektor kontrol behandles orme på S. gordonii. Betydelig blev lave niveauer af nukleare lokalisering af SKN-1B/C::GFP observeret i nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), pmk-1 (p < 0,0001),og skn-1 knockdown (p < 0,0001) i forhold til vektoren kontrol behandles orme på S. gordonii. Større end 100 orme udsættes for hver stamme var afbildet, og eksperimentet blev gentaget tre gange. Dette tal er blevet ændret og tilpasset med tilladelse15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne metoder kan bruges til andre patogene bakterier såsom Enterococcus faecium, som også producerer H2O2 dyrkes under anaerob eller microaerophilic betingelser26. Typisk for de fleste sygdomsfremkaldende organismer tager det flere dage til uger at gennemføre overlevelse assays. Den robuste produktion af H2O2 af medlemmer af gruppen mitis, kunne disse assays afsluttes inden for 5-6 h under de beskrevne betingelser. Dette sikrer evnen hen til raster flere gen kandidater involveret i vært immunitet og oxidative stress reaktionen over en kort tidsperiode.
I denne protokol er H2O2 produceres af bakterier i direkte kontakt med tarmcellerne af orm, i modsætning til andre udefrakommende ROS kilder, der skal krydse flere barrierer. Dette sikrer, at H2O2 leveres til tarmcellerne; dermed er en mere robust drab svar observeret i ormen. Bruger fluorescently mærket bakterier, blev det fastslået, at ormene udsættes for patogener i 30 min for komplet kolonisering af og tarmkanal15. Det tilrådes at bruge mindre end 1 uge gamle streak plader af streptokok stammer for at sikre deres levedygtighed og evne til at producere H2O2. Derudover de streptokok stammer skal dyrkes under microaerophilic forhold for optimal produktion af H2O2. L4 larver eller 1 dag gamle voksne kan bruges til dette assay. Det er afgørende, at alle orme anvendt i et eksperiment er køn og samme alder. Yngre orme har tendens til at dø langsomt i forhold til ældre hermafroditter. L4 dyr er mere let at skelne, fordi deres udvikling vulva er synlige på midten krop som en klar patch, der står i kontrast til resten af kroppen. Det er også vigtigt, at ingen E. coli OP50 overføres til streptococcus seedede plader. Forurening af drab plader med E. coli kan forårsage dæmpning eller ophævelse af drabet på orm. For at undgå forurening, er det nødvendigt at vælge orme fra E. coli græsplæne. Når scoring overlevelse assays, anbefales det at observere svælg pumpning, fouragering hoved eller krop bevægelse funktionsmåde. For at sikre, at ormen er død, anbefales det at forsigtigt stikke næsen, side af kroppen eller hale og observere nogen bevægelse.
RNAi fodring og overlevelse af orme på gruppen mitis blev kombineret til at identificere kandidater, der er involveret i forsvar mod H2O2. Ved hjælp af genet skn-1 , der koder for en oxidativ stress reaktion transkriptionsfaktor, dens krav for overlevelse af ormen svar på H2O2 er vist her. Derfor kan dette assay tilpasses til skærmen for flere gener og identificere potentielle kandidater til oxidativ stressrespons og immunitet. RNAi fodring af orme er opnået ved at tilføje alder synkroniseret L1 larver at RNAi udtrykker E. coli græsplæner. Under orm synkronisering protokol er det vigtigt at overvåge lysering af ormen neglebånd blegemiddel og natriumhydroxid. Neglebånd af voksne og larver bliver hele tiden opløses, mens embryonerne er delvist beskyttet af tykke æggeskallen. Men længere tids inkubation i overværelse af blede natriumhydroxid mix kan forårsage embryoner til at dø. Det er derfor vigtigt at observere rør indeholdende orme under et dissekere mikroskop periodisk under blegning. Endnu et skridt til at overveje i synkronisering protokollen er vedligeholdelse af anholdte L1 larver. De anholdte larver kan opretholdes på tube rotator til 5 dage ved stuetemperatur. Det anbefales at bruge larverne for RNAi fodring inden for 1 til 2 dage efter klækning. Langvarig vedligeholdelse i M9W kan resultere i dannelsen af dauer fase.
Endelig blev en transgene orm at udtrykke SKN-1 smeltet til normal god landbrugspraksis brugt til at overvåge aktivering af oxidative stressrespons i gruppen mitis. Det fremgår af RNAi at komponenter af p38 MAPK er påkrævet for lokalisering af SKN-1B/C::GFP til kerner af tarmens celler. Det er vigtigt at bruge L3 eller L4 faser af denne stamme til at observere lokalisering af SKN-1B/C::GFP, som lokalisering af SKN-1 tendens til at aftage i den voksne Stadium. Bedre observere lokalisering af SKN-1B/C::GFP, anbefales det at overlappe de fremkomne billeder ved hjælp af FITC og DAPI filterindstillinger. Autofluorescence genereres af lipofuscins bidrage til at give kontrast til observation af SKN-1 lokalisering i ormen. Det har imidlertid også vist sig at signalet fra svagt udtrykt normal god landbrugspraksis journalister er maskeret af autofluorescence fra forskellige kilder i tarmen af ormen. Autofluorescence har vist sig at øge med alderen og er højest i tarmen og livmoderen af C. elegans27. For at overvinde dette problem har udnyttet en nylig undersøgelse en triple band normal god landbrugspraksis filteropsætning for at overvåge lokalisering af SKN-1B/C::GFP i C. elegans28. Denne opsætning adskiller normal god landbrugspraksis signal fra autofluoresence, viser normal god landbrugspraksis og autofluoresence i de grønne og gule kanaler, henholdsvis.
C. elegans bruges i denne protokol til at studere vært-patogen interaktioner og fastslå, hvordan H2O2 produceret af gruppen mitis forårsager sygdomsfremkaldende evne. Vigtigere er, ved hjælp af denne model, kan virkningerne af H2O2 på endoplasmic retikulære stress, mitokondrie skader, mitophagy, autophagy og oxidativ stress undersøges. Derudover kan mekanismer hvorved H2O2 fungerer som et virulens faktor at fremkalde immunrespons ved at forstyrre kerneprocesser af cellen identificeres. Derfor, denne orm er anerkendt som en kraftfuld modelsystem for at opdage nye indsigter i vært-patogen interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas, Tandlægeskolen), Dr. Richard Lamont (University of Louisville, Tandlægeskolen), og Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) for at give laboratorie- og klinisk stammer af mitis gruppe streptokokker. Vi takker også Dr. Keith Blackwell (Institut for genetik, Harvard Medical School) for C. elegans stammer. Endelig, vi takker Dr. Danielle Garsin og hendes lab (The University of Texas, McGovern Medical School) for at give reagenser og ormen stammer til at gennemføre undersøgelsen. Nogle orm stammer blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
