Summary
線虫の線虫は、宿主-病原体相互作用を分析する優れたモデルです。ここで説明した、可鍛鋳鉄群連鎖球菌のメンバーとワームに感染し、H2O2を有機体のこのグループによって生成に対する酸化ストレス応答の活性化を決定するプロトコルです。
Abstract
線虫 (C. elegans)、線虫は、ホスト病原体の相互作用を研究する魅力的なモデルとして登場しました。提案するプロトコルは、H2O2の生産を介して可鍛鋳鉄群連鎖球菌によって引き起こされる病原性を決定するため、このモデルを使用します。可鍛鋳鉄群連鎖球菌菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎など多くの疾患を引き起こす新たな脅威であります。ここで説明した H2O2への応答でこれらのワームの生存を確認するためのプロトコルが病原体のこのグループによって生成されます。酸化ストレス応答転写因子の遺伝子skn 1エンコーディングを使用して、このモデルはレンサ球菌感染に対して不可欠な宿主遺伝子を識別するために重要であることを示す.さらに、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、SKN 1 を融合遺伝子改変レポーター ワームひずみを用いたこれらの病原体の存在下で酸化ストレス応答の活性化を監視できることを示します。これらのアッセイは、H2O2を外ではなく、生物学的ソースによって派生する酸化ストレス応答を勉強する機会が活性酸素種 (ROS) ソースを追加提供します。
Introduction
可鍛鋳鉄群連鎖球菌は、口腔咽頭腔1の人間共生生物です。ただし、これらの生物はこのニッチを脱出し、侵襲性疾患2のさまざまなを引き起こすことができます。これらの微生物によって引き起こされる感染症は、菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎2,3,4,5,6に含まれます。さらに、彼らは浮上して血流感染症の病原体としての免疫不全、好中球減少、および化学療法5,7,8,9を受けている癌患者.
可鍛鋳鉄グループの根本的な発生機序はあいまいなので、いくつかの病原因子が同定されているメカニズムです。H2O2、口腔微生物10で重要な役割を果たすことを示している可鍛鋳鉄グループが知られています。最近では、いくつかの研究は、上皮細胞の死11,12を誘導する毒素としての H2O2の役割を強調しています。このグループに属しているs. 肺炎は、DNA 損傷と肺胞細胞13でアポトーシスを誘導する H2O2の高レベルを生成する示されています。急性肺炎動物モデルを使用して、同じ研究者は、細菌によって H2O2の生産が病原性の利点を付与を示した。肺炎球菌性髄膜炎に関する研究は、その病原体由来 H2O2は神経細胞死14をトリガーするニューモリシンと相乗的行為をも示しています。これらの観察は明らかに病原性の細菌のこのグループによって生成される、H2O2が大事を確立します。
興味深いことに、それも示されている、可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤H2O215,16の生産を介して線虫C. elegansの死を引き起こす口腔単純性疱疹を米します。この線虫は、多くの生物学的過程を研究する、シンプルで扱いやすい遺伝子モデルとして使用されています。最近では、ワームは、宿主-病原体相互作用17,18を研究するモデルとして登場しました。さらに、いくつかの研究は、この有機体19,20,21を使用して酸化ストレスを調査する重要性を強調しています。そのライフ サイクルは短い、RNAi が興味の遺伝子をノックダウンし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の使用能力-融合レポーター遺伝子の発現を監視する、いくつかの魅力的なモデル システムにする属性。もっと重要なは、酸化ストレスとワームの自然免疫を調節する経路は哺乳類20,22と非常に節約されます。
このプロトコルではc. の elegansを使用してレンサ球菌由来 H2O2による病原性を解明する方法を示した。変更された生存分析が表示され、可鍛鋳鉄グループのメンバーが急速にワームを殺すことでH2O2の生産。活性酸素種の持続的な生物的源可鍛鋳鉄グループのメンバーを使用してこの (ROS) がワームで酸化ストレスを誘発する化学のソースではなく、提供されます。さらに、細菌は急速に、ワームを植民地化することができる H2O2 (いくつかの障壁を交差する必要がある他の情報源と比較して) 腸管細胞へ直接ターゲットとすることができます。アッセイは、どちらかskn 1変異株のまたは 2) N2 野生型を基準にしてワームおよびベクター駆除処理されたワームで RNAi を用いたskn 1ノックダウンの生存を決定する 1) によって検証されます。SKN 1 はc. の elegans23,24,25の酸化ストレス応答を調節する重要な転写因子です。生存の試金、以外 SKN-1 b/C::GFP 遺伝子改変レポーターを表現するワームひずみは可鍛鋳鉄グループによる活性化、酸化ストレス応答を介してH2O2の生産を監視するために使用されます。
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Protocol
1. 汝 (トッド ・ ヒューイット酵母エキス) 寒天の調製
- メディアの 1 L は、トッド ・ ヒューイット パウダー、酵母エキスと 2 L の三角フラスコに寒天 20 g 2 g の 30 g を追加します。970 mL の脱イオン水をフラスコの内容に追加し、攪拌棒を含めます。オートクレーブ 15 ポンド/インチ2 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア。その後、メディアを撹拌プレート上に設定し、穏やかな攪拌しながら冷却を可能にします。
- 層流の下で適切に大きさで分類された滅菌シャーレ (35 × 10 mm 皿でアッセイを殺す細菌の成長と維持のため 100 mm × 15 mm 皿) にメディアを注ぐ。層流フードの下で 2 時間乾燥するメディアを許可します。その後、プレートを 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
2. 線虫培 (NGM) と RNAi プレート (NGM RNAi) の供給の準備
- 攪拌棒を使用して、2.5 g ペプトンと 970 ml の脱イオン水 2 L の三角フラスコでの塩化ナトリウム 3 g を溶解します。寒天 20 g をメディアに追加します。オートクレーブ 15 ポンド/インチ2 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア撹拌プレートにメディアを設定し、穏やかな攪拌しながら冷却を可能にします。
- NGM プレートの準備のためメディアに以下のソリューションを追加: 25 mL の 1 M カリウム リン酸バッファー (pH = 6.0)、1 M MgSO4、1 M CaCl2、(95% エタノールに 5 mg/mL) コレステロールの 1 mL の 1 mL の 1 mL、1 mL (10% のエタノールで v/w) ナイスタチンと 25 mg/mL ストレプトマイシンの 1 mL。
- NGM RNAi プレートを給餌の準備のためメディアに以下のソリューションを追加: 25 mL の 1 M カリウム リン酸バッファー (pH = 6.0)、1 M MgSO4、1 M CaCl2、(95% エタノールに 5 mg/mL) コレステロールの 1 mL の 1 mL の 1 mL、(10% のエタノールで v/w) ナイスタチンの 1 mL、50 mg/mL carbenicillin 1 mL と IM IPTG の 1 mL。
- 層流の下で滅菌シャーレ 60 mm × 15 mm にメディアを注ぐ。層流フードの下で 2 時間乾燥するメディアを許可します。その後、1 ヶ月、4 ° C でプレートを格納できます。
3. c. の elegansのメンテナンス
- シード一晩 50 μ L スポッティングによる NGM 板には、プレートの中央にエシェリヒア属大腸菌OP50 が栽培されています。大腸菌文化はルリア ベルターニカミラ (LB) メディアに事前に準備し、数ヶ月のための 4 ° C で保存します。プレートをカバーし、層流フードの下で 24 時間乾燥し、その後プレートをポリスチレン容器に格納できるようにします。
- 解剖顕微鏡の下で滅菌ワーム ピックを使用して妊娠大人 12 名に 10 をピックアップし、大腸菌にワームを転送 OP50 シード NGM プレート。20 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
- 次の日は滅菌ワーム ピックを使用して大人を削除し、20 ° c (~2.5 日) L4 幼虫に成長する胚を許可します。
4. 人口ワームの同期の準備
-
2 M9W を使用して 4 つの NGM プレートから妊娠の大人を洗浄し、15 mL の円錐管でそれらを収集します。
- M9W を準備する: 塩化ナトリウム 3 g、6 g の Na2HPO4KH2PO4の 3 g を結合し、最終的な量 1 L の脱イオン水に溶解します。オートクレーブ ソリューション 1 M MgSO4の 1 つの mL を追加。
- 1 分の 450 x gでチューブをスピンし、ワームのペレットがままを確保しつつ、上清をデカントします。
- 8.25% ナトリウム次亜塩素酸 (家庭用漂白剤) の 400 μ L とワームの換散ソリューションを準備する 5 N NaOH の 100 μ L を追加します。ワーム ペレットを溶解ソリューションを追加し、大人のワームの 70% が分離するまで管をフリックで内容をミックスします。卵の overbleaching がないように解剖顕微鏡下でチューブの内容を定期的に観察します。
- M9W の 10 mL をコニカル チューブの内容に追加することで漂白剤ミックスを希釈します。
- 1 分デカント上澄みの 450 x gでチューブをスピンし、M9W の 10 mL を追加します。
- 4.5 の手順を 2 回繰り返します。
- 3-5 ml M9W 結果卵ペレットを再懸濁します。チューブ回転にチューブを置きます。一晩常温 (RT) 18 rpm の速度で回転するチューブを許可します。
- 次の日は、L1 幼虫を餌に 1 分間、450 x gでチューブをスピンします。管の液体の ~ 250 μ L を残して、吸引によって M9W のほとんどを削除します。L1 幼虫を再懸濁します、シャーレの蓋、解剖顕微鏡を用いた μ L 当たりワーム数を推定上にワーム懸濁液の場所 3 5 μ L が値下がりしました。
5. ワームの RNAi の誘導
- 生殖を使用してループやピックアップ、50 μ G/ml carbenicillin とテトラサイクリンの 15 μ G/ml を含む 100 mm × 15 mm LB 寒天プレートの上に冷凍株 (Ahringer とヴィダル ライブラリ) から必要な RNAi を含む大腸菌系統を連勝。24 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。
- ピックアップし、50 μ G/ml carbenicillin を添加した LB の 2 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に、RNAi ひずみから隔離されたコロニーを接種します。150 rpm で軌道シェーカーの 16 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
- 次の日は 150 μ L 滅菌スプレッダーを使用して 65 mm × 15 mm NGM RNAi 給餌プレートの上に一晩培養の広がった24 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。
- 37 ° C で培養後 RT に冷却板を許可します。大腸菌(ワーム ステップの人口同期から取得) ~ 200 L1 幼虫を含む M9W の適切なボリューム シード餌板 NGM RNAi を追加します。幼虫 L4 段階 (~2.5 日) に達するまでは、20 ° C で版を孵化させなさい。
6 可鍛鋳鉄群連鎖球菌の感染症のための準備
- 汝の寒天 100 mm × 15 mm の希望菌株のレンサ球菌を連勝 (プレートが 4 ° C で保存されている場合事前ウォーム プレートは 37 ° C それぞれの菌株をストリー キングする前に)、微好気の en を提供するキャンドル瓶に 37 ° C 一晩 (~ 18 h) でプレートをインキュベート(縞板は 4 ° C で 1 週間保存できます) レンサ球菌の成長のための環境。
- レンサ球菌の臨床分離株を反映するには、トリプシン大豆血液寒天培地を使用します。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
- 次の日はキャンドル瓶からプレートを取り外して滅菌ループを使用して隔離されたコロニーを拾います。汝の液 2 mL を含む 15 mL 滅菌円錐管を接種します。レンサ球菌の臨床分離菌を繁殖させる補完 THY ヒツジ血の 5 %v/v とスープ。タイトなキャップを閉じ、静的条件下 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
7 試金のサバイバル
注:このアッセイに必要な手順は、図 1に描かれています。グループはワームの殺害を担当、可鍛鋳鉄で H2O2が派生したことを示すため、カタラーゼ、または変異株 ΔspxBとメディアを補完し、補完するひずみ ΔspxB; spxB + s. gordoniiのことができます。使用します。SpxB は、H2O2剤群の生産に責任があるピルビン酸オキシダーゼをエンコードします。
- 35 × 10 mm をあらかじめ暖かい 37 ° c. に汝のプレートレンサ球菌の目的の系統の一晩の栽培文化の 80 μ L を追加し、滅菌スプレッダーを使用して寒天表面に細菌を完全に 。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。としてコントロール、エシェリヒア属大腸菌OP50 の一晩の栽培文化の 80 μ L でシード 2 35 ミリメートル × 10 mm NGM プレート。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
- H2O2可鍛鋳鉄グループ プロデュースがワームの殺害に責任があることを確認、追加、なたにカタラーゼ c の 1,000 台を含む 50 μ L プレート。滅菌スプレッダーを使用してカタラーゼ溶液を広がり、30 分シードそれぞれ連鎖球菌株手順 7.1 で説明されているようでその後プレートを層流で乾燥するプレートを許可します。
- 次の日キャンドル瓶からプレートを削除でき、滅菌ワームを使用して 10-15 分の RT に冷却するプレートを選ぶ、NGM またはレンサ球菌にプレートを供給 NGM RNAi から転送 30 L4 幼虫シード汝のプレートが。2 シード株のレンサ球菌あたり 60 ワームの合計で汝のプレートです。25 ° C で版を孵化させなさい
- 解剖顕微鏡を使用して、各板いくつか縦長時ライブとデッドの L4 幼虫の数をカウントします。当初は、死者のようにワームをスコア、またはライブ 30 分毎。その後、ワームは急速に死に始め場合、は、15 分間隔でそれらをスコアします。優しくデッドオアア ライブかどうかワームを突くし滅菌ワーム ピックを使用します。ワームは動き、催促に応答がない場合、死者と見なされます。
- アッセイは、完了する 5 〜 6 時間かかります。2 回以上の実験を繰り返します。分析が完了したら、2 つのプレートからデータをプールします。各グループのデータを入力、生存曲線を比較し、統計ソフトを用いたカプラン ・ マイヤー生存分析を実行します。
8. Agarose パッドの顕微鏡検査のための準備
- 電子レンジでソリューションを加熱することによって 2 %w/v 脱イオン水で寒天を溶解します。5 mL の溶液の量が 20 スライドを準備する十分です。
- ラボのテープの 2 つのガラス スライドに沿って縦棒します。これは agarose パッドの厚さを決定します。録音された 2 つのスライドの間のきれいなガラス スライドを配置します。
- きれいなスライドの中央に溶融 agarose の場所 100 μ L。すぐに溶融 agarose の上に別のきれいなガラスを置き、軽くパッドを作成する押し下げます。アガロースを固めるし、その後一番上のスライドを削除するを許可します。アガロース パッドは使用可能です。
9.連鎖球菌感染に応答 SKN 1 局在の観察
注:このアッセイに必要な手順は、図 2で描かれています。SKN 1 のローカリゼーションは、SKN-1 b/C::GFP トランスジェニック ワームひずみを使用して決定されました。(WT) H2O2可鍛鋳鉄のグループは、野生型の生産のため SKN 1 のローカライズ、ΔspxB、およびを補体ひずみΔspxB; spxB + s. gordoniiを示すために使用されました。さらに、遺伝子改変レポーターひずみ SKN-1 b/C::GFP と RNAi 干渉は、p38 MAPK 経路のコンポーネントが SKN 1 のローカリゼーションを規制することを示すため使用されました。
- 35 × 10 mm をあらかじめ暖かい 37 ° c. に汝のプレート連鎖球菌の目的の系統の一晩の栽培文化の 80 μ L を追加し、滅菌スプレッダーを使用して寒天表面に細菌を完全に 。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。としてコントロール、エシェリヒア属大腸菌OP50 の一晩の栽培文化の 80 μ L でシード 3 35 ミリメートル × 10 mm NGM プレート。37 ° C 〜 18 時間でこれらの版を孵化させなさい。
- 次の日、キャンドル瓶からプレートを削除、NGM から M9W を使用して 10-15 分洗浄 L4 幼虫の RT に冷却するプレートと NGM RNAi 給餌プレート。15 mL の円錐管にワームを収集します。
- 450 x gで 1 分間、上清をデカントでチューブをスピンし、M9W の 10 mL を追加します。
- 9.3 のステップを 3 回繰り返します。
- M9W の ~ 250 μ L でワームを再懸濁し、きれいなペトリ皿にワーム懸濁液の場所 3 つの 5 μ L 滴蓋し解剖顕微鏡を用いた μ L 当たりワームの数を推定します。
- 汝の連鎖球菌シードそれぞれ、NGM大腸菌シード プレート 100 ~ L4 幼虫を追加します。細菌の株あたり 3枚のプレートを使用します。25 ° C で 2 に 3 h の版を孵化させなさい
- その後、インキュベーターからプレートを削除、M9W で洗って、15 mL の円錐管にワームを収集します。
- ワーム 3 を洗って x に従って手順 9.3。
- 吸引により、M9W の大部分を除去し、M9W 含む 2 mM ナトリウム アジ化または 2 mM tetramisole 塩酸塩を 500 μ l 添加をワームのペレットに追加します。これはワーム、顕微鏡下でイメージを作成するとき、移動は行われませんを確保を麻酔が。
注意:アジ化ナトリウムを処理するときは、個人保護用具 (PPE) を使用します。化学のフードの下でアジ化ソリューションを準備します。 - 15 分間常温ワーム餌を孵化させなさい。その後、準備されたアガロース パッドにワーム懸濁液の 15 μ L スポット。号 1.5 coverslip を麻酔下のワームを含む agarose パッドにそっとかぶせます。
- 蛍光顕微鏡を用いた、SKN 1 利用フィルター FITC と DAPI のローカリゼーションを視覚化します。10 x、20 x の倍率でワームをイメージ。
- SKN 1 の局在化のレベルに基づくワームをスコアします。核局在化、SKN-1 b/C::GFP 前部または後部のワームでのローカリゼーション、SKN-1 b/C::GFP すべての腸細胞の核局在化として分類されるない低、中、高レベルのローカリゼーションのそれぞれ。
- 蛍光顕微鏡を得点した後 chi - 乗と統計解析ソフトウェアを使用したフィッシャーの正確なテストの統計的な差異を決定します。
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Representative Results
可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤、 s. 口腔単純性疱疹とs. gordonii急速に死亡とは対照的に, S. mutans、 s. レンサと非病原性大腸菌のワームは、OP50 (図 3A)。剤、 s. 口腔単純性疱疹、 S. gordoniiの生存期間の中央値は 300 分、300 分、345 分であった。殺害された H2O2によって仲介されるかどうかを決定するには、カタラーゼは汝の寒天に補われました。ワームの殺害は、カタラーゼ (図 3B) の存在下で廃止されました。さらにレンサ球菌派生 H2O2媒介ワーム、ΔspxB変異株、WT 株と補完するひずみ ΔspxB; spxB + s. gordoniiの生存の殺害であるかどうかを確認するには、を行った。野生型と比較して ΔspxB変異株のワームの死見られなかった (図 3C) の系統を補完します。これらのデータは、H2O2可鍛鋳鉄グループ プロデュースがワームの殺害を仲介することをお勧めします。ワームは (図 3D) がん患者の血液から得られる可鍛鋳鉄群連鎖球菌の臨床分離株にさらされたとき、また同様の殺害の動態を見ました。データに基づいて、H2O2剤群連鎖球菌によって生成されるによって引き起こされる病原性が評価されました。
レンサ球菌感染に対して不可欠な宿主遺伝子を識別するためにskn 1 、ノックダウンされたの酸化ストレス応答転写因子のエンコードを線虫。次に、ベクトル制御処理ワームに対する生存率を比較しました。ベクトル制御処理ワーム (図 4A) と比較してskn 1ノックダウン ワームの生存率の有意な減少が認められました。このデータのさらにskn 1変異株を用いた検証し、その生存が N2 野生型ワームを比較しました。見ましたskn 1変異として同じような殺害表現型、 skn 1ノックダウンで見る SKN 1 影響可鍛鋳鉄グループ (図 4B) 虫の生存であることを示します。
次に、H2O2がワームで SKN-1 b/C::GFP の局在化を引き起こした可鍛鋳鉄グループによって生成されたかどうかが確認されました。SKN-1 b/C::GFP の局在は、野生型と補体の汚れ (図 5A, B) のS の gordoniiの ΔspxB変異株ではない応答にさらされた線虫にみられた.さらに、SKN 1 の活性化を決定する p38 MAPK 経路のコンポーネントはノックダウンされました。ベクトル制御処理ワームに対するskn 1 pmk-1 スウェーデン クローナ 1 nsy 1ノックダウン ワーム SKN-1 b/C::GFP の減らされた局在が認められた.データは、p38 MAPK は SKN 1 H2O2可鍛鋳鉄グループ (図 5C, D) によって生成された応答の活性化のために必要を示唆しています。
図 1: 生存の試金の準備に必要な手順を描いたフローチャート。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 感染 SKN 1 の局在に必要な手順を描いたフローチャート。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: H2O2- c. の elegansの殺害による可鍛鋳鉄群連鎖球菌。(A) s. gordonii、 s. 口腔単純性疱疹、剤、 s. 以上の結果、 , S. mutansおよびエシェリヒア属大腸菌OP50 にさらされる L4 幼虫のカプラン ・ マイヤー生存曲線。(B) s. gordonii、 s. 口腔単純性疱疹、剤、 s. 以上の結果、 , S. mutansおよび 1,000 U カタラーゼの存在下で汝のプレートのエシェリヒア属大腸菌OP50。(C) S. gordonii WT、ΔspxB変異体および ΔspxB; spxB + N2 L4 幼虫の系統を補完します。(D) S. 口腔単純性疱疹(VGS #3)、 s. 口腔単純性疱疹(VGS #4)、剤(VGS #10)、剤(VGS #13)、エシェリヒア属大腸菌OP50。データが実験の代表的な 2 つを繰り返しまたは倍 n = 各条件のための 60 のワーム。カプラン-マイヤー ログ ランク分析は、生存曲線を比較し、生存期間の中央値を計算に使用されました。P 値 0.05 < 有意と考えられていた。この数字を変更してアクセス許可15に適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: SKN 1 は、虫の生存に必要なS. gordonii.(A) 生存の扱われるベクトル制御やs. gordoniiにさらされるskn 1ノックダウン ワーム。(B) N2 生存とskn 1(zu67) 変異体ワームは、 S. gordoniiの供給。データが実験の代表的な 2 つを繰り返しまたは倍 n = 各条件のための 60 のワーム。カプラン-マイヤー ログ ランク分析は、生存曲線を比較し、生存期間の中央値を計算に使用されました。P 値 0.05 < 有意と考えられていた。この数字を変更してアクセス許可15に適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: SKN 1 のレンサ球菌 H2O2を介した活性化、p38 MAPK 経路によって異なります。(A) WT、ΔspxB変異体およびs. gordoniiの ΔspxB; spxB +補完する系統にさらされるワームで SKN-1 b/C::GFP の局在化の代表的なイメージ。クローズ アップは、各画像の右上コーナーに表示されます。スケールバー = 100 μ m. SKN-1 b/C::GFP の核局在化とワームの割合の程度 (B) WT、ΔspxB変異体およびs. gordoniiの ΔspxB; spxB +補完する系統に供給される各カテゴリで。大幅 SKN-1 b/C::GFP の核局在化の低レベルは、WT と ΔspxB; spxB +補完株s. gordoniiの比較 ΔspxB変異体 (p < 0.0001) で観察されました。(C) ベクトル制御、 skn 1ノックダウンpmk 1スウェーデン クローナ 1 nsy 1SKN-1 b/C::GFP の局在化の代表的な画像には、 s. gordoniiのワームが扱われます。クローズ アップは、各画像の右上コーナーに表示されます。スケールバー = 100 μ m. (D) SKN-1 b/C::GFP 核局在化の程度と各カテゴリのワームの割合nsy-1、最安値 sek 1 pmk 1 skn 1ノックダウンと扱われるベクトル制御の供給S. gordoniiのワーム。大幅 SKN-1 b/C::GFP の核局在化の低レベルはnsy-1 (p < 0.01)、最安値 sek 1 (p < 0.001)、 pmk 1 (p < 0.0001)、skn 1ノックダウン (p < 0.0001) のベクトルと比較してみコントロールには、 S. gordoniiのワームが扱われます。以上を設定する各緊張にさらされる 100 のワームをイメージしましたと実験を 3 回繰り返した。この数字を変更してアクセス許可15に適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
腸球菌 faecium、また嫌気性下で栽培した H2O2を作り出すなど他の病原細菌の説明する方法を使用できるまたは微好気条件26。通常、最も病原性生物の週間生存の試金を完了するにいくつかの日が必要。ただし、H2O2可鍛鋳鉄グループのメンバーによって堅牢な生産のためこれらの試金は記載されている条件の下で 5-6 時間以内完了でした。これにより短時間で宿主免疫に関与するいくつかの遺伝子候補と酸化ストレス応答を選別する能力です。
このプロトコルでは、細菌によって生成される H2O2はいくつかの障壁を越える必要がありますその他の外因性 ROS のソースではなく、ワームの腸の細胞と直接接触です。これにより、腸内細胞に H2O2が配信されることそれ故より堅牢な殺害の応答は、ワームで観察されます。蛍光に分類された細菌を使用すると、ワームが病原体を腸管15の完全な植民地化のため 30 分に公開しなければならないことが確認されました。それは、生存率と H2O2を生成する能力を確保するレンサ球菌の菌株の 1 週齢のストリーク プレート未満を使用する勧めします。さらに、レンサ球菌の菌株は H2O の最適生産の微好気条件下で成長する必要があります2.L4 の幼虫や 1 日昔の大人は、このアッセイに使用できます。実験で使用されるすべてのワームが同じ年齢、性別のことが重要です。若いワームは、以前に比べてよりゆっくりと両性具有を死ぬ傾向があります。L4 動物は、体の残りの部分とは対照的明確なパッチとして、発展途上の外陰部が中間体に表示されるのでより簡単に区別されます。連鎖球菌シード プレートにエシェリヒア属大腸菌OP50 が転送されていないことが重要です。減衰あるいはワームの殺害の廃止プレート大腸菌を殺すの汚染を引き起こします。汚染を避けるためには、大腸菌の芝生からワームをピックアップする必要は。生存の試金を得点計算のときは、咽頭ポンプ、頭と身体の動きの動作を採餌を観察することをお勧めします。ワームは死んでいるようにはを優しく鼻、体や尾の側面を突くし、任意の動きを観察することをお勧めします。
RNAi の餌と可鍛鋳鉄グループでワームの存続は、H2O2防御に関与している候補者を識別するために結合されました。H2O2への応答でワームの生存は、酸化ストレス応答転写因子、その要件をエンコードする遺伝子skn 1を使用して紹介.したがって、この試金はいくつかの遺伝子のスクリーニングに適応するし、酸化ストレス応答と免疫に必要な潜在的な候補を特定できます。RNAi は、ワームの餌時代同期大腸菌芝生を表現する RNAi に L1 幼虫を追加することによって実現されます。ワームの同期プロトコルの中には、漂白剤や水酸化ナトリウムの存在下でワーム キューティクルの換散を監視する不可欠です。成虫と幼虫のクチクラは解消する継続的に胚が部分的に厚い卵殻で保護されています。ただし、blead 水酸化ナトリウム ミックスの存在下で長期間の加温は、胚は死ぬことを引き起こす可能性があります。したがって、定期的に漂白中解剖顕微鏡の下でワームを含む管を観察することが重要です。同期プロトコルを考慮する別のステップは、逮捕された L1 幼虫のメンテナンスです。逮捕された幼虫は、常温で 5 日間チューブ回転に維持できます。孵化後 1 〜 2 日以内に RNAi が給餌に幼虫を使用することをお勧めします。M9W で長期間メンテナンスは、期間直段階の形成で起因できます。
最後に、SKN 1 GFP の融合を表現するトランスジェニック ワームは、可鍛鋳鉄グループの存在下で酸化ストレス応答のアクティブ化を監視していました。P38 MAPK の成分が腸内の細胞の核に SKN-1 b/C::GFP の局在に必要な RNAi により示す.SKN 1 のローカライズは、大人の段階で減少する傾向がある、SKN-1 b/C::GFP の局在を観察するこの緊張の L3 または L4 段階を使用することが重要です。SKN-1 b/C::GFP の局在観察するには、は、FITC と DAPI のフィルター設定を使用して得られた画像をオーバー ラップすることをお勧めします。蛍光によって生成される、lipofuscins は、ワームの SKN 1 局在の観察にコントラストを提供するため。しかし、弱く表現 GFP レポーターからの信号はワームの腸内でのさまざまな情報源から放出される蛍光によってマスクされているはまた示します。蛍光は年齢とともに増加する示されている、腸と線虫27の子宮で最高です。この問題を克服するためには、最近の研究はc. の elegans28SKN-1 b/C::GFP の局在を監視するトリプル バンド GFP フィルター セットアップを利用しました。このセットアップは、autofluoresence、緑と黄色のチャンネルの GFP と autofluoresence をそれぞれ表示するから GFP 信号を分離します。
線虫は、宿主-病原体相互作用の研究し、どのように H2O2可鍛鋳鉄グループによって生成される原因病原性を確認するこのプロトコルで使用されます。もっと重要なは、このモデルを使用して、小網様体ストレス、ミトコンドリア障害、mitophagy、オートファジーと酸化ストレスに及ぼす H2O2を学ぶことができます。さらに、メカニズム、H2O2セルのコア プロセスを混乱させることによって免疫反応を引き出すために病原性因子として機能を識別できます。それ故に、このワームは、ホスト病原体の相互作用に新たな洞察を発見するための強力なモデル システムとして認識されます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
我々 は博士 Bing ヤン王、博士ジーナ ・ トリブル (テキサス大学、歯学部) に感謝博士リチャード ・ ラモント (ルイビル大学、歯学部), と博士サミュエル ・ シェルバーン (MD アンダーソンがんセンター) 研究室と臨床株の提供するため可鍛鋳鉄群連鎖球菌。我々 はまたc. の elegansの緊張のため博士キース ・ ブラックウェル (遺伝部、ハーバード大学医学部) を感謝します。最後に、試薬、研究を行なうワーム株を提供するため博士ダニエル ガーシン、彼女の研究室 (テキサス大学、マクガヴァン医学) をありがちましょう。いくつかのワームの系統は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
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