Summary
선 충 류 꼬마 선 충 호스트 병원 체 상호 작용을 해 부에 우수한 모델입니다. 여기에 설명 된 멤버 mitis 그룹 streptococci와 웜 감염 유 기체의이 그룹에 의해 생산 H2O2 에 대 한 산화 스트레스 반응의 활성화를 결정 하는 프로토콜이입니다.
Abstract
꼬마 선 충 (C. 선 충), 살아있는 선 충 류, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하는 매력적인 모델로 떠오르고 있다. 제시 프로토콜이이 모델을 사용 하 여 H2O2의 생산을 통해 mitis 그룹 streptococci 기인한 pathogenicity 결정. Mitis 그룹 streptococci bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 봉와 직 염 등 많은 인간의 질병을 일으키는 원인이 되는 신흥 위협입니다. 여기에 설명 된 H2O2 에 대 한 응답에이 벌레의 생존을 결정 하는 프로토콜에 의해 생산 병원 체의이 그룹. 산화 긴장 응답 녹음 방송 요인에 대 한 유전자 skn-1 인코딩을 사용 하 여,이 모델은 연쇄 구 균 감염에 대 한 필수적인 호스트 유전자를 식별 하는 데 중요 한 표시 됩니다. 또한, 유전자 변형 기자 웜 변형, SKN-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 융합은 사용 하 여이 병원 균의 존재 산화 스트레스 반응의 활성화를 모니터링할 수 있습니다 표시 됩니다. 이 분석 실험 것 반대로 생물 소스에 의해 파생 된 H2O2 로 산화 스트레스 반응을 기회 반응성 산소 종 (선생님) 소스를 추가 제공 합니다.
Introduction
Mitis 그룹 streptococci oropharyngeal 구멍1의 인간의 공생입니다. 그러나, 이러한 생물이이 틈새를 탈출 하 고 침략 적인 질병2의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 이러한 미생물에의 한 감염 등 bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 cellulitis2,,34,,56. 또한, 그들은 혈 류 감염의 원인으로 대리인은 신흥 시내 immunocompromised, neutropenic, 그리고 화학 요법5,,78,9 받은 암 환자 .
몇 가지 독성 요인 확인 되었습니다 있기 때문에 기본 mitis 그룹 병 인은 애매 한 메커니즘. Mitis 그룹은 H2O2, 구강 미생물 커뮤니티10에서 중요 한 역할을 보여줘 생산으로 알려져 있다. 최근 여러 연구 cytotoxin 상피 세포 죽음11,12-유도로 H2O2 에 대 한 역할을 강조 했습니다. S. 폐 렴, 이 그룹에 속하는 DNA 손상 및13치경 세포 있는 apoptosis를 유도 하는 H2O2 의 높은 수준의 생산을 보였다. 급성 폐 렴 동물 모델을 사용 하 여, 동일한 연구원은 박테리아에 의해 H2O2 의 생산 독성 우위를 수 여 한다 설명 했다. 폐 렴 균 성 수 막 염에 대 한 연구 또한 그 병원 체 파생 된 H2O2 를 신경 세포 죽음14트리거 pneumolysin와 synergistically 역할 표시. 이 관측은 명확 하 게 박테리아의이 그룹에 의해 생산을 H2O2 는 그들의 pathogenicity에 대 한 중요 한 설정 합니다.
흥미롭게도, 그것은 또한 보였다는 mitis의 회원 그룹 S. mitis 및 H2O215,16의 생산을 통해 선 충 C. 선 충 의 죽음의 원인이 S. oralis . 이 살아있는 선 충 류는 많은 생물 학적 과정을 공부 하 간단 하 고, 유전으로 온순한 모형으로 사용 되었습니다. 더 최근에, 웜은 호스트 병원 체 상호 작용17,18연구 모델로 떠오르고 있다. 또한, 여러 연구 공부 하는이 유기 체19,20,21을 사용 하 여 산화 스트레스의 중요성을 강조 했습니다. 그것의 짧은 라이프 사이클, RNAi에 의해 관심의 최저의 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용-융합된 기자 유전자 발현을 모니터링 하는 특성을 그것에 게 매력적인 모델 시스템의 일부. 더 중요 한 것은, 산화 스트레스와 벌레에 타고 난 면역 조절 경로 높은 포유류20,22보존 됩니다.
이 프로토콜에서 그것는 연쇄 구 균 파생 된 H2O2로 인 한 pathogenicity 명료 하 C. 선 충 을 사용 하는 방법은 보여 줍니다. 수정 된 생존 분석 결과 표시 하 고 mitis 그룹의 구성원을 급속 하 게 벌레를 죽 일 수 있습니다 통해 H2O2의 생산. 반응 산소 종의 지속적인된 생물 소스 mitis 그룹의 구성원을 사용 하 여 (선생님) 제공, 벌레에 산화 스트레스를 유발 하는 화학 원본에 반대 합니다. 또한, 박테리아는 H2O2 (여러 방 벽을 교차 하 고 있는 다른 소스에 비해) 창 자 세포에 직접 타겟이 될 수 있는 벌레를 빠르게, 식민지 수 있습니다. 분석 결과 중 1)으로 skn-1 돌연변이 스트레인의 또는 2) skn-1 웜 N2 야생-타입 기준 및 벡터 제어 처리 벌레에 RNAi를 사용 하 여 아래로 노크 하 여 생존을 결정 하는 유효성이 검사 됩니다. SKN-1 C. 선 충23,,2425의 산화 스트레스 반응을 조절 하는 중요 한 전사 요소입니다. 생존 분석, 뿐만 아니라 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 기자 표현 웜 변형 mitis 그룹은 산화 긴장 응답을 통해 H2O2 의 생산의 활성화를 모니터링 하는 데 사용 됩니다.
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Protocol
1. 네 (토 드-휴이 트 효 모 추출 물) 한 천 배지 준비
- 미디어의 1 L, 토 드-휴이 트 분말, 효 모 추출 물 및 2 L 삼각 플라스 크를 한 20 g 2 세대의 30 g 추가. 이온된 수의 970 mL 플라스 크의 내용에 추가 하 고 볶음 바 포함. 압력솥에서 121 ° C의 온도 압력 30 분 동안 15 파운드/인치2 의 미디어. 그 후, 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 부드러운 감동으로 냉각 허용.
- 층 류 흐름에서 적절 한 크기의 멸 균 페 트리 디쉬 (성장 및 유지 보수의 박테리아를 죽이 분석 실험을 위한 35 m m x 10 m m 요리 요리 100 m m x 15 m m)에 미디어를 붓으십시오. 미디어 층 류 후드 2 h 동안 건조를 허용 합니다. 그 후, 1 개월 4 ° C에서 격판덮개를 저장할 수 있습니다.
2. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 및 RNAi 먹이 접시 (NGM RNAi)의 준비
- 저 막대를 사용 하 여 2.5 g 펩의 및 이온된 수 2 L 삼각 플라스 크에 970 mL에 NaCl의 3 세대 분해. 언론에의 한 천 20g을 추가 합니다. 압력솥에서 121 ° C의 온도 압력의 30 분의 15 파운드/인치2 미디어 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 부드러운 감동으로 냉각 허용.
- NGM 접시의 준비에 대 한 미디어 다음 솔루션 추가: 1 M 칼륨 인산 염 버퍼의 25 mL (pH = 6.0), 1 M MgSO4, 1m CaCl2, (95% 에탄올에 5 mg/mL) 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1 mL (에탄올에 10 %v / w) nystatin의 1 mL 및 25 mg/mL 스의 1 mL.
- NGM RNAi 먹이 접시의 준비에 대 한 미디어 다음 솔루션 추가: 1 M 칼륨 인산 염 버퍼의 25 mL (pH = 6.0), 1 M MgSO4, 1m CaCl2, (95% 에탄올에 5 mg/mL) 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1 mL (에탄올에 10 %v / w) nystatin의 1 mL, 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL 및 IM IPTG의 1 mL.
- 층 류에서 멸 균 페 트리 디쉬 60 m m x 15 m m으로 언론을 따르십시오. 미디어 층 류 후드 2 h 동안 건조를 허용 합니다. 그 후, 1 개월 4 ° C에서 접시를 저장할 수 있습니다.
3입니다. C. 선 충 의 유지 보수
- 시드 하룻밤의 스포팅 50 µ L에 의해 NGM 접시는 접시의 중앙에 대장균 OP50 성장. 대장균 문화는 이전 Luria Bertani (파운드) 미디어에서 준비 하 고 몇 달 동안 4 ° C에서 저장. 번호판을 커버 하 고 층 류 후드 24 h 동안 건조 하 고 그 후 폴리스 티 렌 용기에 접시를 저장 하도록 허용.
- 해 현미경 10 12 벗 성인 살 균 웜 선택을 사용 하 여 선택 하 고 벌레는 대장균 에 전송 OP50 시드 NGM 접시. 하룻밤 20 ° C에서 번호판을 품 어.
- 다음 날, 살 균 웜 선택을 사용 하 여 성인을 제거 하 고 20 ° c (~2.5 일) L4 애벌레를 개발 하기 위해 배아를 허용.
4. 벌레의 동기 인구 나이의 준비
-
2 M9W를 사용 하 여 4 개의 NGM 접시 벗 성인을 세척 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 수집.
- M9W 준비: NaCl의 3 세대, 나2HPO4, 6 g 및 3g KH2포4 의 결합 하 고 마지막 양의 이온을 제거 된 물 1 L에 용 해. 고압 솔루션 1 M MgSO4의 1 mL을 추가.
- 1 분, g 450 x 튜브를 회전 한 다음 웜 펠 릿 그대로 유지 하면서는 상쾌한 가만히 따르다.
- 8.25% 염소 (가정용 표 백제)의 400 µ L 및 웜 세포 솔루션 준비 5 N NaOH의 100 µ L를 추가 합니다. 웜 펠 릿을 세포 솔루션을 추가 하 고 어른 벌레의 70%는 lysed 때까지 튜브를 터치 하 여 내용을 혼합. 정기적으로 계란의 아무 overbleaching는 되도록 해 현미경 튜브의 내용을 준수 합니다.
- M9W의 10 mL 원뿔 튜브의 내용에 추가 하 여 표 백제 혼합 희석.
- 450 x g 1 분 Decant 상쾌한에 튜브를 회전 다음 M9W의 10 mL를 추가 합니다.
- 4.5 단계를 두 번 더 반복 합니다.
- M9W의 3-5 mL에 결과 계란 펠 릿을 resuspend. 튜브 회전에 튜브를 놓습니다. 하룻밤 실 온 (RT)에서 18 rpm의 속도로 회전 하는 튜브를 허용 합니다.
- 다음 날, 작은 L1 유 충을 1 분 동안 g 450 x 튜브를 회전 합니다. 포부, 관에 있는 액체의 ~ 250 µ L을 남겨두고 여 M9W의 대부분을 제거 합니다. L1 애벌레를 resuspend 하 고 3 5 µ L Petri 접시 뚜껑, 다음 견적 해 현미경을 사용 하 여 µ L 당 벌레의 수에 벌레의 서 스 펜 션의 상품.
5입니다. 벌레에 RNAi의 유도
- 살 균을 사용 하 여 루프 또는, 100 m m x 15 m m 파운드 한 천 배지 50 µ g/mL carbenicillin 및 항생물질의 15 µ g/mL에 냉동된 주식 (Ahringer 및 비 달 라이브러리)에서 RNAi 포함 된 대장균 의 원하는 변종 밖으로 행진. 24 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 선택 하 고 원하는 RNAi 스트레인에서 고립 된 식민지 파운드 50 µ g/mL carbenicillin 보충의 2 개 mL를 포함 하는 살 균 15 mL 원뿔 관에 접종. 150 rpm에서 궤도 통에 16 h 37 ° C에서 튜브를 품 어.
- 다음 날, 150 µ L 65 m m x 15 m m NGM RNAi 먹이 접시 살 균 분산기를 사용 하 여에 하룻밤 성장 문화 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 37 ° c.에 외피 후 rt 냉각 접시를 허용 ~ 200 L1 유 충 (벌레 단계의 동기 나이 인구에서 얻은) 대장균 에 포함 된 M9W의 적절 한 볼륨 시드 NGM RNAi 먹이 접시 추가 합니다. 애벌레 (~2.5 일) L4 단계에 도달할 때까지 20 ° C에서 접시를 품 어.
6. 감염 Mitis 그룹 Streptococci의 준비
- 네 agar는 100 m m x 15 m m에 원하는 변종의 streptococci 밖으로 행진 (번호판 4 ° C에서 저장, 미리 따뜻한 37 ° C에 접시 각각 긴장을 질주 하기 전에), 다음 제공 하는 microaerophilic en 촛불 항아리에 37 ° C에서 하룻밤 (h ~ 18) 번호판을 품 어 (질주 된 접시는 4 ° C에서 1 주일 동안 저장할 수 있습니다) streptococci의 성장에 대 한 vironment.
- 임상 분리 streptococci의 전파, tryptic 간장 혈액 한 천 사용 합니다. 37 ° C 하룻밤 촛불 항아리에 (h ~ 18)에서 번호판을 품 어.
- 다음 날, 촛불 항아리에서 플레이트를 제거 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 고립 된 식민지를 선택 합니다. 네 국물의 2 개 mL를 포함 하는 15 mL 살 균 원뿔 관 예방 Streptococci의 임상 격리 된 것을 전파 하는 THY 보충 5 %v / v 양 혈액의 국물. 뚜껑 꽉 닫고 정적 조건에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
7. 생존 분석
참고: 이 분석 결과에 포함 된 단계는 그림 1에 묘사 된다. H2O2 는 mitis에 의해 파생 된 입증 그룹은 벌레의 살인에 대 한 책임, 카 탈 라 제, 또는 돌연변이 스트레인 ΔspxB 미디어를 보충 하 고 보완 변형 ΔspxB; spxB + 미 gordonii 의 수 있습니다. 사용할 수 있습니다. SpxB는 mitis 그룹에서 H2O2 의 생산에 대 한 책임은 pyruvate 산화 효소에 대 한 인코딩합니다.
- 미리 따뜻하게 35 m m x 10 m m 37 ° c 그 대 접시 Streptococci의 원하는 긴장의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L을 추가 하 고 완전히 살 균 분산기를 사용 하 여 한 천 표면에 걸쳐 박테리아를 확산. 37 ° C 하룻밤 촛불 항아리에 (h ~ 18)에서 번호판을 품 어. 컨트롤, 씨 두 35 m m x 10 m m NGM 접시 대장균 OP50의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L로. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
- H2O2 는 mitis 그룹에 의해 생산 벌레의 살인에 대 한 책임은 확인, 추가 THY에 catalase c 1000 단위를 포함 하는 50 µ L 플레이트. 살 균 분산기를 사용 하 여 카 탈 라 제 솔루션을 확산 하 고 접시 30 분 씨 7.1 단계에서 설명한 대로 각각 연쇄 상 구 균 긴장으로 그 후 접시에 대 한 층 류에 건조를 허용.
- 다음 날, 촛불 항아리에서 플레이트를 제거 하 고 메 마른 벌레를 사용 하 여 10-15 분에 대 한 rt 냉각 플레이트 선택, 전송 30 L4 애벌레 NGM 또는 NGM RNAi는 연쇄 상 구 균을 먹이 접시에서 시드 네 접시 허용. 사용 2 시드 연쇄 상 구 균의 변형 당 60 웜 총 네 접시. 25 ° c.에 번호판을 품 어
- 해 현미경을 사용 하 여, 여러 timepoints 각 접시에 라이브 하 고 죽은 L4 애벌레의 수를 계산 합니다. 처음에, 죽은 벌레를 점수 또는 매 30 분을 산다. 그 후, 웜 급속 하 게 죽을 시작, 점수 그들 15 분 간격. 살 균 웜 선택을 사용 하 여 부드럽게 벌레를 자극 하 고 그들은 죽 었 거 나 살아 확인. 경우에 괴롭히는에 대 한 응답 운동 벌레 죽은 간주 됩니다.
- 분석 결과 완료 5-6 시간 소요 됩니다. 실험 두 번 더 반복 합니다. 분석 결과의 완성 후 두 접시에서 데이터 풀. 각 그룹의 데이터를 입력, 생존 곡선을 비교 하 고 카 플 란-마이어 생존 분석 통계 소프트웨어를 사용 하 여 수행.
8입니다. 현미경 Agarose 패드의 준비
- 전자 레인지에 솔루션을가 열 하 여 이온된 수에 agarose의 2 %w / v를 분해. 솔루션의 5 mL의 볼륨은 20 슬라이드를 준비 하는 충분 한.
- 두 개의 유리 슬라이드를 따라 세로로 랩 테이프 스틱. 이 agarose 패드의 두께 결정 합니다. 두 개의 녹화 슬라이드 사이의 깨끗 한 유리 슬라이드를 놓습니다.
- 깨끗 한 슬라이드의 중앙에 녹은 agarose의 장소 100 µ L. 즉시 다른 깨끗 한 유리는 녹은 agarose 위에 놓고 부드럽게 눌러 패드를 확인을 합니다. Agarose 고형화 하 고 이후 최고의 슬라이드를 제거를 허용 합니다. Agarose 패드 사용 하기 위해 준비가 되어있습니다.
9. SKN 1 지역화 연쇄 상 구 균 감염에 대 한 응답에서의 관찰
참고: 이 분석 결과에 포함 된 단계는 그림 2에 묘사 된다. SKN-1의 지역화 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 웜 변형 사용 하 여 결정 했다. 지역화 SKN-1의 H2O2 는 mitis 그룹, 야생-타입의 생산으로 인해 (WT), ΔspxB, 및는 보완 스트레인 ΔspxB; spxB + 미 gordonii 의 사용 되었다. 또한, 유전자 변형 기자 스트레인 SKN-1B/C::GFP와 RNAi 간섭 기법 p38 MAPK 통로의 구성 요소 1 SKN의 지역화 규제를 설명 하기 위해 사용 되었다.
- 미리 따뜻하게 35 m m x 10 m m 37 ° c 그 대 접시 연쇄 상 구 균의 원하는 긴장의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L을 추가 하 고 완전히 살 균 분산기를 사용 하 여 한 천 표면에 걸쳐 박테리아를 확산. 37 ° C 하룻밤 촛불 항아리에 (h ~ 18)에서 번호판을 품 어. 컨트롤, 씨앗 3 35 m m x 10 m m NGM 접시 대장균 OP50의 하룻밤 성장 문화의 80 µ L로. 이 접시 ~ 18 h 37 ° C에서 품 어.
- 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거 하 고 10-15 분 세척 L4 애벌레 NGM에서 M9W를 사용 하 여에 대 한 rt 냉각 플레이트 및 NGM RNAi 먹이 접시. 15 mL 원뿔 튜브에 벌레를 수집 합니다.
- 450 x g 1 분 Decant는 상쾌한에 튜브를 회전을 M9W의 10 mL를 추가 합니다.
- 9.3 단계 세 번 더 반복 합니다.
- 깨끗 한 Petri 접시 뚜껑에 벌레의 서 스 펜 션의 M9W 및 장소 3 5 µ L 상품 ~ 250 µ L에서 벌레를 resuspend 고 해 현미경을 사용 하 여 µ L 당 벌레의 수를 예상.
- 각 네 구 시드 및 시드 NGM 대장균 접시에 100 ~ L4 애벌레를 추가 합니다. 박테리아의 스트레인 당 세 접시를 사용 합니다. 2 ~ 3 h 25 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
- 그 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 M9W로 그들을 씻어 15 mL 원뿔 튜브에 벌레를 수집.
- 벌레 3 워시 x에 설명 된 대로 단계 9.3.
- 포부로는 M9W의 대부분을 제거 하 고 웜 펠 릿에 M9W 포함 2 m m 나트륨 아 지 드 또는 2 mM tetramisole 염 산 염의 500 µ L를 추가 합니다. 이 벌레를 현미경 군데 발생 하는 운동 보장 anesthetize 것입니다.
주의: 나트륨 아 지 드를 처리할 때 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 화학 후드 아 지 드 솔루션을 준비 합니다. - 15 분 동안 RT에서 웜 펠 릿을 품 어. 그런 다음 준비한 agarose 패드에 벌레의 서 스 펜 션의 15 µ L 자리. 부드럽게 마 취 벌레를 포함 하는 agarose 패드 번호 1.5 coverslip 장소.
- 형광 현미경을 사용 하 여, SKN-1 이용 FITC와 DAPI 필터의 지역화 시각화. 이미지는 10 x 20 x 배율에서 벌레.
- SKN-1의 지역화의 수준에 따라 벌레를 점수. 아니 핵 지역화, SKN-1B/C::GFP 앞쪽 또는 웜, 후부의 지역화 및 SKN-1B/C::GFP 모든 창 자 세포에서의 핵 지역화 낮음, 보통 및 높은 수준의 지역화로 각각 분류 됩니다.
- 형광 현미경, 득점 후 chi-제곱 및 피셔의 정확한 시험 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계적 차이 확인 합니다.
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Representative Results
mitis의 회원 그룹 S. mitis, S. oralis, S. gordonii 빠르게 사망 S. mutans, S. salivarius, 및 비 병원 성 대장균 에 반대 벌레, OP50 (그림 3A). S. mitis, S. oralis, S. gordonii 메디아 생존이 이었다 300 분, 300 분, 345 분, 각각. 살인 H2O2에 의해 중재 된 경우를 확인 하려면 catalase 네 agar에 보충 되었다. 벌레의 살인 catalase (그림 3B)의 폐지 되었다. 추가 연쇄 구 균 파생된 H2O2 중재 살인 벌레, ΔspxB 돌연변이 스트레인, WT 스트레인 및 보완 변형 ΔspxB; spxB + 미 gordonii 의 생존 여부를 확인 하려면 분석 했다. 벌레의 죽음은 야생-타입에 비해 ΔspxB 돌연변이 스트레인에 관찰 되지 않는 변종 (그림 3C)를 보완 하 고. 이러한 데이터 mitis 그룹을 제작한 H2O2 살인 벌레의 중재는 것이 좋습니다. 또한 벌레 (그림 3D) 암 환자의 혈액에서 얻은 mitis 그룹 streptococci의 임상 격리에 드러낸 때 비슷한 살인 활동을 관찰 합니다. 데이터를 바탕으로, H2O2 는 mitis 그룹 streptococci 제작한 기인한 pathogenicity 평가 했다.
연쇄 구 균 감염에 대 한 필수적인 호스트 유전자를 식별 하려면 skn-1 절 했다,는 산화 스트레스 응답 녹음 방송 요인에 대 한 인코딩 C. 선 충. 다음, 생존 벡터 제어 처리 벌레를 기준으로 비교 되었다. Skn 1 최저의 벌레의 생존에 중요 한 감소는 벡터 제어 처리 웜(그림 4)에 비해 관찰 되었다. 이 데이터는 추가 skn-1 돌연변이 스트레인를 사용 하 여 확인 하 고 생존 N2 야생-타입 벌레의 비교 되었다. 우리가 관찰 skn-1 돌연변이로 비슷한 살인 형 skn 1 최저 볼 수 있듯이 SKN 1 mitis 그룹 (그림 4B)에 벌레의 생존 영향을 보여주는.
다음, 그것은 H2O2 벌레에 SKN-1B/C::GFP의 지역화를 발생 mitis 그룹에 의해 생산 여부 결정. SKN-1B/C::GFP의 지역화는 야생 형 및 보완 얼룩 하지 응답 gordonii S. (그림 5A, B)의 ΔspxB 돌연변이 스트레인에 노출 하는 벌레에 관찰 되었다. 또한, SKN-1의 정품 인증을 확인 하려면 p38 MAPK 통로의 구성 했다 뜨. 벡터 제어 처리 벌레 상대적인 nsy-1, sek 1, pmk-1, 그리고 skn 1 최저의 웜 SKN-1B/C::GFP의 감소 지역화 관찰 되었다. 데이터 p38 MAPK는 mitis 그룹 (그림 5C, D)을 제작한 H2O2 에 대 한 응답 SKN-1의 정품 인증에 필요한 제안 합니다.
그림 1 : 생존 분석 실험의 준비에서 단계를 묘사 하는 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 감염 시 SKN-1의 지역화에 관련 된 단계를 묘사 하는 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : H2O2-중재 C. 선 충 의 살인 mitis 그룹 streptococci. 카 플 란-마이어 (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans 및 대장균 OP50에 노출 하는 L4 애벌레의 생존 곡선. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, 그리고 1000 U catalase의 면 전에 서 네 접시에 대장균 OP50. (C) 미 gordonii WT, ΔspxB 돌연변이, 그리고 ΔspxB; spxB + N2 L4 애벌레에 긴장을 보완. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13), 그리고 E. 콜라이 OP50. 데이터는 실험의 두 반복 또는 더 많은 시간, n = 각 조건에 대해 60 벌레. 카 플 란-마이어 로그 순위 분석 생존 곡선을 비교 하 여 평균 생존 계산 사용 되었다. P 값 0.05 < 통계적으로 중요 한 것으로 간주 되었다. 이 그림 수정 되어 있으며 허가15적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : SKN-1는에 벌레의 생존에 필요한 S. gordonii입니다. (A) 생존 치료 벡터 제어 skn 1 최저의 웜 S. gordonii에 노출 (B) 생존의 n 2와 skn-1(zu67) 돌연변이 웜 S. gordonii먹이. 데이터는 실험의 두 반복 또는 더 많은 시간, n = 각 조건에 대해 60 벌레. 카 플 란-마이어 로그 순위 분석 생존 곡선을 비교 하 여 평균 생존 계산 사용 되었다. P 값 0.05 < 통계적으로 중요 한 것으로 간주 되었다. 이 그림 수정 되어 있으며 허가15적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 연쇄 구 균 H2O2 중재 활성화 SKN-1의 p38 MAPK 경로에 따라 달라 집니다. (A) 웜 WT, ΔspxB 돌연변이, Δ S. gordonii의spxB; spxB + 보완 긴장에 노출에 SKN-1B/C::GFP의 지역화의 대표 이미지. 클로즈업은 각 이미지의 상단 오른쪽 모서리에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) SKN-1B/C::GFP의 핵 지 방화의 벌레의 비율 정도 먹이 WT, ΔspxB 돌연변이, 그리고 ΔspxB; spxB + 보완 긴장 미 gordonii의 각 카테고리에. 상당히 저급 SKN-1B/C::GFP의 핵 지 방화의 S. gordonii의 WT 및 ΔspxB; spxB + 보완 변종에 비해 ΔspxB 돌연변이 (p < 0.0001)에서 관찰 되었다. (C) 대표 이미지 nsy-1, sek 1, pmk-1, skn 1 최저, 및 벡터 제어 SKN-1B/C::GFP의 지역화의 S. gordonii에 벌레 취급. 클로즈업은 각 이미지의 상단 오른쪽 모서리에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (D) SKN-1B/C::GFP 핵 지 방화의 정도와 비율 각 카테고리에 벌레의 먹이 nsy-1, sek 1, pmk-1, skn 1 최저, 그리고 벡터 제어 처리 S. gordonii에 벌레 크게 SKN-1B/C::GFP의 핵 지 방화의 저급 nsy-1 (p < 0.01), sek-1 (p < 0.001), pmk-1 (p < 0.0001),skn 1 최저 (p < 0.0001) 벡터에 비해 관찰 되었다 제어 미 gordonii에 벌레 취급. 100 벌레 각 스트레인에 노출 된 몇 군데 보다 실험 3 번 반복 되었다 더이 큰 이 그림 수정 되어 있으며 허가15적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Enterococcus faecium, H2O2 에서 혐 기성 성장 생산 등 다른 병원 성 세균에 대 한 설명 하는 메서드를 사용할 수 있습니다 microaerophilic26조건 또는. 일반적으로, 대부분 병원 성 유기 체를 위한 그것은 걸립니다 몇 일 주 생존 분석 실험. 그러나, mitis 그룹의 구성원에 의해 H2O2 의 강력한 생산으로 인해 이러한 분석 5-6 h 설명 된 조건 내에서 완료 될 수 있습니다. 이렇게 하면 짧은 시간 동안 호스트 면역에 관련 된 여러 유전자 후보 및 산화 긴장 응답을 화면에 기능.
이 프로토콜에서는 H2O2 는 박테리아에 의해 생산 몇 가지 장벽을 교차 해야 하는 다른 외 인 선생님 소스 반대로 벌레의 장 세포와 직접 접촉에 있다. 이렇게 하면 H2O2 ; 창 자 세포에 전달 되 따라서, 보다 강력한 살인 응답 벌레에서 관찰 됩니다. 붙일 레이블된 박테리아를 사용 하 여, 벌레 창 자15의 완전 한 식민지에 대 일 분 병원 균에 노출 될 해야 합니다 결정 되었다. 연쇄 구 균 긴장의 1 주 오래 된 조 흔 격판덮개 보다는 더 적은 그들의 생존 및 H2O2를 생산 하는 능력을 보장 하기 위해 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 연쇄 구 균 긴장 H2O의 최적 생산을 위한 microaerophilic 조건 하에서 성장 해야 합니다2. 이 분석 결과 대 한 L4 애벌레 또는 1 일 오래 된 성인을 사용할 수 있습니다. 실험에 사용 되는 모든 웜 같은 연령과 성별은 중요 하다. 어린 벌레 더 느리게 이전에 비해 광고에 나온 것을 죽는 경향이 있다. 분명 패치는 시체의 나머지와 대조를로 그들의 개발 외 음부 중간 바디에서 표시 되므로 L4 동물 들은 더 쉽게 고유. 그것은 또한 아무 대장균 OP50 구 시드 플레이트에 게 전송 됩니다 중요 하다입니다. 감쇠 또는 벌레의 살인의 폐지 접시 대장균 을 죽이 오염 될 수 있습니다. 오염을 방지 하려면 대장균 잔디밭에서 벌레를 선택할 필요가 있다. 생존 분석 실험, 득점 때 펌핑, 머리, 및 몸 움직임의 동작을 구하고 pharyngeal 관찰 하는 것이 좋습니다. 벌레는 죽은 되도록 부드럽게 자극 코, 신체, 또는 꼬리의 움직임을 관찰 하는 것이 좋습니다.
RNAi 유와 mitis 그룹에 벌레의 생존은 H2O2에 대 한 방어에 관련 된 후보를 식별 하기 위해 결합 되었다. H2O2 에 대 한 응답에 벌레의 생존은 산화 스트레스 응답 녹음 방송 요인, 자사의 요구 사항에 대 한 인코딩 유전자 skn-1 을 사용 하 여. 여기 시연 따라서,이 분석 결과 여러 유전자에 대 한 화면을 하 고 산화 스트레스 반응과 면역에 필요한 잠재적인 후보자 식별 수 있습니다. RNAi는 벌레의 먹이 나이 동기화 L1 애벌레 대장균 잔디 표현 RNAi 추가 하 여 이루어집니다. 웜 동기화 프로토콜 중 웜 손톱 표 백제와 수산화 나트륨의 존재의 세포를 모니터링 하는 데 필수적 이다. 성인과 애벌레의 표 피 지속적으로 배아는 부분적으로 두꺼운 달걀 껍질에 의해 보호 하는 동안, 디졸브 것입니다. 그러나, 장기간된 보육으로 수산화 나트륨 혼합 존재 죽을 배아를 발생할 수 있습니다. 따라서, 그것은 표백 하는 동안 주기적으로 해 현미경 벌레를 포함 하는 튜브를 관찰 하는 것이 중요입니다. 동기화 프로토콜에 고려해 야 할 다른 단계 체포 L1 유 충의 정비 이다. 실 온에서 5 일 동안 관 회전에 체포 애벌레를 유지할 수 있습니다. RNAi는 부 화 후 1 ~ 2 일 안에 먹이 대 한 애벌레를 사용 하는 것이 좋습니다. M9W에서 장기간된 유지 보수 dauer 무대의 형성에 발생할 수 있습니다.
마지막으로, 표현 SKN 1 GFP 융합 유전자 변형 웜 mitis 그룹의 존재 산화 스트레스 반응의 활성화를 모니터링 하는 데 사용 되었다. P38 MAPK의 구성 요소는 창 자 세포의 핵에 SKN-1B/C::GFP의 지역화에 필요한 RNAi에 의해 표시 됩니다. 사용 하 여이 긴장의 L3 또는 L4 단계 관찰 SKN-1B/C::GFP의 지역화 지역화 SKN-1의 성숙한 단계에서 감소 경향으로 중요 하다. 관찰 하기 위해 더 나은 SKN-1B/C::GFP의 지역화, FITC와 DAPI 필터 설정을 사용 하 여 얻은 이미지를 오버랩 하는 것이 좋습니다. Autofluorescence에 의해 생성 되는 lipofuscins 벌레에 SKN 1 지역화의 관찰에 대 한 대비를 제공 하는 데 도움이. 그러나, 그것은 또한 보였다 약하게 표현된 GFP 기자에서 신호는 벌레의 용기에 다양 한 소스에 의해 방출 되는 autofluorescence에 의해 마스크. Autofluorescence는 나이 증가를 보였다 이며 소장과 선 충 C.27의 자 궁에서 가장 높은. 이 문제를 해결 하려면 최근 연구 활용 선 충 C.28SKN-1B/C::GFP의 지역화를 모니터링 하는 트리플 밴드 GFP 필터를 설치 합니다. 이 설치는 녹색과 노란색 채널에 GFP와 autofluoresence를 각각 표시 하는 autofluoresence에서 GFP 신호를 분리 합니다.
C. 선 충 이 프로토콜에 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 어떻게 H2O2 는 mitis 그룹에 의해 생산 pathogenicity 원인 확인 하는 데 사용 됩니다. 더 중요 한 것은,이 모델을 사용 하 여 endoplasmic으로 스트레스, 미토 콘 드 리아 손상, mitophagy, autophagy, 산화 스트레스에 대 한 H2O2 의 효과 공부 될 수 있다. 또한,는 H2O2 셀의 핵심 프로세스를 방해 하 여 면역 응답을 유도 하는 독성 요인으로 작동 하는 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 따라서,이 웜은 호스트 병원 체 상호 작용에 대 한 새로운 통찰력을 발견 하기 위한 강력한 모델 시스템으로 인식 됩니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리 감사 박사 빙 연의 왕, 박사 장군이 Tribble (텍사스 대학, 치과의 학교), 박사 리처드 Lamont (루이스 빌 대학, 치과의 학교), 및 실험실 및 임상 긴장의 제공에 대 한 박사 사무엘 셸 번 (MD 앤더슨 암 센터) mitis streptococci 그룹. 우리는 또한 선 충 C. 긴장에 대 한 박사 키이 스 블랙 웰 (유전학의 부, 하버드의과 대학) 감사합니다. 마지막으로, 우리 감사 박사 다니엘 Garsin와 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥 거 번의과 대학) 시 약 및 연구 수행을 웜 변종. 일부 웜 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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