Summary
O nemátodo Caenorhabditis elegans é um excelente modelo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui descrito é um protocolo para infectar o verme com membros dos estreptococos do grupo mitis e determinar a ativação da resposta stress oxidativo contra H2O2 , produzido por este grupo de organismos.
Abstract
Caenorhabditis elegans (c. elegans), um nematódeo de vida livre, tem emergido como um modelo atraente para estudar interações patógeno-hospedeiro. O protocolo apresentado usa esse modelo para determinar a patogenicidade causada por estreptococos de grupo o mitis através da produção de H2O2. Os estreptococos do grupo mitis são uma ameaça emergente que causam muitas doenças humanas tais como bacteremia, endocardite e celulite orbital. Aqui descrito é um protocolo para determinar a sobrevivência destes vermes em resposta a H2O2 produzido por este grupo de patógenos. Usando a codificação de skn-1 gene para um fator de transcrição de resposta de estresse oxidativo, é mostrado que este modelo é importante para a identificação de genes do hospedeiro que são essenciais contra a infecção estreptocócica. Além disso, é mostrado que a ativação da resposta ao estresse oxidativo pode ser monitorada na presença desses patógenos utilizando uma cepa de worm repórter transgénicas, no qual SKN-1 é fundido a proteína verde fluorescente (GFP). Estes ensaios fornecem a oportunidade de estudar a resposta de estresse oxidativo de H2O2 , derivada de uma fonte biológica, ao contrário de forma exógena adicionado fontes de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio.
Introduction
Estreptococos do grupo mitis são humanos comensais da cavidade orofaríngea1. No entanto, estes organismos podem escapar deste nicho e causar uma variedade de doenças invasivas2. As infecções causadas por esses microorganismos incluem a bacteremia, endocardite e celulite orbital de2,3,4,5,6. Além disso, eles estão surgindo agentes como causadores de infecções da corrente sanguínea em imunocomprometidos, intermitente e pacientes com câncer submetidos a quimioterapia5,7,8,9 .
Os mecanismos subjacentes mitis patogênese de grupo é obscura, porque foram identificados alguns factores de virulência. O grupo mitis é conhecido por produzir H2O2, que tem se mostrado um importante papel em comunidades microbianas oral10. Mais recentemente, vários estudos têm destacado um papel para H2O2 como um cytotoxin que induz a célula epitelial morte11,12. Pneumonia de S., que pertence a este grupo, foi mostrado para produzir altos níveis de H2O2 , que induz os danos do DNA e apoptose em células alveolar13. Usando um modelo animal de pneumonia aguda, os mesmos pesquisadores demonstraram que a produção de H2O2 pela bactéria confere uma vantagem de virulência. Estudos sobre meningite pneumocócica também têm demonstrado que patógeno-derivado H2O2 atua em sinergia com pneumolysin para acionar a célula neuronal morte14. Estas observações estabelecem claramente que H2O2 produzido por este grupo de bactérias é importante para sua patogenicidade.
Curiosamente, ele também foi mostrado que os membros da mitis grupo S. mitis e s. oral provoca a morte do nemátodo c. elegans através da produção de H2O215,16. Este nematódeo de vida livre tem sido usado como um modelo simples, geneticamente tractable estudar muitos processos biológicos. Mais recentemente, o worm tem emergido como um modelo para o estudo de17,de interações patógeno-hospedeiro18. Além disso, diversos estudos evidenciaram a importância de se estudar o estresse oxidativo usando este organismo19,20,21. Seu ciclo de vida curto, a capacidade de "knockdown" genes de interesse por RNAi e uso de proteína fluorescente verde (GFP)-fundidos repórteres para monitorar a expressão do gene são alguns dos atributos que o tornam um sistema modelo atraente. Mais importante, as vias que regulam o estresse oxidativo e imunidade inata no worm são altamente conservadas com mamíferos20,22.
Neste protocolo, que é demonstrado como usar c. elegans para elucidar a patogenia causada por estreptococos-derivado H2O2. Um ensaio de sobrevivência modificada é mostrado, e membros do grupo mitis são capazes de matar os vermes rapidamente através da produção de H2O2. Usando os membros do grupo mitis, uma fonte biológica sustentado de espécies reativas de oxigênio (ROS) é fornecido, ao contrário de fontes químicas que induzem o stress oxidativo nos vermes. Além disso, as bactérias são capazes de colonizar as minhocas rapidamente, que permite a H2O2 ser direcionados diretamente para as células intestinais (em comparação com outras fontes que têm de atravessar várias barreiras). O ensaio é validado ou 1) por determinar a sobrevivência da estirpe mutante skn-1 ou 2) por derrubando skn-1 usando RNAi em worms em relação a N2 selvagem-tipo e vermes Tratado de controle de vetor. SKN-1 é um fator de transcrição importante que regula a resposta de estresse oxidativo em c. elegans23,24,25. Além de ensaios de sobrevivência, uma estirpe de worm expressando um repórter transgénico SKN-1B/C::GFP é usada para monitorar a ativação da estresse oxidativo resposta através da produção de H2O2 pelo grupo mitis.
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Protocol
1. preparação do vossos placas de ágar (extrato de levedura de Todd-Hewitt)
- Para 1 litro de mídia, adicione 30 g de pó de Todd-Hewitt, 2 g de extrato de levedura e 20 g de ágar para um Erlenmeyer de 2 L. Adicionar 970 mL de água desionizada para o conteúdo do frasco e incluir uma barra de agitação. Autoclave a mídia a uma temperatura de 121 ° C e pressão de 15 lb/pol2 por 30 min. Depois disso, definir os meios de comunicação em uma placa de agitação e permitir para resfriamento com agitação suave.
- Despeje a mídia apropriadamente dimensionados pratos de Petri estéril (pratos de 100 x 15 mm para o crescimento e manutenção de bactérias, pratos de 35 x 10 mm para matar ensaios) sob um fluxo laminar. Permitir que os meios de comunicação secar por 2 h no capô laminar. Depois disso, as placas podem ser armazenadas a 4 ° C para 1 mês.
2. preparação do nematoide crescimento médio (NGM) e RNAi alimentando as placas (NGM RNAi)
- Usando uma barra de agitação, dissolva 2,5 g de peptona e 3 g de NaCl em 970 mL de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L. Adicione 20 g de ágar-ágar para a mídia. Autoclave a mídia à temperatura de 121 ° C e à pressão de 15 lb/pol2 por 30 min. definir os meios de comunicação em uma placa de agitação e permite para resfriamento com agitação suave.
- Adicionar as seguintes soluções para a mídia para preparação de placas NGM: 25 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol (5 mg/mL em etanol a 95%) , 1 mL de nistatina (v/w de 10% em etanol) e 1 mL de estreptomicina 25 mg/mL.
- Adicionar as seguintes soluções para a mídia para preparação de RNAi NGM placas de alimentação: 25 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol (5 mg/mL em etanol a 95%) , 1 mL de nistatina (v/w de 10% em etanol), 1 mL de carbenicilina 50mg/mL e 1 mL de IM IPTG.
- Despeje a mídia 60 x 15 mm pratos de Petri estéril sob fluxo laminar. Permitir que os meios de comunicação secar por 2 h no capô laminar. Posteriormente, as placas podem ser armazenadas a 4 ° C para 1 mês.
3. manutenção de c. elegans
- Semente as placas NGM por manchar 50 µ l de pernoite crescido Escherichia coli OP50 no centro das placas. A cultura de e. coli é preparada anteriormente na mídia de Luria-Bertani (LB) e armazenada a 4 ° C por vários meses. Cobrir as placas e deixar secar por 24 h sob uma capa laminar e posteriormente armazenar as placas em poliestireno recipiente.
- Sob um microscópio de dissecação, pegar de 10 a 12 adultos grávidos usando uma picareta worm estéril e transferir os vermes de uma Escherichia coli OP50 semeado placa NGM. Incube as placas a 20 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, retire os adultos usando uma picareta worm estéril e permitir que os embriões desenvolver a larvas L4 a 20 ° C (~2.5 dias).
4. preparação da população em idade síncrono de Worms
-
Lave gravid adultos entre dois e quatro placas NGM usando M9W e cobrá-los em um tubo cônico de 15 mL.
- Para preparar M9W: combine 3 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4e 3 g de KH2PO4 e dissolver em um volume final de 1L de água desionizada. Autoclave a solução e adicionar 1 mL de 1 M MgSO4.
- Girar o tubo a 450 x g por 1 min, em seguida, decante o sobrenadante, garantindo simultaneamente que a pelota worm permanece intacta.
- Adicione 400 µ l de 8,25% de hipoclorito de sódio (água sanitária) e 100 µ l de 5 N NaOH para preparar a solução de lise de verme. Adicionar a solução de Lise para a pelota de verme e misturar o conteúdo por agredir o tubo até 70% dos vermes adultos lysed. Observe periodicamente o conteúdo do tubo sob um microscópio dissecação para garantir que não há nenhum overbleaching dos ovos.
- Dilua a mistura de água sanitária, adicionando 10 mL de M9W para o conteúdo do tubo cónico.
- Girar o tubo a 450 x g por 1 min. decantar sobrenadante e, em seguida, adicionar 10 mL de M9W.
- Repita o passo 4,5 mais duas vezes.
- Resuspenda o pellet de ovo resultante em 3-5 mL de M9W. Coloca o tubo em rotacao do tubo. Permitir que os tubos girar a uma velocidade de 18 rpm na temperatura de quarto (RT) durante a noite.
- No dia seguinte, gire o tubo a 450 x g por 1 min para as larvas L1 de Pelotas. Remova a maioria dos M9W por aspiração, deixando para trás a ~ 250 µ l de líquido no tubo. Resuspenda as larvas L1 e gotas de lugar três 5 µ l de suspensão de worm em uma tampa da placa de Petri e, em seguida, estimativa do número de vermes por µ l utilizando um microscópio de dissecação.
5. indução de RNAi em Worms
- Usando um estéril loop ou escolher, raia para fora as tensões desejadas de RNAi contendo Escherichia coli dos estoques congelados (bibliotecas Ahringer e Vidal) em placas de 100 x 15 mm LB ágar contendo 50 carbenicilina µ g/mL e 15 µ g/mL de tetraciclina. Incube as placas a 37 ° C por 24 h.
- Escolher e inocular uma colônia isolada da estirpe desejada RNAi para tubos cônicos estéril 15 mL, contendo 2 mL de LB suplementado com 50 carbenicilina µ g/mL. Incube os tubos a 37 ° C durante 16 h em um agitador orbital a 150 rpm.
- No dia seguinte, espalhou-se a 150 µ l de cultura adulta durante a noite nas chapas de alimentação 65 x 15 mm RNAi NGM usando um espalhador estéril. Incube as placas a 37 ° C por 24 h.
- Permitir que as placas esfriar a RT após incubação a 37 ° C. Adicione um volume adequado de M9W contendo larvas de L1 ~ 200 (obtidas de população em idade síncrono de passos de vermes) para a e. coli semeado NGM RNAi alimentando as placas. Incube as placas a 20 ° C até que as larvas chegam à fase de L4 (~2.5 dias).
6. preparação de estreptococos grupo Mitis para infecção
- Raia fora desejadas cepas de estreptococos na 100 x 15 mm THY agar (se placas foram armazenadas a 4 ° C, pré-aquecer as placas a 37 ° C antes as respectivas tensões), então, incubar as placas a 37 ° C durante a noite (~ 18 h) em um frasco de vela proporcionando um pt microaerófila kapacitet para o crescimento dos estreptococos (as placas listras podem ser armazenadas por uma semana a 4 ° C).
- Para propagar isolados clínicos de estreptococos, use tryptic soy agar de sangue. Incube as placas a 37 ° C em uma jarra de vela durante a noite (~ 18 h).
- No dia seguinte, retirar as placas do frasco vela e escolher colónias isoladas utilizando uma ansa estéril. Inocule tubos de cônico estéril 15 mL, contendo 2 mL de caldo de THY. Para propagar isolados clínicos de estreptococos, completar o teu caldo com 5% v/v de sangue de ovelha. Feche as tampas apertadas e incubar os tubos a 37 ° C em condições estáticas.
7. ensaios de sobrevivência
Nota: As etapas envolvidas neste ensaio são descritas na Figura 1. Para demonstrar que o H2O2 derivada pelo mitis grupo é responsável pela morte do verme, complementar a mídia com catalase, ou a estirpe mutante ΔspxB e complemento estirpe ΔspxB; spxB + de S. gordonii pode ser usado. SpxB codifica para uma oxidase piruvato, que é responsável pela produção de H2O2 no grupo mitis.
- Pré-aquecer 35 x 10 mm THY placas a 37 ° C. Adicione 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite das cepas de estreptococos desejadas e espalhar as bactérias completamente em toda a superfície do ágar usando um espalhador estéril. Incube as placas a 37 ° C em uma jarra de vela durante a noite (~ 18 h). Como um controle, placas NGM semente dois 35 x 10 mm com 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite de e. coli OP50. Incube as placas a 37 ° C durante a noite.
- Para confirmar que o H2O2 , produzido pelo grupo mitis é responsável pela morte dos vermes, adicionar 50 µ l contendo 1.000 unidades de catalase c para o teu prato. Espalhar a solução da catalase usando um espalhador estéril e permitir que as placas secar no fluxo laminar durante 30 min. semente as placas posteriormente com as cepas de estreptococos respectivos conforme descrito na etapa 7.1.
- No dia seguinte, retirar as placas do frasco vela e permitem escolher as placas arrefecer à RT de 10-15 min. usando um verme estéril, transferência 30 L4 larvas da NGM ou RNAi NGM alimentando as placas para o estreptococo semearam THY placas. Uso dois semeado teus pratos com um total de 60 vermes por cepa de streptococcus. Incubar as placas a 25 ° C.
- Usando um microscópio de dissecação, conte o número de larvas de L4 ao vivo e mortos em cada prato em vários momentos. Inicialmente, marcar os vermes como morto ou vivo a cada 30 min. Daí em diante, quando vermes rapidamente começam a morrer, marcá-las em intervalos de 15 min. Use a palheta worm estéril suavemente prod os vermes e determinar se eles estão vivos ou mortos. Um worm é considerado morto, se não houver nenhum movimento em resposta para o estímulo.
- O ensaio vai levar 5-6 h para completar. Repeti o experimento mais duas vezes. Após a conclusão do ensaio, agrupe todos os dados de ambas as placas. Os dados de cada grupo de entrada, comparar as curvas de sobrevivência e realizar a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier usando o software estatístico.
8. preparação das almofadas de Agarose para microscopia
- Dissolva 2% w/v de agarose em água desionizada aquecendo a solução em um microondas. Um volume de 5 mL de solução é adequado para preparar 20 slides.
- Cole a fita de laboratório longitudinalmente ao longo de duas lâminas de vidro. Isto irá determinar a espessura das almofadas do agarose. Coloque uma lâmina de vidro limpa entre os dois slides gravadas.
- Lugar de 100 µ l de agarose derretido no centro do slide limpo. Colocar imediatamente outro copo limpo em cima o agarose derretido e pressione suavemente para baixo para fazer uma almofada. Permitir que a agarose solidificar e posteriormente retirar a lâmina superior. A almofada de agarose é pronta para uso.
9. observação do SKN-1 localização em resposta à infecção de estreptococos
Nota: As etapas envolvidas neste ensaio são representadas na Figura 2. Localização de SKN-1 foi determinada utilizando a cepa de transgénicos worm SKN-1B/C::GFP. Para demonstrar a localização do SKN-1 devido à produção de H2O2 pelo grupo mitis, selvagem-tipo (WT), ΔspxB e o complemento estirpe ΔspxB; spxB + de S. gordonii foram usados. Além disso, a cepa transgênica repórter SKN-1B/C::GFP e a técnica de interferência RNAi foram usados para demonstrar que os componentes da via MAPK p38 regulam a localização do SKN-1.
- Pré-aquecer 35 x 10 mm THY placas a 37 ° C. Adicione 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite das estirpes de streptococcus desejadas e espalhar as bactérias completamente em toda a superfície do ágar usando um espalhador estéril. Incube as placas a 37 ° C em uma jarra de vela durante a noite (~ 18 h). Como um controle, placas NGM semente três 35 x 10 mm com 80 µ l de culturas cultivadas durante a noite de e. coli OP50. Incube as placas a 37 ° C ~ 18 h.
- No dia seguinte, remover placas do frasco vela e permitir que as placas para esfriar a RT para larvas de lavagem L4 de 10-15 min. usando M9W de NGM e NGM RNAi placas de alimentação. Recolha os vermes em tubos cônico de 15 mL.
- Gire os tubos a 450 x g por 1 min. decantar o sobrenadante e adicionar 10 mL de M9W.
- Repita o passo 9.3 mais três vezes.
- Resuspenda as minhocas em ~ 250 µ l de M9W e lugar gotas de 3 a 5 µ l de suspensão de worm em uma prato de Petri limpo tampa e estimar o número de vermes por µ l utilizando um microscópio de dissecação.
- Adicione as larvas L4 de ~ 100 a cada teu estreptococos semeado e NGM Escherichia coli semeado de placas. Use três placas por cepa de bactérias. Incubar as placas durante 2 a 3 h a 25 ° C.
- Depois disso, retire as placas da incubadora, lavá-los com M9W e coletar os vermes em tubos cônico de 15 mL.
- Lave os vermes 3 x, conforme descrito em passos 9.3.
- Remover a maior parte do M9W por aspiração e adicionar 500 µ l de M9W contendo 2 mM hidrocloreto de sódio azida ou 2mm tetramisole ao pellet de verme. Isso irá anestesiar os vermes, garantindo que nenhum movimento ocorre quando imaginada sob o microscópio.
Atenção: Use equipamentos de proteção individual (EPI) ao manusear a azida de sódio. Prepare a solução de azida sob uma capa de química. - Incube as pelotas de worm em RT por 15 min. Então, ponto 15 µ l de suspensão de worm em um bloco de agarose preparado. Coloque delicadamente uma lamela n. º 1.5 sobre a almofada de agarose contendo os sem-fins anestesiados.
- Usando um microscópio fluorescente, visualize a localização do SKN-1 utilizando filtros FITC e DAPI. Vermes de imagem em 10x e 20 x de ampliações.
- Marca os vermes baseados no nível de localização do SKN-1. Nenhuma localização nuclear, localização de SKN-1B/C::GFP na anterior ou posterior do worm e localização nuclear da SKN-1B/C::GFP em todas as células intestinais são categorizados como baixa, média e altos níveis de localização, respectivamente.
- Depois de marcar as micrografias fluorescentes, determine as diferenças estatísticas por chi-quadrado e testes exatos de Fisher, usando o software estatístico.
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Representative Results
Membros do mitis grupo S. mitis, S. oral e S. gordonii rapidamente mataram os vermes, ao contrário de S. mutans, S. salivarius e não-patogênicas de Escherichia coli OP50(Figura 3). A sobrevida mediana para S. mitis, S. oral e S. gordonii foi 300 min, 300 min e min 345, respectivamente. Para determinar se a matança foi mediada por H2O2, catalase foi completada a tua agar. A morte dos vermes foi abolida na presença de catalase (Figura 3B). Para confirmar ainda mais se estreptocócica derivada H2O2 mediada matança dos vermes, sobrevivência na estirpe mutante despxB Δ, tensão WT e complemento estirpe ΔspxB; spxB + de S. gordonii foi analisado. Morte dos vermes não foi observado sobre a estirpe mutante de ΔspxB em comparação com o selvagem-tipo e complementar cepas (Figura 3C). Estes dados sugerem que o H2O2 , produzido pelo grupo mitis Medeia a matança dos vermes. Observou-se também semelhante cinética de matar quando os vermes foram expostos de isolados clínicos dos estreptococos do grupo mitis obtidos a partir do sangue de pacientes com câncer (Figura 3-D). Com base nos dados, a patogenicidade causada por H2O2 , produzido pelos estreptococos grupo mitis foi avaliada.
Para identificar os genes do hospedeiro que são essenciais contra infecções estreptocócicas, skn-1 foi ao chão, que codifica para o fator de transcrição de resposta de estresse oxidativo em c. elegans. Então, a sobrevivência em relação os vermes de tratados de controle de vetor foi comparada. Foi observada uma diminuição significativa na sobrevivência dos vermes "knockdown" skn-1 em comparação com os vermes de tratados de controle de vetor(Figura 4). Esses dados foram validados ainda mais usando uma estirpe mutante skn-1 , e sua sobrevivência foi comparada com a dos vermes selvagem-tipo N2. Observamos um fenótipo semelhante de matar como o mutante skn-1 , como pode ser visto com o nocaute skn-1 , demonstrando que o SKN-1 influenciou a sobrevivência dos vermes no grupo mitis (Figura 4B).
Em seguida, determinou-se o H2O2 produzido pelo grupo de mitis causado a localização do SKN-1B/C::GFP nos vermes. Localização de SKN-1B/C::GFP foi observada em vermes expostos ao tipo selvagem e manchas de complemento e não em resposta à estirpe mutante despxB Δ de s. gordonii (Figura 5A, B). Além disso, para determinar a ativação do SKN-1, componentes da via MAPK p38 foram derrubadas. Observou-se redução localização do SKN-1B/C::GFP em worms knockdown nsy-1, sek-1, - 1, pmk e skn-1 relativo para os vermes de tratados de controle de vetor. Os dados sugerem a p38 que MAPK é necessária para a ativação do SKN-1, em resposta a H2O2 , produzido pelo grupo mitis (Figura 5C, D).
Figura 1 : Fluxograma descrevendo as etapas envolvidas na preparação dos ensaios sobrevivência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Fluxograma descrevendo as etapas envolvidas na localização do SKN-1 durante a infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : H2O2-mediada matando de c. elegans por estreptococos do grupo mitis. Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de larvas L4 expostas ao (A) S. gordonii, oral S., S. mitis, S. salivarius, S. mutans e Escherichia coli OP50. (B) S. gordonii, oral S., S. mitis, S. salivarius, S. mutans e Escherichia coli OP50 em THY placas na presença de 1.000 U de catalase. (C) S. gordonii WT, ΔspxB mutantes e ΔspxB; spxB + complementam estirpes em larvas L4 de N2. (D) S. oral (VGS #3), S. oral (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) e Escherichia coli OP50. Os dados são representativos das experiências repetida duas ou mais vezes, com n = 60 minhocas para cada condição. Análise de classificação log Kaplan-Meier foi usado para comparar as curvas de sobrevivência e calcular a sobrevida mediana. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Esta figura foi modificada e adaptada com permissão de15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : SKN-1 é necessário para a sobrevivência dos vermes na S. gordonii. (A) sobrevivência de tratados de controle de vetor e skn-1 knockdown vermes expostos a S. gordonii. (B) sobrevivência de N2 e vermes mutantes skn-1(zu67) alimentaram com S. gordonii. Os dados são representativos das experiências repetida duas ou mais vezes, com n = 60 minhocas para cada condição. Análise de classificação log Kaplan-Meier foi usado para comparar as curvas de sobrevivência e calcular a sobrevida mediana. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Esta figura foi modificada e adaptada com permissão de15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Estreptocócica H2O2 mediada por ativação do SKN-1 é dependente da via MAPK p38. (A) imagens representativas da localização do SKN-1B/C::GFP em vermes expostos ao WT, mutante despxB Δ e ΔspxB; spxB + complemento as cepas de S. gordonii. Close-ups são mostrados no canto superior direito de cada imagem. Barra de escala = 100 µm. (B) o grau de localização nuclear da SKN-1B/C::GFP e porcentagem de vermes em cada categoria alimentada na WT, mutante despxB Δ e ΔspxB; spxB + complemento as cepas de S. gordonii. Significativamente, os baixos níveis de localização nuclear da SKN-1B/C::GFP foram observados no mutante despxB Δ (p < 0,0001) em comparação com as WT e ΔspxB; spxB + complemento cepas de S. gordonii. (C) imagens representativas da localização do SKN-1B/C::GFP em nsy-1 sek-1, 1-pmk, skn-1 nocaute e controle vetorial trataram worms em S. gordonii. Close-ups são mostrados no canto superior direito de cada imagem. Barra de escala = 100 µm. (D) o grau de localização nuclear SKN-1B/C::GFP e porcentagem de vermes em cada categoria se alimentaram nsy-1, 1-sek, pmk-1, skn-1 knockdown e tratados de controle de vetor vermes na S. gordonii. Significativamente baixos níveis de localização nuclear da SKN-1B/C::GFP foram observados no nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), pmk-1 (p < 0,0001)e skn-1 nocaute (p < 0,0001) em comparação com o vetor controle Tratado worms em S. gordonii. Maior que 100 vermes expostos a cada estirpe foram fotografadas, e o experimento foi repetido três vezes. Esta figura foi modificada e adaptada com permissão de15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos descritos podem ser usados para outras bactérias patogénicas como Enterococcus faecium, que também produz H2O2 crescidas sob anaeróbio ou microaerofílicas condições26. Normalmente, para os organismos patogénicos mais, demora vários dias a semanas para completar os ensaios de sobrevivência. No entanto, devido à produção de robusta de H2O2 por membros do grupo mitis, estes ensaios podem ser concluídos no prazo de 5-6 h, nas condições descritas. Isso garante a capacidade de vários candidatos de genes envolvidos na imunidade do hospedeiro e a resposta de estresse oxidativo de tela por um curto período de tempo.
Neste protocolo, H2O2 produzida pela bactéria está em contato direto com as células intestinais do worm, ao contrário de outras fontes exógenas de ROS que deve atravessar várias barreiras. Isso garante que o H2O2 é entregue para as células intestinais; Portanto, uma resposta de matar mais robusta é observada no verme. Usando bactérias fluorescente etiquetadas, foi determinado que os vermes devem ser expostos a agentes patogénicos por 30 min para a completa colonização do trato intestinal15. É aconselhável usar menos de 1 semana de idade placas de raia de cepas de estreptococos para assegurar a sua viabilidade e capacidade para produzir H2O2. Além disso, as cepas de estreptococos devem ser cultivadas sob condições de microaerófila para produção ideal de H2O2. L4 larvas ou adultos 1 dias de idade podem ser utilizados para este teste. É fundamental que todos os vermes usados em um experimento são da mesma idade e sexo. Vermes mais jovens tendem a morrer mais lentamente em relação ao mais velho hermafroditas. L4 animais distinguem-se mais facilmente porque sua vulva em desenvolvimento é visível no meio do corpo, como uma mancha clara que contrasta com o resto do corpo. Também é importante que não OP50 de Escherichia coli são transferidos para as placas de estreptococos semeado. Contaminação de matar placas com e. coli pode causar a atenuação ou a revogação da matança dos vermes. Para evitar a contaminação, é necessário escolher vermes longe do gramado de Escherichia coli . Quando marcar os ensaios de sobrevivência, é aconselhável observar a faringe bombeamento, forrageamento comportamento da cabeça e movimento do corpo. Para garantir que o worm está morto, recomenda-se suavemente prod o nariz, o lado do corpo ou cauda e observar qualquer movimento.
RNAi alimentação e a sobrevivência dos vermes no grupo mitis foi combinado para identificar candidatos que estão envolvidos na defesa contra H2O2. Usar o gene skn-1 que codifica um factor de transcrição de resposta de estresse oxidativo, sua exigência para sobrevivência do worm em resposta a H2O2 é demonstrado aqui. Portanto, este ensaio pode ser adaptado para a tela por vários genes e identificar potenciais candidatos necessários à imunidade e resposta ao estresse oxidativo. RNAi alimentação dos vermes é conseguido pela adição de idade sincronizado larvas L1 para o RNAi expressando gramados de Escherichia coli . Durante o protocolo de sincronização de verme, é essencial para monitorar o lysis das cutículas worm na presença de água sanitária e hidróxido de sódio. A cutícula de larvas e adultos irá dissolver continuamente, enquanto os embriões são parcialmente protegidos por grossa casca de ovo. No entanto, incubação prolongada na presença de mistura de hidróxido de sódio a conduzirem pode causar os embriões morrer. Portanto, é importante observar o tubo contendo os sem-fins sob um microscópio de dissecação periodicamente durante o clareamento. Mais um passo para considerar o protocolo de sincronização é a manutenção do presas larvas L1. As larvas presas podem ser mantidas num rotador tubo por 5 dias à temperatura ambiente. É recomendável usar as larvas para a alimentação de RNAi dentro de 1 a 2 dias após a eclosão. Manutenção prolongada em M9W pode resultar na formação de fase dauer.
Por último, um verme transgênico expressando SKN-1 fundida a GFP foi usado para monitorar a ativação da resposta de estresse oxidativo na presença do grupo mitis. Ele é mostrado por RNAi que os componentes da p38 MAPK são necessários para a localização de SKN-1B/C::GFP para os núcleos das células intestinais. É importante usar os estágios L3 ou L4 desta estirpe para observar a localização do SKN-1B/C::GFP, como localização de SKN-1 tende a diminuir na fase adulta. Para melhor observar a localização do SKN-1B/C::GFP, é aconselhável sobrepor as imagens obtidas usando as configurações de filtro FITC e DAPI. Autofluorescência gerado pelos lipofuscins ajudar a fornecer contraste para observação de SKN-1 localização no worm. No entanto, ele também foi mostrado que o sinal de repórteres GFP fracamente expressos é mascarado pelo autofluorescência emitida por várias fontes no intestino do verme. Autofluorescência foi mostrada para aumentar com a idade e é mais elevada no intestino e útero da c. elegans27. Para superar este problema, um estudo recente utilizada uma configuração de filtro GFP de banda tripla para monitorar a localização do SKN-1B/C::GFP em c. elegans28. Esta configuração separa o sinal GFP autofluoresence, exibindo o GFP e autofluoresence nos canais verdes e amarelos, respectivamente.
C. elegans é utilizado neste protocolo para estudar interações patógeno-hospedeiro e verificar como H2O2 , produzido pelo grupo mitis causa patogenicidade. Mais importante, usando este modelo, podem ser estudados os efeitos de H2O2 na endoplasmic stress reticular, dano mitocondrial, mitophagy, autofagia e estresse oxidativo. Além disso, os mecanismos pelos quais o H2O2 age como um fator de virulência para eliciar respostas imunes por perturbar os processos do núcleo da célula podem ser identificados. Portanto, este worm é reconhecido como um sistema poderoso modelo para descobrir novos insights sobre interações patógeno-hospedeiro.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Wang Bing-Yan, Dr. Gena Tribble (da Universidade do Texas, faculdade de Odontologia), Dr. Richard Lamont (Universidade de Louisville, faculdade de Odontologia) e Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) para fornecer o laboratório e estirpes clínicas de Os estreptococos do grupo mitis. Agradecemos também o Dr. Keith Blackwell (departamento de genética, faculdade de medicina de Harvard) para as cepas de c. elegans . Finalmente, agradecemos a Dr. Danielle Garsin e laboratório dela (da Universidade do Texas, faculdade de medicina de McGovern) para fornecimento de reagentes e cepas de worm para conduzir o estudo. Algumas cepas de vírus foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
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