Summary
El nematodo Caenorhabditis elegans es un excelente modelo para disecar interacciones huésped-patógeno. Se describe aquí es un protocolo para infectar el gusano con los miembros de los estreptococos del grupo mitis y determinar la activación de la respuesta de estrés oxidativo contra H2O2 producido por este grupo de organismos.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo de vida libre, se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El protocolo presentado utiliza este modelo para determinar la patogenicidad causada por los estreptococos del grupo mitis a través de la producción de H2O2. Los estreptococos del grupo mitis son una amenaza emergente que causan muchas enfermedades en humanos tales como bacteremia, endocarditis y celulitis orbitaria. Se describe aquí es un protocolo para determinar la supervivencia de estos gusanos en respuesta a H2O2 producido por este grupo de patógenos. Usando la codificación de skn-1 gen para un factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo, se muestra que este modelo es importante para la identificación de genes de host que están esenciales contra la infección estreptocócica. Además, está demostrado que la activación de la respuesta de estrés oxidativo se puede supervisar en presencia de estos patógenos utilizando una cepa de gusano reportero transgénicos, en la que SKN-1 está fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP). Estos ensayos ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta de estrés oxidativo a H2O2 derivado de una fuente biológica como contraposición a exógeno agregado fuentes de oxígeno reactivo (ROS) las especies.
Introduction
Estreptococos del grupo mitis son humanos comensales de la cavidad bucofaríngea1. Sin embargo, estos organismos pueden escapar de este lugar y causar una variedad de enfermedades invasivas2. Las infecciones causadas por estos microorganismos incluyen bacteriemia, endocarditis y celulitis orbitaria2,3,4,5,6. Por otra parte, ellos surgen como agentes de infecciones del torrente sanguíneo en neutropénicos, inmunodeprimidos y pacientes con cáncer que han sufrido quimioterapia5,7,8,9 .
Los mecanismos de patogénesis de grupo mitis subyacente es ocultar, porque se han identificado algunos factores de virulencia. El grupo mitis se conoce para producir H2O2, que ha demostrado que juegan un papel importante en las comunidades microbianas orales10. Más recientemente, varios estudios han puesto de manifiesto una función de H2O2 como una citotoxina que induce muerte de células epiteliales11,12. Neumonía por S. que pertenece a este grupo, se ha demostrado para producir altos niveles de H2O2 que induce daño en el ADN y la apoptosis en células alveolares13. Utilizando un modelo animal de neumonía aguda, los mismos investigadores demostraron que la producción de H2O2 por las bacterias confiere una ventaja de virulencia. Estudios sobre la meningitis neumocócica también han demostrado que derivados del patógeno H2O2 actúa sinérgicamente con inmunoprotectores para accionar la célula neuronal muerte14. Estas observaciones establecen claramente que H2O2 producido por este grupo de bacterias es importante para su patogenicidad.
Curiosamente, también ha sido demostrado que miembros de la mitis grupo S. mitis y S. oralis causa muerte de los nematodos C. elegans mediante la producción de H2O215,16. Este nematodo de vida libre se ha utilizado como un modelo simple, genéticamente manejable para el estudio de muchos procesos biológicos. Más recientemente, el gusano ha emergido como un modelo para el estudio de17,de las interacciones huésped-patógeno18. Además, varios estudios han puesto de relieve la importancia de estudiar el estrés oxidativo mediante este organismo19,20,21. Su ciclo de vida corto, capacidad de precipitación genes de interés por ARNi y el uso de la proteína verde fluorescente (GFP)-Reporteros fundidos para monitorizar la expresión génica son algunos de los atributos que lo convierten en un sistema modelo atractivo. Más importante aún, las vías que regulan el estrés oxidativo y la inmunidad innata en el gusano están muy conservadas con mamíferos20,22.
En este protocolo, se demuestra cómo utilizar C. elegans para dilucidar la patogenicidad causada por estreptococos derivados H2O2. Se muestra un análisis de supervivencia modificado, y los miembros del grupo mitis son capaces de matar los gusanos rápidamente a través de la producción de H2O2. Con miembros del grupo mitis, una fuente biológica sostenida de especies reactivas del oxígeno (ROS) cuenta, a diferencia de fuentes químicas que inducen estrés oxidativo en los gusanos. Además, las bacterias son capaces de colonizar rápidamente, los gusanos que permite H2O2 a dirigirse directamente a las células intestinales (en comparación con otras fuentes que tienen que cruzar varias barreras). El ensayo es validado o 1) por determinación de la supervivencia de la cepa mutante de skn-1 o 2) por derribar skn-1 utilizando RNAi en gusanos en relación con el N2 de tipo salvaje y vector control tratado gusanos. SKN-1 es un factor de transcripción importante que regula la respuesta al estrés oxidativo en C. elegans23,24,25. Además de análisis de supervivencia, una cepa de gusano expresando un reportero transgénico SKN-1B/C::GFP se utiliza para controlar la activación de la estrés oxidativo respuesta a través de la producción de H2O2 por el grupo mitis.
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Protocol
1. preparación de tus placas de Agar (Extracto de levadura de Todd-Hewitt)
- Para 1 L de media, agregue 30 g de polvo de Todd-Hewitt, 2 g de extracto de levadura y 20 g de agar a un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Agregar 970 mL de agua desionizada para el contenido del matraz e incluir una barra de agitación. Autoclave de los medios de comunicación a una temperatura de 121 ° C y presión de 15 lb/pulgada2 por 30 min. Después de eso, establecer los medios de comunicación en una placa de agitación y permiten para enfriamiento con agitación suave.
- Vierta los medios de comunicación en platos de Petri estériles tamaño adecuado (platos de 100 mm x 15 mm para el crecimiento y mantenimiento de las bacterias, platos 35 x 10 mm para matar a ensayos) bajo un flujo laminar. Permitir que los medios de comunicación se seque por 2 h debajo de la campana laminar. Después de eso, las placas pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.
2. preparación de medio de cultivo nematodos (NGM) y ARNi alimentación placas (NGM ARNi)
- Utilizando una barra de agitación, disolver 2,5 g de peptona y 3 g de NaCl en 970 mL de agua desionizada en un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Añadir 20 g de agar a los medios de comunicación. Autoclave de los medios a una temperatura de 121 ° C y presión de 15 lb/pulgada2 por 30 minutos establece los medios de comunicación en una placa de agitación y permiten enfriamiento con agitación suave.
- Agregar las siguientes soluciones a los medios de comunicación para la preparación de planchas NGM: 25 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol al 95%) , 1 mL de nistatina (10% v/w en etanol) y 1 mL de estreptomicina 25 mg/mL.
- Agregar las siguientes soluciones a los medios de comunicación para la preparación de RNAi de NGM placas de alimentación: 25 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol al 95%) , 1 mL de nistatina (10% v/w en etanol) 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL y 1 mL de IM IPTG.
- Vierta la media 60 x 15 mm placas de Petri estériles bajo flujo laminar. Permitir que los medios de comunicación se seque por 2 h debajo de la campana laminar. Posteriormente, las placas pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.
3. mantenimiento de C. elegans
- Semilla de las planchas NGM por telescopio 50 μl de la noche a la mañana crecido OP50 de e. coli en el centro de las placas. La cultura de e. coli se prepara previamente en medio Luria-Bertani (LB) y almacenada a 4 ° C durante varios meses. Cubrir las placas y déjelos secar durante 24 h. bajo una campana de laminar y después almacenar las placas en contenedor de poliestireno.
- Bajo un microscopio de disección, 10 a 12 adultos grávidos mediante una selección de gusano estéril de recogida y transferencia de los gusanos a una e. coli OP50 semillas placa de NGM. Incubar las placas a 20 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, retirar a los adultos con un pick de gusano estéril y dejar los embriones desarrollar a las larvas L4 a 20 ° C (~2.5 días).
4. preparación de edad población sincrónica de gusanos
-
Lavar a adultos grávidos de dos a cuatro placas NGM usando M9W y recoger en un tubo cónico de 15 mL.
- M9W de preparar: mezclar 3 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4y 3 g de KH2PO4 y disolver en un volumen final de 1 L de agua desionizada. Autoclave de la solución y añadir 1 mL de 1 M de MgSO4.
- Girar el tubo a 450 x g durante 1 min, luego decantar el sobrenadante asegurando que los pellets de lombriz permanece intacto.
- Añadir 400 μL de 8.25% hipoclorito sódico (lejía doméstica) y 100 μl de 5 N NaOH para preparar la solución de lisis de gusano. Añadir la solución de lisis a la pelotilla de gusano y mezclar el contenido agitando el tubo de hasta 70% de los gusanos adultos son lisis. Observar periódicamente el contenido del tubo con un microscopio de disección para asegurar que no es no overbleaching de los huevos.
- Diluir la mezcla de lejía añadiendo 10 mL de M9W y el contenido del tubo cónico.
- Girar el tubo en 450 x g durante 1 minuto decantar sobrenadante, luego añadir 10 mL de M9W.
- Repita el paso 4.5 dos veces más.
- Resuspender el precipitado de huevo resultante en 3-5 mL de M9W. Coloque el tubo en un tubo de los rotadores. Permita que los tubos giren a una velocidad de 18 rpm a temperatura ambiente (RT) durante la noche.
- Al día siguiente, girar el tubo a 450 x g durante 1 min para que sedimenten las larvas L1. Eliminar la mayor parte de M9W por aspiración, dejando 250 μl de líquido en el tubo. Suspender las larvas L1 y gotas de lugar tres 5 μl de la suspensión de gusano sobre una tapa de caja Petri, entonces la estimación del número de lombrices por μl utilizando un microscopio de disección.
5. inducción de RNAi en gusanos
- Usando un estéril del lazo o recoger, racha a las cepas deseadas de RNAi que contiene e. coli de las existencias congeladas (bibliotecas Ahringer y Vidal) en placas de agar de 100 x 15 mm LB que contiene 50 carbenicilina μg/mL y 15 μg/mL de la tetraciclina. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h.
- Recoger e inocular una colonia aislada de la tensión deseada de ARNi en tubos cónicos de 15 mL estéril conteniendo 2 mL de LB suplementado con 50 carbenicilina μg/mL. Incubar los tubos a 37 ° C por 16 h en un agitador orbital a 150 rpm.
- Al día siguiente, extensión 150 μL del cultivo crecido durante la noche sobre placas de alimentación del ARNi NGM de 65 x 15 mm utilizando un esparcidor estéril. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 h.
- Permita que las placas se enfríe a RT después de la incubación a 37 ° C. Añadir un volumen adecuado de M9W que contienen larvas L1 de ~ 200 (obtenidas de la población en edad de sincrónica de pasos de gusanos) a la e. coli sembrado NGM ARNi placas de alimentación. Incubar las placas a 20 ° C hasta que las larvas alcancen la etapa de L4 (~2.5 días).
6. preparación de los estreptococos del grupo Mitis para infección
- La raya hacia fuera deseadas cepas de estreptococos en la 100 x 15 mm tu agar (si las placas fueron almacenadas a 4 ° C, caliente previamente las placas a 37 ° C antes de rayar las cepas respectivas), luego incubar las placas a 37 ° C durante la noche (~ 18 h) en un bote de vela proporcionando un microaerofílicas en eliminaciòn para el crecimiento de estreptococos (las placas veteadas pueden guardarse durante una semana a 4 ° C).
- Para propagar cepas clínicas de estreptococos, utilizar agar sangre de soja tríptico. Incubar las placas a 37 ° C en un frasco de la vela durante la noche (~ 18 h).
- Al día siguiente, quitar las placas del frasco de la vela y escoja colonias aisladas utilizando un asa estéril. Inocular tubos cónicos estériles de 15 mL que contiene 2 mL de caldo de tu. Para propagar cepas clínicas de estreptococos, complementar el tu caldo con v/v del 5% de sangre de carnero. Cierre las tapas apretadas e incubar los tubos a 37 ° C en condiciones estáticas.
7. supervivencia de ensayos
Nota: Los pasos involucrados en este ensayo se muestran en la figura 1. Para demostrar que el H2O2 derivado de la mitis grupo es responsable de la muerte del gusano, complementar los medios de comunicación con la catalasa o la cepa mutante ΔspxB y complemento cepa ΔspxB; spxB + de S. gordonii puede ser utilizado. SpxB codifica para una oxidasa piruvato, que es responsable de la producción de H2O2 en el grupo mitis.
- Caliente previamente 35 x 10 mm tus placas a 37 ° C. Añadir 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de las deseada cepas de estreptococos y trasmitir las bacterias totalmente a través de la superficie del agar utilizando un esparcidor estéril. Incubar las placas a 37 ° C en un frasco de la vela durante la noche (~ 18 h). Como control, placas de NGM semilla dos de 35 x 10 mm con 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de e. coli OP50. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
- Para confirmar que el H2O2 producido por el grupo mitis es responsable de la muerte de los gusanos, añada de 50 μl que contiene 1.000 unidades de catalasa c sobre el tu placa. Distribuir la solución de catalasa utilizando un esparcidor estéril y dejar las planchas a seco en el flujo laminar durante 30 minutos semillas las placas después de eso con las cepas de streptococcus respectivas tal como se describe en el paso 7.1.
- Al día siguiente, quitar las placas del frasco de la vela y permite elegir las placas que se enfríe a RT durante 10-15 minutos utilizando un gusano estéril, 30 las larvas L4 de la NGM o ARNi NGM alimentación platos para el estreptococo transferencia semillas tus placas. Use dos sembrados tus placas con un total de 60 lombrices por cepa de estreptococo. Incubar las placas a 25 ° C.
- Usando un microscopio de disección, contar el número de las larvas L4 de vivos y muertos en cada plato en varios puntos de tiempo. Inicialmente, anotar los gusanos como muerto o vivo cada 30 minutos. Después de eso, cuando gusanos rápidamente comienzan a morir, les cuenta a intervalos de 15 minutos. Utilice la selección de gusano estéril suavemente prod los gusanos y determinar si están vivos o muertos. Un gusano se considera a muerto si no hay ningún movimiento en respuesta a la insistencia.
- El ensayo llevará a 5-6 horas para completar. Repetir el experimento dos veces más. Después de la terminación del ensayo, los datos de las dos placas de la piscina. Introduzca los datos de cada grupo, comparar las curvas de supervivencia y realizar análisis de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando software estadístico.
8. preparación de agarosa almohadillas para microscopía
- Calentando la solución en el microondas, disolver 2% peso/volumen de agarosa en agua desionizada. Un volumen de 5 mL de solución es adecuado para preparar 20 diapositivas.
- Pegar cinta de laboratorio longitudinalmente a lo largo de dos laminas de vidrio. Esto determinará el espesor de las pastillas de agarosa. Colocar un portaobjetos de vidrio limpio entre los dos portaobjetos con cinta.
- Coloque 100 μl de la agarosa fundida en el centro de la diapositiva limpia. Inmediatamente coloque otro vaso limpio en la parte superior la agarosa fundida y presione suavemente hacia abajo para hacer un cojín. Permita que la agarosa solidificar y posteriormente eliminar la diapositiva superior. La almohadilla de agarosa está lista para usar.
9. observación de SKN-1 localización en respuesta a la infección por Streptococcus
Nota: Los pasos involucrados en este ensayo se muestran en la figura 2. Localización de SKN-1 se determinó utilizando la cepa de gusano transgénico SKN-1B/C::GFP. Fueron utilizados demostrar la localización de SKN-1 debido a la producción de H2O2 por el grupo mitis, wild-type (WT), ΔspxB y el complemento cepa ΔspxB; spxB + de S. gordonii . Además, la técnica de interferencia ARNi y cepa transgénica reportero SKN-1B/C::GFP fueron utilizados para demostrar que los componentes de la vía MAPK p38 regulan la localización de SKN-1.
- Caliente previamente 35 x 10 mm tus placas a 37 ° C. Añadir 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de las deseada cepas de estreptococo y trasmitir las bacterias totalmente a través de la superficie del agar utilizando un esparcidor estéril. Incubar las placas a 37 ° C en un frasco de la vela durante la noche (~ 18 h). Como control, placas de NGM semilla tres de 35 x 10 mm con 80 μl de culturas cultivadas durante la noche de e. coli OP50. Incubar las placas a 37 ° C para h ~ 18.
- Al día siguiente, saque el frasco de la vela y permitir que las placas se enfríe a RT durante 10-15 min lavado L4 larvas usando M9W de NGM y placas alimentación NGM ARNi. Recoja los gusanos en tubos cónicos de 15 mL.
- Hacer girar los tubos a 450 x g durante 1 minuto, decantar el sobrenadante y añadir 10 mL de M9W.
- Repita el paso 9.3 tres veces más.
- Suspender los gusanos en 250 μl de M9W y lugar gotas tres 5 μl de la suspensión de gusano sobre una tapa de caja de Petri limpia y estimar el número de lombrices por μl utilizando un microscopio de disección.
- Agregar las larvas L4 de ~ 100 a cada uno tu estreptococo semillas y sembrado de NGM e. coli placas. Utilizar tres platos por cepa de bacterias. Incubar las placas durante 2 a 3 horas a 25 ° C.
- Después de eso, quite las placas de la incubadora, lavarlos con M9W y recoger los gusanos en tubos cónicos de 15 mL.
- Lavar los gusanos 3 x como se describe en 9.3 los pasos.
- Eliminar la mayor parte de la M9W por aspiración y agregar 500 μl de M9W conteniendo 2 mM sodio azida o 2 mM clorhidrato de tetramisole para la pelotilla de gusano. Esto va anestesiar los gusanos, asegurando que ningún movimiento se produce cuando reflejada bajo el microscopio.
PRECAUCIÓN: Utilice equipo de protección personal (PPE) al manipular azida de sodio. Preparar la solución de azida debajo de una campana química. - Incubar las pelotillas de gusano a TA durante 15 minutos. Entonces, punto 15 μl de la suspensión de gusano en una almohadilla de agarosa preparado. Coloque suavemente un cubreobjetos no. 1.5 sobre la almohadilla de agarosa que contiene los gusanos anestesiados.
- Usando un microscopio de fluorescencia, visualizar la localización de SKN-1 utilizando filtros DAPI y FITC. Imagen gusanos en 10 x y 20 aumentos x.
- Puntuación de los gusanos basados en el nivel de localización de SKN-1. No hay localización nuclear, localización de SKN-1B/C::GFP en el anterior o posterior del gusano y localización nuclear de SKN-1B/C::GFP en todas las células intestinales se clasifican como bajo, medio y alto nivel de localización, respectivamente.
- Después de marcar las imágenes fluorescentes, determinar las diferencias estadísticas de chi-cuadrado y pruebas exactas de Fisher utilizando software estadístico.
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Representative Results
Grupo de miembros de la mitis S. mitis, S. oralis y S. gordonii rápidamente mataron a los gusanos, a diferencia de S. mutans, S. salivarius y no patógenas e. coli OP50 (figura 3A). La mediana de la supervivencia de S. mitisy S. oralis, S. gordonii era 300 min y 300 min min 345, respectivamente. Para determinar si el asesinato fue mediado por H2O2, catalasa fue suplida a tu agar. La muerte de los gusanos fue abolida en presencia de catalasa (figura 3B). Para confirmar aún más si estreptocócica derivada H2O2 mediada por matar a los gusanos, supervivencia en la cepa mutante de ΔspxB cepa WT y complemento cepa ΔspxB; spxB + de S. gordonii analizó. Muerte de los gusanos no se observó en la cepa mutante de ΔspxB , en comparación con el tipo salvaje y complementar cepas (figura 3C). Estos datos sugieren que el H2O2 producido por el grupo mitis media matar a los gusanos. También observamos similar cinética de muerte cuando las lombrices fueron expuestas a los aislados clínicos de los estreptococos del grupo mitis obtenidos de la sangre de pacientes con cáncer (figura 3D). Base de datos, se evaluó la patogenicidad causada por H2O2 producida por los estreptococos del grupo mitis.
Para identificar los host genes esenciales contra las infecciones estreptocócicas, skn-1 fue derribado, que codifica para el factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo en C. elegans. Luego, se comparó la supervivencia en relación con los gusanos de tratados de control de vector. Se observó una disminución significativa en la supervivencia de los gusanos de skn-1 precipitación en comparación a los gusanos de tratados de control de vectores (figura 4A). Estos datos además fue validados utilizando una cepa mutante de skn-1 , y su supervivencia fue comparada con la de los gusanos de tipo salvaje de N2. Se observó un fenotipo similar de la matanza como el mutante skn-1 , como se observa en la caída de skn-1 , demostrando que SKN-1 influido en la supervivencia de las lombrices en el grupo mitis (figura 4B).
A continuación, se determinó si el H2O2 producido por el grupo mitis causado localización de SKN-1B/C::GFP en los gusanos. Localización de SKN-1B/C::GFP se observó en los gusanos expuestos al tipo salvaje y las manchas de complemento y no en respuesta a la cepa mutante delspxB Δ de S. gordonii (figura 5A, B). Además, para determinar la activación de SKN-1, los componentes de la vía MAPK p38 fueron derribados. Se observó menor localización de SKN-1B/C::GFP en gusanos precipitación nsy-1, 1 sek, pmk-1 y skn-1 en comparación con los gusanos de tratados de control de vector. Los datos sugieren la p38 que MAPK se requiere para la activación de SKN-1 en respuesta a H2O2 producido por el grupo mitis (figura 5C, D).
Figura 1 : Diagrama de flujo que representa los pasos involucrados en la preparación de las pruebas de supervivencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diagrama de flujo que representa los pasos involucrados en la localización de SKN-1 durante la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : H2O2-mediada por matanza de C. elegans por estreptococos del grupo mitis. Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier de las larvas L4 expuestas al (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans y e. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans y e. coli OP50 en tus placas en presencia de 1.000 U de catalasa. (C) S. gordonii WT mutante despxB Δ y ΔspxB; spxB + complementan cepas en larvas L4 de N2. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) y e. coli OP50. Los datos son representativos de los experimentos repetidos dos o más veces, con n = 60 gusanos para cada condición. Análisis de rango de registro de Kaplan-Meier fue utilizado para comparar curvas de supervivencia y calcular la mediana de la supervivencia. Valores de P < 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Esta figura ha sido modificada y adaptado con permiso15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : SKN-1 es necesario para la supervivencia de los gusanos de S. gordonii. (A) supervivencia de los tratados de control de vectores y skn-1 precipitación gusanos expuestos a S. gordonii. (B) supervivencia de N2 y los gusanos mutantes skn-1(zu67) se alimentan de S. gordonii. Los datos son representativos de los experimentos repetidos dos o más veces, con n = 60 gusanos para cada condición. Análisis de rango de registro de Kaplan-Meier fue utilizado para comparar curvas de supervivencia y calcular la mediana de la supervivencia. Valores de P < 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Esta figura ha sido modificada y adaptado con permiso15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Estreptococos H2O2 mediada por activación de SKN-1 es dependiente de la vía de p38 MAPK. (A) imágenes representativas de la localización de SKN-1B/C::GFP en gusanos expuestos a la WT, mutantes despxB Δ y ΔspxB; spxB + complemento las cepas de S. gordonii. Closeups se muestran en las esquinas superior derecha de cada imagen. Barra de escala = 100 μm. (B) el grado de localización nuclear de SKN-1B/C::GFP y el porcentaje de lombrices en cada categoría de peso, mutantes despxB Δ y ΔspxB; spxB + complemento las cepas de S. gordonii. Significativamente en el mutante despxB Δ (p < 0.0001) en comparación con el peso y el ΔspxB; spxB + complemento cepas de S. gordoniise observaron bajos niveles de localización nuclear de SKN-1B/C::GFP. (C) imágenes representativas de la localización de SKN-1B/C::GFP en nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 precipitación y control de vectores tratan gusanos de S. gordonii. Closeups se muestran en las esquinas superior derecha de cada imagen. Barra de escala = 100 μm. (D) el grado de localización nuclear SKN-1B/C::GFP y el porcentaje de lombrices en cada categoría alimentan nsy-1, sek-1, pmk-1, caída de skn-1 y tratados de control de vectores gusanos de S. gordonii. Significativamente se observaron bajos niveles de localización nuclear de SKN-1B/C::GFP nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), pmk-1 (p < 0.0001), caíday skn-1 (p < 0.0001), en comparación con el vector control tratada de gusanos en S. gordonii. Mayor que 100 gusanos expuestos a cada cepa se reflejada, y el experimento fue repetido tres veces. Esta figura ha sido modificada y adaptado con permiso15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos descritos pueden ser utilizados para otras bacterias patógenas tales como Enterococcus faecium, que también produce H2O2 en anaerobios o microaerofílicos condiciones26. Por lo general, para más patógenos, lleva varios días a semanas para completar el análisis de supervivencia. Sin embargo, debido a la robusta producción de H2O2 por miembros del grupo mitis, estos ensayos podrían completarse dentro de 5-6 h en las condiciones descritas. Esto asegura la capacidad de la pantalla varios candidatos del gen implicados en la inmunidad del anfitrión y la respuesta de estrés oxidativo en un corto período de tiempo.
En este protocolo, H2O2 producida por la bacteria está en contacto directo con las células intestinales del gusano, a diferencia de otras fuentes exógenas de ROS que deben cruzar varias barreras. Esto asegura que el H2O2 se entrega a las células intestinales; por lo tanto, se observa una respuesta más robusta de la matanza en el gusano. Utilizando bacterias fluorescencia marcadas, se determinó que los gusanos deben estar expuestos a patógenos durante 30 minutos para la completa colonización del tracto intestinal15. Se recomienda utilizar menos de 1 semana de edad placas racha de cepas de estreptococos para garantizar su viabilidad y su capacidad para producir H2O2. Además, las cepas estreptocócicas deben cultivarse bajo condiciones microaerofílicas para la óptima producción de H2O2. Las larvas L4 o 1 día de edad adultos pueden utilizarse para este ensayo. Es fundamental que todos los gusanos utilizados en un experimento son la misma edad y sexo. Gusanos más jóvenes tienden a morir más lentamente en comparación con mayores hermafroditas. Animales de L4 se distinguen más fácilmente porque su vulva en desarrollo es visible en la mitad del cuerpo como una mancha clara que contrasta con el resto del cuerpo. También es importante que no OP50 de e. coli se transfieren a las placas sembradas de streptococcus. Contaminación de matar a placas con e. coli puede causar la atenuación o abolición de la muerte de los gusanos. Para evitar la contaminación, es necesario levantar los gusanos del césped de la e. coli . Cuando la puntuación de las pruebas de supervivencia, se recomienda observar la faringe bombeo, alimentación comportamiento de la cabeza y el movimiento del cuerpo. Para asegurar que el gusano está muerto, se recomienda a golpecito de la nariz, lado del cuerpo o la cola suavemente y observar cualquier movimiento.
Arni de alimentación y la supervivencia de las lombrices en el grupo mitis se combinó para identificar los candidatos que participan en la defensa contra el H2O2. Utilizando el gen skn-1 que codifica para un factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo, su requisito para la supervivencia de la lombriz en respuesta a H2O2 es demostrado aquí. Por lo tanto, este análisis pueden ser adaptado a la pantalla de varios genes e identificar a posibles candidatos para la inmunidad y la respuesta de estrés oxidativo. Arni de alimentación de los gusanos se consigue añadiendo edad sincronizado las larvas L1 a ARNi expresando céspedes e. coli . Durante el protocolo de sincronización de gusano, es esencial monitorear la lisis de las cutículas de gusano en presencia de cloro e hidróxido de sodio. La cutícula de las larvas y adultos se disuelve continuamente, mientras que los embriones están protegidos parcialmente por la gruesa cáscara de huevo. Sin embargo, incubación prolongada en presencia de la mezcla de hidróxido de sodio guían puede causar los embriones destinados a morir. Por lo tanto, es importante observar el tubo que contiene a los gusanos debajo de un microscopio de disección periódicamente durante el blanqueamiento. Otro paso a considerar en el protocolo de sincronización es el mantenimiento de larvas L1 arrestados. Las larvas detenidas puedan mantenerse en el tubo de los rotadores durante 5 días a temperatura ambiente. Se recomienda utilizar las larvas para la alimentación de ARNi en 1 a 2 días después de la eclosión. Mantenimiento prolongado en M9W puede resultar en la formación de la etapa de dauer.
Por último, un gusano transgénico que expresan SKN-1 fusionada a GFP fue utilizado para supervisar la activación de la respuesta de estrés oxidativo en presencia del grupo mitis. Arni demuestran que los componentes de la p38 MAPK son necesarios para la localización de SKN-1B/C::GFP a los núcleos de las células intestinales. Es importante usar las etapas L3 o L4 de esta cepa para observar la localización de SKN-1B/C::GFP, como localización de SKN-1 tiende a disminuir en la fase adulta. Para observar mejor la localización de SKN-1B/C::GFP, se recomienda superponer las imágenes obtenidas usando la configuración del filtro DAPI y FITC. Autofluorescencia generados por las lipofuscins ayudan a proporcionar contraste para la observación de SKN-1 localización en el gusano. Sin embargo, también se ha demostrado que la señal de reporteros GFP débilmente expresadas es enmascarada por autofluorescencia emitida por diversas fuentes en el intestino del gusano. Autofluorescencia se ha demostrado que aumenta con la edad y es mayor en el intestino y el útero de la C. elegans27. Para superar este problema, un estudio reciente utilizó una configuración de filtro de triple banda GFP para monitorear la localización de SKN-1B/C::GFP en C. elegans28. Esta configuración separa la señal GFP de autofluoresence, mostrando la GFP y autofluoresence en los canales verdes y amarillos, respectivamente.
C. elegans es utilizado en este protocolo para estudiar interacciones huésped-patógeno y determinar cómo H2O2 producido por el grupo mitis provoca patogenicidad. Lo más importante, mediante este modelo, los efectos de H2O2 en endoplasmic reticular estrés, daño mitocondrial, mitofagia, autofagia y estrés oxidativo pueden ser estudiados. Además, se pueden identificar mecanismos por los cuales H2O2 actúa como un factor de virulencia para provocar respuestas inmunitarias interrumpiendo los procesos básicos de la célula. Por lo tanto, este gusano es reconocido como un potente modelo de sistema para descubrir nuevas perspectivas en las interacciones huésped-patógeno.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (la Universidad de Texas, escuela de Odontología), Dr. Richard Lamont (Universidad de Louisville, Facultad de Odontología) y Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) laboratorio y cepas clínicas de los estreptococos del grupo mitis. También agradecemos a Dr. Keith Blackwell (Departamento de genética, escuela de medicina de Harvard) para las cepas de C. elegans . Finalmente, agradecemos a su laboratorio (la Universidad de Texas, escuela de medicina de McGovern) y Dr. Danielle Garsin para proporcionar reactivos y cepas de gusano para realizar el estudio. Algunas cepas de gusano fueron proporcionados por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
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