Summary
Nematoden Caenorhabditis elegans är en utmärkt modell att dissekera värd-patogen interaktioner. Beskrivs här är ett protokoll att infektera masken med medlemmar av de mitis gruppen streptokocker och avgöra aktivering av oxidativ stress svar mot H2O2 produceras av denna grupp av organismer.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), en frilevande nematoder, har vuxit fram som en attraktiv modell att studera värd-patogen interaktioner. Presenterade protokollet använder denna modell för att avgöra den patogenicitet som orsakas av de mitis gruppen streptokocker via produktionen av H2O2. De mitis gruppen streptokocker är en framväxande hot som orsakar många sjukdomar såsom bakteriemi, endokardit och orbital cellulit. Beskrivs här produceras ett protokoll att avgöra överlevnaden av dessa maskar som svar på H2O2 av denna grupp av patogener. Med hjälp av gen skn-1 kodning för en oxidativ stress svar transkriptionsfaktor, visas det att denna modell är viktigt för att identifiera värd gener som är viktiga mot streptokocker infektion. Dessutom är det visat att aktiveringen av oxidativ stress svar kan övervakas i närvaro av dessa patogener med hjälp av en transgen reporter mask stam, som smälts SKN-1 på grönt fluorescerande protein (GFP). Dessa testmetoder ge möjlighet att studera oxidativ stress svar H2O2 härrör från en biologisk källa i motsats till exogent ytterligare reaktivt syre arter (ROS) källor.
Introduction
Mitis gruppen streptokocker är mänskliga förknippas av orofaryngeal hålighet1. Dessa organismer kan dock fly denna nisch och orsaka en mängd invasiva sjukdomar2. Infektioner orsakade av dessa mikroorganismer inkluderar bakteriemi, endokardit och orbital cellulit2,3,4,5,6. Dessutom är de framväxande som smittämnen blodinfektioner i nedsatt immunförsvar, neutropen och cancerpatienter som genomgått kemoterapi5,7,8,9 .
Mekanismerna underliggande mitis gruppen patogenes är dunkel, eftersom några virulensfaktorer har identifierats. Mitis gruppen är kända för att producera H2O2, vilket har visat sig spela en viktig roll i muntliga mikrobiella samhällen10. Mer nyligen, flera studier har belyst en roll för H2O2 som ett cellgift som inducerar epitelial cell död11,12. S. lunginflammation, som tillhör denna grupp, har visat sig producera höga nivåer av H2O2 som inducerar DNA-skador och apoptos i alveolära celler13. Använder en akut lunginflammation djurmodell, visat samma forskare att produktionen av H2O2 av bakterier ger en virulens fördel. Studier på pneumokock meningit har också visat att patogenen-derived H2O2 verkar synergistiskt med pneumolysin att utlösa neuronala cell död14. Dessa observationer tydligt fastställa att H2O2 produceras av denna grupp av bakterier är viktigt för deras patogenicitet.
Intressant, har det också visat att medlemmar av mitis S. mitis och S. oralis orsaka döden av den nematoder C. elegans via produktionen av H2O215,16. Detta frilevande nematoder har använts som en enkel, genetiskt lätthanterlig modell för att studera många biologiska processer. Mer nyligen, masken har vuxit fram som en modell för att studera värd-patogen interaktioner17,18. Flera studier har dessutom betonat vikten av att studera oxidativ stress använder denna organism19,20,21. Dess korta livslängd, förmåga att knockdown gener av intresse av RNAi och användning av grönt fluorescerande protein (GFP)-smält reportrar att övervaka genuttryck är några av de attribut som gör det en attraktiv modellsystem. De vägar som reglerar oxidativ stress och medfödd immunitet i masken är viktigare, starkt konservativa med däggdjur20,22.
I detta protokoll, är det visat hur C. elegans att belysa den patogenicitet som orsakas av streptokocker-derived H2O2. En modifierad överlevnad analys visas, och medlemmar i gruppen mitis kunna döda maskar snabbt via produktionen av H2O2. Med hjälp av medlemmar i gruppen mitis, en ihållande biologisk källa av reaktiva syreradikaler föreskrivs (ROS), i motsats till kemiska källor att inducerar oxidativ stress i maskar. Bakterierna är dessutom kunna kolonisera maskar snabbt, vilket ger H2O2 riktas direkt till intestinala celler (jämfört med andra källor som måste korsa flera hinder). Analysen är validerad antingen 1) genom att fastställa överlevnad skn-1 mutant stam eller (2) genom att knacka ner skn-1 med hjälp av RNAi i maskar i förhållande till N2 vildtyp och vector kontroll behandlas maskar. SKN-1 är en viktig transkriptionsfaktor som styr den oxidativa stressreaktion i C. elegans23,24,25. Utöver överlevnad analyser används en mask stam uttrycker en SKN-1B/C::GFP transgena reporter att övervaka aktivering av den oxidativa stress svar via produktionen av H2O2 av gruppen mitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av THY (Todd-Hewitt jästextrakt) agarplattor
- För 1 L av media, tillsätt 30 g Todd-Hewitt pulver, 2 g jästextrakt och 20 g agar till en 2 L Erlenmeyer-kolv. Lägg till 970 mL avjoniserat vatten till innehållet i kolven och inkluderar en uppståndelse bar. Autoklav media vid en temperatur på 121 ° C och tryck på 15 lb/tum2 för 30 min. Därefter ställa in media på en uppståndelse tallrik och tillåta för kylning med skonsam omrörning.
- Häll media i lämplig storlek sterila petriskålar (100 x 15 mm rätter för tillväxt och underhåll av bakterier, 35 x 10 mm rätter för att döda analyser) under ett laminärt flöde. Låt media torka i 2 h under laminärt huven. Plattorna kan därefter lagras vid 4 ° C i 1 månad.
2. beredning av nematoder odlingsmedium (NGM) och RNAi utfodring plattor (NGM RNAi)
- Använder en uppståndelse bar, lös 2,5 g pepton och 3 g NaCl i 970 mL avjoniserat vatten i en 2 L Erlenmeyer-kolv. Tillsätt 20 g agar till media. Autoklav media vid en temperatur på 121 ° C och tryck på 15 lb/tum2 för 30 min. Ställ in media på en uppståndelse tallrik och låt för kylning med skonsam omrörning.
- Lägg till följande lösningar till media för beredning av NGM plattor: 25 mL 1 M kalium fosfatbuffert (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL i 95% etanol) kolesterol , 1 mL (10% v/w i etanol) nystatin, och 1 mL 25 mg/mL streptomycin.
- Lägg till följande lösningar till media för beredning av NGM RNAi utfodring plattor: 25 mL 1 M kalium fosfatbuffert (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL i 95% etanol) kolesterol , 1 mL (10% v/w i etanol) nystatin, 1 mL 50 mg/mL carbenicillin och 1 mL IM IPTG.
- Häll media i 60 mm x 15 mm steril petriskålar under laminärt flöde. Låt media torka i 2 h under laminärt huven. Plattorna kan därefter lagras vid 4 ° C i 1 månad.
3. underhåll av C. elegans
- Utsäde NGM plattorna av Tubkikare 50 µL av övernattning växt E. coli OP50 i mitten av plattorna. E. coli kulturen är förberett tidigare i Luria-Bertani (LB) media och lagras vid 4 ° C i flera månader. Täck plattorna och låt dem torka i 24 h under en laminär huv och därefter förvara plattorna i polystyren behållare.
- I dissekera Mikroskop, plocka upp 10 till 12 dräktig vuxna med hjälp av en steril mask plocka och överföra maskar till en E. coli OP50 seedade NGM plattan. Inkubera plattorna vid 20 ° C över natten.
- Nästa dag, ta bort de vuxna som med hjälp av en steril mask plocka och låta embryona som utvecklas till L4 larver vid 20 ° C (~2.5 dagar).
4. beredning av synkron befolkningen av maskar
-
Tvätta dräktig vuxna från två till fyra NGM plåtar med M9W och samla dem i en 15 mL koniska rör.
- Att förbereda M9W: kombinera 3 g NaCl, 6 g av Na2HPO4och 3 g KH2PO4 och lös i en slutlig volym av 1 L avjoniserat vatten. Autoklav lösningen och tillsätt 1 mL 1 M MgSO4.
- Röret på 450 x g för 1 min och sedan Dekantera supernatanten samtidigt att masken pelleten förblir intakt.
- Lägga till 400 µL av 8,25% natriumhypoklorit (hushållsblekmedel) och 100 µL av 5 N NaOH att förbereda mask lysis lösningen. Lägga till lysis lösningen i masken pelleten och blanda innehållet genom att snärta röret tills 70% av de vuxna maskarna är lyserat. Regelbundet följa innehållet i röret i dissekera Mikroskop för att säkerställa att det finns ingen overbleaching av äggen.
- Späd blekmedel blandningen genom att tillsätta 10 mL M9W innehållet i koniska röret.
- Snurra röret vid 450 x g i 1 min. Dekantera supernatanten, tillsätt 10 mL av M9W sedan.
- Upprepa steg 4,5 två gånger.
- Återsuspendera pelleten resulterande ägg i 3-5 mL M9W. Placera röret på en tube rotator. Låt rören för att rotera med en hastighet av 18 rpm vid rumstemperatur (RT) över natten.
- Nästa dag, snurra röret på 450 x g för 1 min till pellet L1 larver. Ta bort de flesta av M9W genom aspiration, lämnar bakom ~ 250 µL vätska i röret. Återsuspendera L1 larver och plats tre 5 µL droppar av masken upphängning på en petriskål locket, sedan uppskattning antalet maskar per µL med dissekera Mikroskop.
5. induktion av RNAi i Worms
- Med hjälp av en steril ögla eller plocka, strimma ut önskad stammar av RNAi-innehållande E. coli från fryst lager (Ahringer och Vidal bibliotek) på 100 x 15 mm LB agarplattor som innehåller 50 µg/mL carbenicillin och 15 µg/mL tetracyklin. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h.
- Plocka och Inokulera en isolerad koloni från den önskade RNAi-stammen i steril 15 mL koniska rör innehållande 2 mL LB kompletteras med 50 µg/mL carbenicillin. Inkubera rören vid 37 ° C i 16 h i orbitalskak på 150 rpm.
- Nästa dag, sprida 150 µL av övernattning odlade kultur på 65 x 15 mm NGM RNAi utfodring plattor med hjälp av en steril spridare. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h.
- Låt plattorna svalna till RT efter inkubation vid 37 ° C. Lägga till en lämplig volym av M9W innehållande ~ 200 L1 larver (som erhålls från den synkrona befolkningen av maskar steg) till den E. coli seedade NGM RNAi utfodring plattor. Inkubera plattorna vid 20 ° C tills larverna når L4 scenen (~2.5 dagar).
6. beredning av Mitis gruppen streptokocker för infektion
- Strimma ut önskad stammar av streptokocker på 100 mm x 15 mm THY agar (om plåtarna förvarades vid 4 ° C, före Värm plåtarna till 37 ° C innan strimmor respektive stammar), sedan Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten (~ 18 h) i en ljus burk som ger en microaerofil sv sättningar för tillväxten av de streptokocker (strimmiga plattorna kan lagras i en vecka vid 4 ° C).
- För att propagera kliniska isolat av streptokocker, Använd tryptic soy blodagar. Inkubera plattorna vid 37 ° C i en ljus-burk över natten (~ 18 h).
- Nästa dag, ta bort plattorna från candle burken och plocka isolerade kolonier med hjälp av en steril ögla. Inokulera 15 mL steril koniska rör innehållande 2 mL THY buljong. För att propagera kliniska isolat av streptokocker, komplettera THY buljong med 5% v/v i får blod. Stäng locken tätt och inkubera rören vid 37 ° C under statiska förhållanden.
7. överlevnad analyser
Obs: De olika stegen i denna analys avbildas i figur 1. För att påvisa att H2O2 härrör av mitis grupp är ansvarig för dödandet av masken, komplettera media med katalas eller en mutant stam ΔspxB och komplement stam ΔspxB; spxB + av S. gordonii kan användas. SpxB kodar för en Pyruvat oxidas, som ansvarar för produktionen av H2O2 i gruppen mitis.
- Pre värma 35 x 10 mm THY plattor till 37 ° C. Tillsätt 80 µL av övernattning odlas kulturer av önskad stammar av streptokocker och sprida bakterier helt över agar ytan med hjälp av en steril spridare. Inkubera plattorna vid 37 ° C i en ljus-burk över natten (~ 18 h). Som en kontroll, utsäde två 35 mm x 10 mm NGM plattor med 80 µL av övernattning odlas kulturer av E. coli OP50. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- För att bekräfta att den H2O2 produceras av gruppen mitis är ansvarig för dödandet av maskar, tillsätt 50 µL innehållande 1000 enheter av katalas c på THY plattan. Sprida katalas lösningen med hjälp av en steril spridare och låta plattorna torka i laminärt flöde för 30 min. utsäde plattorna därefter med de respektiva streptococcus stammarna som beskrivs i steg 7,1.
- Nästa dag, ta bort plattorna från candle burken och låt plattorna svalna till RT för 10-15 min. med hjälp av en steril mask plocka, överföring 30 L4 larver från NGM eller NGM RNAi utfodring plattor till streptococcus seedade THY plattor. Använd två seedade THY plattor med sammanlagt 60 maskar per stam av streptokocker. Inkubera plattorna vid 25 ° C.
- Med dissekera Mikroskop räkna antalet levande och döda L4 larver på varje tallrik vid flera tidpunkter. Inledningsvis, poäng maskar som död eller levande varje 30 min. Därefter, när maskar börjar snabbt dö, poäng dem med 15 min mellanrum. Använd sterila mask plocka försiktigt prod maskar och avgöra om de är döda eller levande. En mask är ansedd döda om ingen rörelse att bemöta de petade.
- Analysen kommer att ta 5-6 h att slutföra. Upprepa experimentet två gånger. Efter genomförandet av analysen, pool data från de två plattorna. Mata in data i varje grupp, jämföra överlevnad kurvorna och utföra Kaplan-Meier överlevnadsanalys med hjälp av statistisk programvara.
8. beredning av agaros Pads för mikroskopi
- Lös upp 2% w/v i agaros i avjoniserat vatten genom upphettning av lösningen i en mikrovågsugn. En volym på 5 mL lösning är tillräcklig för att förbereda 20 bilder.
- Sticka lab band på längden längs två glasskivor. Det avgör tjockleken på agaros kuddar. Placera en ren glasskiva mellan de två tejpade bilderna.
- Plats 100 µL av smälta agarosen på mitten av den rena bilden. Placera omedelbart en annan rent glas ovanpå smält Agarens och tryck försiktigt ner för att göra en pad. Tillåta Agarens att stelna och sedan tar bort den översta bilden. Agaros pad är klar för användning.
9. observation av SKN-1 lokalisering i svar på Streptococcus infektion
Obs: De olika stegen i denna analys avbildas i figur 2. Lokalisering av SKN-1 bestämdes använder SKN-1B/C::GFP transgena mask stammen. För att påvisa lokalisering av SKN-1 på grund av produktion av H2O2 av gruppen mitis vildtyp (WT), ΔspxB, och den kompletterar stam ΔspxB; spxB + av S. gordonii användes. Dessutom användes de transgena reporter stam SKN-1B/C::GFP och RNAi inblandning teknik att demonstrera att komponenter av p38 MAPK väg reglera localizationen av SKN-1.
- Pre värma 35 x 10 mm THY plattor till 37 ° C. Tillsätt 80 µL av övernattning odlas kulturer av de önska stammarna av streptococcus och sprida bakterier helt över agar ytan med hjälp av en steril spridare. Inkubera plattorna vid 37 ° C i en ljus-burk över natten (~ 18 h). Som en kontroll, utsäde tre 35 mm x 10 mm NGM plattor med 80 µL av övernattning odlas kulturer av E. coli OP50. Inkubera plattorna vid 37 ° C för ~ 18 h.
- Nästa dag, ta bort plattor från candle burken och låt tallrikar svalna till RT för 10-15 min. tvätta L4 larver med M9W från NGM och NGM RNAi utfodring plattor. Samla maskar i 15 mL koniska rör.
- Snurra rören på 450 x g för 1 min. Dekantera supernatanten och tillsätt 10 mL av M9W.
- Upprepa steget 9,3 tre gånger.
- Återsuspendera maskar i ~ 250 µL M9W och plats tre 5 µL droppar av masken upphängning på ren petriskål lock och uppskatta antalet maskar per µL med dissekera Mikroskop.
- Lägga till ~ 100 L4 larver till varje THY streptococcus seedade och NGM E. coli seedade plattor. Använd tre plattor per stam av bakterier. Inkubera plattorna för 2 till 3 h vid 25 ° C.
- Därefter bort plattorna från inkubatorn, tvätta dem med M9W och samla maskar i 15 mL koniska rör.
- Tvätta maskar 3 x som beskrivs i steg 9,3.
- Ta bort de flesta av M9W genom aspiration och tillsätt 500 µL M9W innehållande 2 mM natrium natriumazid eller 2 mM tetramisole hydrochloride i masken pelleten. Detta kommer att söva maskar, säkerställa att ingen rörelse uppstår när avbildas under mikroskopet.
Varning: Använd personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering natriumazid. Förbereda natriumazid lösningen under en kemisk huva. - Inkubera mask pellets på RT i 15 min. Sedan, spot 15 µL av masken upphängning på en förberedd agaros pad. Placera försiktigt en nr 1,5 täckglas över agaros pad som innehåller sövda maskar.
- Med fluorescerande Mikroskop visualisera localizationen av SKN-1 utnyttja FITC och DAPI filter. Bild maskar på 10 x och 20 x förstoring.
- Poäng maskar på grundval av lokalisering av SKN-1. Ingen cellkärnelokalisering, lokalisering av SKN-1B/C::GFP i främre eller bakre av masken och cellkärnelokalisering av SKN-1B/C::GFP i alla intestinala celler kategoriseras som låg, medium och höga nivåer av lokalisering, respektive.
- Efter scoring de fluorescerande micrographs, fastställa de statistiska skillnaderna av chi-kvadrat och Fishers exakta test med hjälp av statistisk programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medlemmar av mitis grupp S. mitis, S. oralis, och S. gordonii snabbt dödade maskar, i motsats till S. mutans, S. salivarius, och icke-patogena E. coli OP50 (figur 3A). Medianöverlevnadstiden för S. mitis, S. oralis, och S. gordonii var 300 min, 300 min, 345 min, respektive. För att avgöra om dödandet var medieras av H2O2, kompletterades katalas till THY agar. Dödandet av maskar avskaffades i närvaro av katalas (figur 3B). För att ytterligare bekräfta huruvida streptokocker härledda H2O2 medierad dödandet av maskar, överlevnad på ΔspxB mutant stam, WT stam och komplement stam ΔspxB; spxB + av S. gordonii analyserades. Döden av maskar observerades inte på den ΔspxB mutant stam jämfört med vildtyp och komplettera stammar (figur 3C). Dessa data tyder på att H2O2 produceras av gruppen mitis förmedlar dödandet av maskar. Vi observerade även liknande dödande kinetik när maskar utsattes för kliniska isolat av de mitis gruppen streptokocker erhållits från blodet av cancerpatienter (figur 3D). Baserat på data, bedömdes patogeniteten orsakas av H2O2 produceras av de mitis gruppen streptokocker.
För att identifiera värd gener som är viktiga mot streptokockinfektioner, skn-1 slogs ned, som kodar för oxidativ stress svar transkription faktorn i C. elegans. Sedan jämfördes överlevnad i förhållande till vector kontroll behandlas maskar. En signifikant minskning av skn-1 knockdown maskar överlevnad observerades jämfört med vector kontroll behandlas maskar (figur 4A). Denna data validerades ytterligare med hjälp av en skn-1 mutant stam och dess överlevnad jämfördes med N2 vildtyp maskar. Vi observerade en liknande dödande fenotyp som skn-1 mutant, som sett med den skn-1 knockdown, visar att SKN-1 påverkat överlevnaden av maskar på gruppen mitis (figur 4B).
Nästa, fastställdes det huruvida den H2O2 produceras av gruppen mitis orsakade lokalisering av SKN-1B/C::GFP i maskar. Lokalisering av SKN-1B/C::GFP observerades i worms utsätts för vildtyp och komplement fläckar och inte som svar på den ΔspxB mutant stammen av S. gordonii (figur 5A, B). Dessutom för att avgöra aktivering av SKN-1, slogs komponenter till p38 MAPK utbildningsavsnitt ut. Minskad lokalisering av SKN-1B/C::GFP i nsy-1, sek-1, pmk-1, och skn-1 knockdown maskar i förhållande till vector kontroll behandlas maskar observerades. Data tyder den p38 MAPK krävs för aktivering av SKN-1 som svar på H2O2 produceras av gruppen mitis (figur 5C, D).
Figur 1 : Flödesschema som skildrar de olika stegen i förberedelserna av överlevnad analyserna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Flödesschema som skildrar de olika stegen i lokalisering av SKN-1 under infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : H2O2-medierad avlivning av C. elegans av mitis gruppen streptokocker. Kaplan-Meier överlevnadskurvor för L4 larverna utsätts för (A) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, och E. coli OP50. (B) S. gordonii, S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans, och E. coli OP50 på dina tallrikar i närvaro av 1.000 U av katalas. (C) S. gordonii WT, ΔspxB mutant och ΔspxB; spxB + komplettera stammar på N2 L4 larver. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) och E. coli OP50. Data är representativa för experiment upprepas två eller fler gånger, med n = 60 maskar för varje villkor. Kaplan-Meier log rank analys användes för att jämföra överlevnadskurvor och beräkna medianvärdet för överlevnad. P-värden < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Denna siffra har modifierats och anpassats med tillåtelse15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : SKN-1 krävs för överlevnad av maskar på S. gordonii. Vector kontroll behandlas och skn-1 knockdown maskar utsätts för S. gordonii(A) överlevnad. (B) överlevnad av N2 och skn-1(zu67) mutant maskar utfodras på S. gordonii. Data är representativa för experiment upprepas två eller fler gånger, med n = 60 maskar för varje villkor. Kaplan-Meier log rank analys användes för att jämföra överlevnadskurvor och beräkna medianvärdet för överlevnad. P-värden < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Denna siffra har modifierats och anpassats med tillåtelse15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Streptokocker H2O2 medierad aktivering av SKN-1 är beroende av det p38 MAPK utbildningsavsnittet. (A) representativa bilder av localizationen av SKN-1B/C::GFP i worms utsatt till WT, ΔspxB mutant och ΔspxB; spxB + komplement stammar av S. gordonii. Closeups visas i övre högra hörnen av varje bild. Skalstapeln = 100 µm. (B) graden av cellkärnelokalisering av SKN-1B/C::GFP och andelen maskar i varje kategori som matas på WT, ΔspxB mutant och ΔspxB; spxB + komplement stammar av S. gordonii. Låga nivåer av cellkärnelokalisering av SKN-1B/C::GFP observerades signifikant i ΔspxB mutant (p < 0,0001) jämfört med WT och ΔspxB; spxB + komplement stammar av S. gordonii. (C) representativa bilder av localizationen av SKN-1B/C::GFP i nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown och vector kontroll behandlas maskar på S. gordonii. Closeups visas i övre högra hörnen av varje bild. Skalstapeln = 100 µm. (D) graden av SKN-1B/C::GFP cellkärnelokalisering och andelen maskar i varje kategori matas på nsy-1 sek-1, pmk-1, skn-1 knockdown och vector kontroll behandlas maskar på S. gordonii. Avsevärt observerades låga nivåer av cellkärnelokalisering av SKN-1B/C::GFP i nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0,001), pmk-1 (p < 0,0001),och skn-1 knockdown (p < 0,0001) jämfört med vektorn kontroll behandlas maskar på S. gordonii. Större än 100 maskar utsätts för varje stam var avbildade, och experimentet upprepades tre gånger. Denna siffra har modifierats och anpassats med tillåtelse15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna kan användas för andra patogena bakterier såsom Enterococcus faecium, som också tillverkar H2O2 odlats under anaeroba eller namnet villkor26. Typiskt, för mest sjukdomsframkallande organismer, det tar flera dagar till veckor att slutföra överlevnad analyserna. Dock på grund av den robusta produktionen av H2O2 av medlemmar i gruppen mitis, kunde dessa testmetoder slutföras inom 5-6 h enligt villkoren. Detta säkerställer förmågan att skärmen flera genen kandidater deltar i värd immunitet och oxidativ stress svar under en kort tidsperiod.
I detta protokoll är H2O2 produceras av bakterier i direkt kontakt med de intestinala cellerna av masken, i motsats till andra exogena ROS-källor som måste passera flera hinder. Detta säkerställer att den H2O2 levereras till de intestinala cellerna; Därför är en mer robust dödande svar observerades i masken. Med fluorescently märkta bakterier, bestämdes det att maskarna måste utsättas för patogener i 30 min för komplett kolonisering av tarmkanalen15. Det är klokt att använda mindre än 1 vecka gammal strimma plåtar av streptokocker stammar för att säkerställa deras bärkraft och förmåga att producera H2O2. Dessutom de streptokocker stammarna måste odlas under namnet villkor för optimal produktion av H2O2. L4 larver eller 1 dag gammal vuxna kan användas för denna analys. Det är viktigt att alla maskar som används i ett experiment är samma ålder och kön. Yngre maskar tenderar att dö långsamt jämfört med äldre hermafroditer. L4 djur är mer lätt urskiljas eftersom deras framkallande vulva är synliga på mitten av kroppen som en tydlig lapp som kontrasterar med resten av kroppen. Det är också viktigt att ingen E. coli OP50 överförs till streptococcus seedade plattorna. Kontaminering av döda plattor med E. coli kan orsaka den dämpning eller upphävande av dödandet av maskar. För att undvika kontaminering, är det nödvändigt att plocka maskar från E. coli gräsmattan. När scoring överlevnad analyserna, är det klokt att iaktta den faryngeal pumpning, foraging beteende av huvudet och kroppsrörelse. För att säkerställa att masken är död, rekommenderas det att försiktigt prod näsan, sida av kroppen, eller svans och observera någon rörelse.
RNAi utfodring och överlevnaden av maskar på gruppen mitis kombinerades för att identifiera kandidater som deltar i försvaret mot H2O2. Använda gen skn-1 som kodar för en oxidativ stress svar transkriptionsfaktor, dess krav för överlevnad av masken som svar på H2O2 är visat här. Denna analys kan därför anpassas till skärmen för flera gener och identifiera potentiella kandidater krävs för oxidativ stress svar och immunitet. RNAi utfodring av maskar uppnås genom att lägga till ålder synkroniseras L1 larver till de RNAi uttrycker E. coli gräsmattor. Under masken synkroniseringen protokollet är det viktigt att övervaka Lys av masken nagelbanden i närvaro av blekmedel och natriumhydroxid. Nagelbanden vuxna och larver kommer ständigt lös, medan embryona skyddas delvis av det tjocka Äggskalet. Långvarig inkubation i närvaro av Bleda natriumhydroxid mixen kan dock orsaka embryon dö. Det är därför viktigt att iaktta röret som innehåller maskar i dissekera Mikroskop periodvis under blekning. Ett annat steg att överväga i synkroniseringen protokollet är underhåll av arresterade L1 larver. Arresterade larverna kan upprätthållas på tube rotator för 5 dagar vid rumstemperatur. Det rekommenderas att använda larverna RNAi foder inom 1 till 2 dagar efter kläckningen. Långvarig underhåll i M9W kan resultera i bildandet av dauer scenen.
Slutligen användes en transgena mask uttrycker SKN-1 smält till GFP för att övervaka aktivering av oxidativ stress svar i närvaro av gruppen mitis. Det framgår av RNAi att komponenterna i den p38 MAPK krävs för lokalisering av SKN-1B/C::GFP till kärnor av intestinala celler. Det är viktigt att använda L3 eller L4 stadier av denna stam för att iaktta lokalisering av SKN-1B/C::GFP, som lokalisering av SKN-1 tenderar att minska i vuxen scenen. För att bättre följa localizationen av SKN-1B/C::GFP, är det klokt att överlappa erhållna bilderna med FITC och DAPI filterinställningarna. Autofluorescens genereras av lipofuscins att ge kontrast för observation av SKN-1 lokalisering i masken. Det har emellertid också visat att signalen från svagt uttryckt GFP reportrar maskeras av autofluorescens som avges från olika källor i tarmen av masken. Autofluorescens har visat sig öka med åldern och är störst i tarmen och livmodern i C. elegans27. För att lösa detta problem, utnyttjat en studie som nyligen en trippelband GFP filtret setup för att övervaka localizationen av SKN-1B/C::GFP i C. elegans28. Denna setup separerar GFP signalen från autofluoresence, visning av god Jordbrukarsed och autofluoresence i de gröna och gula kanalerna, respektive.
C. elegans används i detta protokoll att studera värd-patogen interaktioner och fastställa hur H2O2 produceras av gruppen mitis orsakar patogenicitet. Viktigare, genom att använda denna modell, kan effekterna av H2O2 på endoplasmic retikulära stress, mitokondriell skada, mitophagy, autofagi och oxidativ stress studeras. Dessutom kan mekanismer genom vilka H2O2 fungerar som en virulens faktor att framkalla immunsvar genom att störa kärnprocesser i cellen identifieras. Därför är denna mask erkänd som en kraftfull modellsystem för att upptäcka nya insikter i värd-patogen interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (The University of Texas, skolan för odontologi), Dr Richard Lamont (University of Louisville, skolan för odontologi) och Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) för att tillhandahålla laboratorie- och kliniska stammar av mitis grupp streptokocker. Vi tackar också Dr Keith Blackwell (Institutionen för genetik, Harvard Medical School) i C. elegans -stammar. Slutligen, vi tackar Dr. Danielle Garsin och hennes lab (The University of Texas, McGovern Medical School) för att tillhandahålla reagens och mask stammar att genomföra studien. Vissa mask stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
