Summary
酶活性的热稳定性很容易用等温滴定量热法 (ITC) 测量。目前使用的大多数蛋白质稳定性检测测量蛋白质展开, 但没有提供有关酶活性的信息。通过国贸中心, 可以直接测定酶修饰对酶活性稳定性的影响。
Abstract
本研究展示了一种用等温滴定量法 (ITC) 测量酶活性稳定性的新方法。将底物溶液注入酶溶液后观察到的峰值热率与酶活性相关。随着时间的推移, 多次将底物注射到相同的酶溶液中, 表明酶活性的丧失。该检测是自主的, 只需要很少的人员时间, 适用于大多数培养基和酶。
Introduction
酶是能够催化各种有机反应的蛋白质。大多数酶在接近中性 ph 值的水溶液中发挥作用, 从而避免使用苛刻的溶剂。由于酶催化反应具有很高的选择性, 因此其副产品产生的副产品比酸和碱等非选择性催化剂少.这在食品制造中尤其重要, 因为在食品制造中, 所有的化学反应都必须进行, 这样最终产品对人类消费是安全的。目前, 酶被用于生产高果糖玉米糖浆2, 奶酪3, 啤酒4, 无乳糖牛奶5, 和其他重要的食品。虽然本文主要研究酶在食品工业中的应用, 但酶还有许多其他用途, 包括在绿色化学和药物合成方面。
酶的效用受到酶活性稳定性的限制, 而酶活性的稳定性取决于酶的三维结构的维持。酶结构可以通过修饰来稳定, 如聚乙二醇化6, 固定化上的固体支持7, 基因修饰8, 和配方。目前, 酶的稳定性通常是通过差示扫描量热法 (DSC) 和端点酶活性检测9来测量的。DSC 测量酶展开的温度;温度越高, 结构越稳定。然而, 活性的丧失往往发生在低于所需的温度, 以展开酶或域内的酶10。因此, DSC 不足以确定酶修饰是否能提高酶活性的稳定性。端点酶检测通常需要大量时间, 需要多个样品, 并且通常涉及不适用于高颜色或不透明溶液或悬浮液的耦合比色反应。
本研究展示了一种用等温滴定量法 (ITC) 直接测定酶活性稳定性的方法。国贸中心测量反应过程中释放或吸收的热量率。由于几乎所有反应都会产生或吸收热量, ITC 可用于大多数酶催化反应, 包括没有耦合反应或发生在牛奶等不透明介质中的反应。几十年来, 国贸中心一直被用来测量多种反应的化学动力学参数, 但这里介绍的协议侧重于使用 itc 来测量酶催化反应的峰值热率, 并表明酶活性是线性的与峰值热速率相关。ITC 对峰值热率的测量大多是自主的, 只需很少的人员时间来设置和分析。
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Protocol
1. 样品的制备
-
ph 值4.6 下 0.1 M 醋酸钠缓冲液 1, 000 毫升
- 测量800毫升的蒸馏水在一个1000毫升的刻度烧杯。
- 称量8.2 克无水醋酸钠, 并将其添加到烧杯中。
- 将烧杯放在搅拌板上, 将搅拌棒放入烧杯中, 打开搅拌板搅拌至完全溶解。
- 当无水醋酸钠完全溶解时, 用校准的 pH 计测量溶液的 pH 值。
- 相应地添加 1 M HCl 或 NaOH, 以获得所需的 pH 值4.6。
- 加入蒸馏水, 直到总体积为 1, 000 毫升。
- 在室温下存放, 直至使用。
-
酶溶液
- 在 10-30 Mg/ml 范围内准备10毫升的酶溶液, 首先在15毫升刻度缸中测量 0.1 m 醋酸钠缓冲液 pH 4.6 的8毫升。
- 将缓冲液加入使用酶的15毫升锥形管中, 用力摇晃, 直到酶溶解。
- 添加更多的缓冲区解决方案, 直到总体积为10毫升。
- 将酶溶液存放在 4°c, 直至使用。
-
基板解决方案
- 要在 300-600 mM 范围内制备基板溶液, 请计算所需的基板量 (以克为 1), 以获得所需的浓度。
- 称量基板, 放入100毫升玻璃烧杯
- 使用25毫升刻度缸测量缓冲液的20毫升, 然后将其添加到玻璃烧杯上。
- 将烧杯放在搅拌板上, 并将磁棒放入烧杯中。打开暖气, 相应地调整搅拌速度。
- 允许搅拌继续, 直到基板溶解。
- 将基板溶液浸入50毫升锥形管中, 加入 0.1 m 醋酸钠缓冲液 ph 4.6, 直至总体积为45毫升。通过晃动混合。
- 将基板溶液存放在室温下, 直至使用。
2. 执行实验
- 编写国贸中心文书
- 确保参考电池中装载了350μl 的蒸馏水。在将酶加载到样品细胞之前, 请验证样品细胞是否已被清洗。
- 清洗协议-用500μl 的2% 清洁溶液 (材料表) 填充装载注射器, 小心地将针头插入样品细胞, 填充电池, 然后使用相同的注射器慢慢取出液体。将液体放入烧杯中。用2% 的清洁溶液 (材料表) 重复此步骤两次, 用70% 乙醇重复三次, 然后用蒸馏水清洗10次。
- 用450μl 的酶溶液填充装载注射器, 小心地将针头一直插入样品细胞底部, 然后将柱塞慢慢按下100Μl 线, 以防止气泡的形成。
- 用蒸馏水清洗50μl 滴定注射器三次, 方法是将针尖放入水中, 然后慢慢将水放入注射器中, 然后将水分配到废物容器中。
- 用衬底溶液冲洗三次, 去除残留的水。
- 用底物溶液填充滴定注射器, 直到注射器满, 没有任何气泡。
- 由于注射器仍在基板溶液中, 请取出柱塞, 并允许大约2μl 的空气进入注射器顶部, 然后重新插入柱塞。
- 取下国贸中心的布袋手柄, 将注射器放在布袋手柄内, 然后拧紧至。
- 用无绒毛组织擦拭搅拌器的尖端, 然后小心地将布瑞特手柄放入 ITC 仪器并将其锁定到位。
3. 设置 ITCrun
- 在计算机上, 打开Itcrun , 然后单击 "设置"。
- 单击"搅拌速率" , 并将其设置为 350 rpm。检查注射器的大小 (μL), 并确保它是在50μl。
- 设置温度, 然后按更新。建议在筹备国贸中心之前至少1小时执行这一步骤。这样, 仪器就有足够的时间根据需要加热或冷却。
- 对于实验设置, 请选择增量滴定。
- 单击"插入" 设置注射。将注射间隔调整为 5400秒, 注射体积 (μL) 调整为 4, 注射次数调整为4。按"确定"确认设置。
- 在"均衡" 框中, 选择 "自动平衡"和"大预期加热"。(如果预期的加热是小的, 你可以选择小在预期的热; 但是, 这将增加平衡时间。
- 将初始基线设置为300秒。
- 要开始运行, 请单击"搅拌速率" 旁边的"开始" 符号, 然后单击位于扳手符号旁边的"开始" 。
- 保存文件并允许仪器运行。
4. 分析数据
- 在纳米分析中打开该文件。单击 "数据" , 然后选择"数据列"。
- 选择所有数据, 复制数据, 然后将其粘贴到 Microsoft Excel 中。
- 通过在300s 时添加所需的值使其为零, 调整零基线。将此校正应用于热率值的整个列。
- 通过使用公式: = MIN (cell: cell) 或 MAX (细胞: 细胞), 找出每次注射的热率的最小值或最大值。每个数据点代表每个注射酶的峰值酶活性。
- 针对滴定过程中值发生的时间绘制 min 或 MAX 值的绘图。
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Representative Results
图 1和图 5显示了两种酶 (乳糖酶和转化酶) 的数据。乳糖酶和转化酶催化将二糖水解成两个单糖, 分别在内膜和放热中水解。这两种酶反应都是在浓度下运行的, 从而阻止了酶的饱和度。
乳糖酶数据显示了如何利用 ITC 数据来估计酶的稳定性。四次连续注射600mm 乳糖 (图 1), 滴定成 20 mg/mL 乳糖酶。每次注射之间的间隔为 5400秒, 这使得在每次注入之前有足够的时间返回到初始基线。上述协议是在25°c、35°c、45°c 和55°c 下执行的。此外, 600 mM 乳糖仅在55°c 时滴定成 100 mM 醋酸钠缓冲液, 作为混合热量的控制。对于每注入底物的酶, 都会有最初的放热热, 然后乳糖的乳糖的乳糖催化吸热水解发生, 直到反应完成, 热率恢复到基线。然后, 由于酶活性的降低, 将乳糖注入乳糖溶液中, 每次注射的吸热反应的峰值高度比之前的注射略少于先前的注射。然后可以转换原始数据, 以显示相对于时间的峰值热量 (图 2a-d)。然后, 每个注射的峰值高度可以与线性回归相适应, 斜率表示酶在所选温度下的稳定性。斜率越负, 酶的稳定性就越低。如预期的那样, 酶的稳定性会随着温度的升高而降低 (图 2e)。
图 1中描述的每次乳糖注射都会导致乳糖酶的稀释。为了证明这种稀释不是酶活性下降的原因, ITC 乳糖酶活性测定也是在25°c 时进行的, 乳糖酶浓度是在第一次注射时和最后一次注射时进行的 (图 3)。这种稀释导致酶活性下降 8%, 而在检测中的第四剂注射显示, 活性下降73%。因此, 在四针注射实验中, 乳糖酶的稀释效果相对较小 (即 11%)酶活性。因此, 活动的实际损失为 73-8 = 65%。
如导言所述, 使用国贸中心的优点之一是, 这些反应可以在牛奶等不透明介质中进行。为了证明国贸中心的这一能力, 牛奶被直接注射到乳糖酶中 (图 4)。由于牛奶的 pH 值与醋酸钠缓冲液不匹配, 因此在注射后立即有大量的放热热混合。混合峰的放热热出现在缺乏乳糖酶的对照中 (图 4, 灰线) 和两次牛奶注射 (图 4, 黑色和虚线) 后的混合峰热。表明乳糖酶活性发生的吸热反应。牛奶含有蛋白质、维生素、矿物质和乳糖的复杂混合物。由于牛奶的复杂性, 很可能在我们的反应过程中发生了其他反应。为了证明吸热峰是由乳糖酶活性引起的, 牛奶中含有 146 mM 乳糖。在与乳糖尖峰牛奶的反应中 (图 4, 虚线), 吸热峰和曲线下的面积大于单独的牛奶 (图 4, 黑线), 这表明吸热峰确实是由于乳糖酶活性造成的。基线偏移表明乳糖反应结束后, 反应缓慢仍在继续。
为了证明该方法如何用于比较两种不同酶制剂的酶活性稳定性,图 5在 35°c 11 时比较了在尼龙-6 纳米纤维膜上固定的游离转化酶和转化酶的稳定性..与乳糖酶测定一样, 连续注射了4针4μL 蔗糖, 并从每次注射的峰值高度确定最大热率。如图 6所示, 峰值高度随着时间的推移呈线性下降, 表明酶活性下降。
图 1* 国贸中心乳糖酶活性的数据痕迹.每个痕迹显示四个连续4Μl 注射 600 mM 乳糖到乳糖溶液中的 ph 4.6 缓冲液。这些痕迹是在 55°c (黑色)、45°c (深灰色)、35°c (虚线)、25°c (浅灰色) 和55°C 时无酶控制 (虚线) 下完成的。直线表示每次注射后的最高热峰的适合度。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 基于峰值活性变化率的酶活性稳定性.在 25°c (a)、35°c (b)、45°C (c) 和 55°c (d) 时, 四次注射中每一次注射的峰值酶活性相对于时间的影响。数据的线性拟合由实线表示。A-d部分中的安装线的坡度是根据e中的温度绘制的。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 酶稀释对25°c 峰值高度的影响.乳糖酶活性是在第一和第四次注射时分别测定 20 mgml (黑色) 和 18.62 Mg/ml (灰色) 的酶浓度。鉴于酶的峰值活性, 该插入物是一个放大的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 测量牛奶中的乳糖酶活性.国贸中心的痕迹是将 BYU 奶油脂肪脱脂牛奶注入缓冲液 (灰色), 将牛奶放入 20 mg/mL 乳糖 (黑色), 并将含有5% 额外乳糖的牛奶刺入 20 mg/mL (虚线)。y 轴是不连续的, 以显示吸热酶反应和共混的放热热。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 一个典型的例子, 说明如何利用 itc 酶稳定性测定在35°c 下比较两种不同的转化酶制剂.在纳米纤维膜和游离酶上固定化的转化酶活性分别表现为点状和深灰色线。黑线是没有转化酶的控件, 只显示在适当尺度上混合的热量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 在注入600mm 蔗糖4Μl 后, 峰值放热热速率与转化酶浓度之间的线性关系.此标准曲线可用于确定未知样品中的转化酶浓度。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
此处描述的 ITC 酶稳定性分析的一个主要优点是自动化。一旦所有适当的缓冲液和解决方案都得到了, 每次检测的设置时间约为15分钟。相反, 传统的转化酶和乳糖酶活性检测需要约 2小时, 而进行检测的人持续参与, 许多酶活性检测需要大量的人小时。在以前的一份出版物中, 我们演示了 ITC 方法的数据与更传统的转化酶活性方法相比如何。
ITC 检测的另一个优点是它适用于几乎任何酶12。因此, 在特定的条件下测试不同酶的稳定性不需要设置几种不同的检测方法。此外, ITC 检测可用于确定一种新型酶或没有合适的比色测定方法的酶的活性稳定性。 ITC 检测也可以在不透明介质中进行, 这是食品科学的一大优势。由于以前大多数酶活性检测都使用分光光度法、荧光法或发光法来测量酶活性, 因此它们与不透明或高颜色的介质不兼容。虽然这项工作只显示了温度对酶活性稳定性的影响, 但国贸中心方法适用于影响酶稳定性的大多数其他条件 (如 pH 值、盐、非水溶剂和变性剂)。
与所有 ITC 实验一样, 用于酶和底物溶液的缓冲液应尽可能匹配。浓度或 pH 值的不匹配会导致较大的热效应, 超过热量计的动态范围。使用相同的库存缓冲液来制备酶和底物溶液通常就足够了。但如果没有, 则可以通过对相同的缓冲溶液对这两种溶液进行透析来匹配这些解。
另一个条件是, 酶不应该是底物饱和, 在这种情况下, 峰值高度变得独立于底物浓度。此外, 反应进入完成或注射之间的平衡的时间可能会变得过多, 或信号可以超过热量计的动态范围。然而, 基板浓度必须足够大, 以提供强烈的热信号。如果酶是底物饱和, 可以降低底物浓度, 或增加酶浓度。在装载热量计细胞和注射器时, 必须确保不存在气泡。如果在实验过程中从细胞中注入或释放气泡, 就会在热率信号中引起异常事件。
国贸中心的方法取决于催化反应的焓变化以及反应的速率和量。如果反应的焓变化太小, 底物不溶于水, 或者酶没有足够的活性, 热率可能太小, 无法获得足够的信号。此外, 如果酶被低浓度的产品抑制, 在实验过程中观察到的酶活性的减少将是由产品抑制以及随着时间的推移而失去的活性引起的。例如, 在乳糖酶滴定法中, 54 mM 葡萄糖和半乳糖的最终浓度会导致55°C 的酶活性峰值下降 27% (未显示数据)。这明显低于图1中从注射1到注入4的峰值高度下降78%。然而, 这可以通过测量酶活性在产品浓度的存在, 在过程中达到的检测过程中进行校正。此外, 用较少的底物滴定酶可以减少产品抑制量。
其他限制可能会发生由于酶。例如, 每次注射酶都会被稀释。由于此 ITC 使用溢流反应容器, 因此在实验过程中, 每次注射都会去除相当于注射尺寸的溶液体积。因此, 少量的酶被去除, 反应的产物随着每次注射而增加。如果注射量小, 稀释的效果和去除的酶的用量可以保持在较小的水平, 因此通常需要大量的底物浓度。由于反应容器较大的 Itc 中注入体积与反应容器体积的比例较小, 稀释效果小于本工作中使用的低体积国贸中心。此外, 许多酶的每个反应都需要微克到低毫克的量, 所以如果你有一种昂贵或难以纯化的酶, 这可能会禁止使用这种检测方法。
在这次试验中可能出现的大多数问题都与国贸中心反应容器的适当维护和清洗有关。如果国贸中心没有达到稳定的基线, 这往往是由于反应容器不够干净。我们建议在每次实验后在 ITC 中使用蛋白质时使用强洗涤剂, 因为蛋白质可以粘附在反应容器上, 并干扰热率测量。对于更深的清洁, 在55°c 孵育长达12小时的50% 甲酸溶液, 然后使用清洁溶液 (材料表)、乙醇和水清洗, 可去除大多数污染物。
最后, 由于国贸中心在加载溶液后大约需要45分钟才能平衡, 因此相对不稳定的酶或在边缘条件下的活性可能是不可能的。如果酶在这段时间内失活, 就不会有信号, 或者第一次注射后的衰变可能太快, 无法获得稳定数据。
由于 ITC 检测直接测量酶活性, 因此可以扩展到其他多种用途。例如, 这种检测可以在抑制剂浓度增加的情况下进行, 以确定抑制常数 ki, 其基础是随着抑制剂浓度的增加, 酶活性下降。如图 5所示, 该协议可适用于固体支持上的固定化酶。本工作中使用了纳米纤维膜, 但如果能开发出一种通过小通管插入和取出纳米纤维膜的方法, 也可以使用其他固体支撑物。国贸中心的方法还可以推广到化学或基因改变的酶, 以提高热稳定性或确定未知样本中活性酶的含量 (即, 图 6显示了热率峰值之间的线性关系高度和酶浓度)。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
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