Enzymatische Stabilität durch isothermen Titration Kalorimetrie Messung

Summary

Die thermische Stabilität der Enzym-Aktivität wird leicht durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC) gemessen. Die meisten Protein Stabilität Assays derzeit verwendet Maßnahme Protein entfaltet, aber keine Informationen über enzymatische Aktivität. ITC ermöglicht die direkte Bestimmung der Wirkung des Enzyms Modifikationen auf die Stabilität der Enzym-Aktivität.

Abstract

Diese Arbeit zeigt eine neue Methode zur Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). Der Gipfel Wärmerate nach eine einzige Injektion der Substrat-Lösung in eine Enzymlösung mit Enzym-Aktivität korreliert ist zu beobachten. Mehrere Injektionen des Substrates in das gleiche Enzym-Lösung im Laufe der Zeit zeigen den Verlust der Enzymaktivität. Der Test ist autonom, erfordert sehr wenig Personal Zeit und ist für die meisten Medien und Enzyme.

Introduction

Enzyme sind Proteine, die in der Lage, eine breite Palette von organischen Reaktionen katalysieren. Die meisten Enzyme Funktion in wässriger Lösung an in der Nähe von neutralen pH-Wert, wodurch den Einsatz von harten Lösungsmitteln. Wegen der hohen Selektivität, katalysierten Enzymreaktionen produzieren weniger (in einigen Fällen keine Nebenprodukte) Nebenprodukte als nicht-selektive Katalysatoren wie Säuren und Laugen¹. Dies ist besonders relevant in der Lebensmittel verarbeitenden wo alle chemische Reaktionen durchgeführt werden müssen, so dass das Endprodukt für den menschlichen Verzehr unbedenklich ist. Derzeit werden Enzyme verwendet, um hohen Fructose Corn Sirup², Käse³, Bier⁴, laktosefreie Milch⁵und andere wichtige Nahrungsmittel zu produzieren. Während dieser Arbeit konzentriert sich auf Enzym-Einsatz in der Lebensmittelindustrie, gibt es viele andere Verwendungen für Enzyme, die unter anderem in grüne Chemie und Drogen-Synthese.

Das Dienstprogramm von Enzymen ist begrenzt durch die Stabilität der Enzym-Aktivität, die Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms abhängt. Die Enzymstruktur kann durch Modifikationen wie Pegylierung⁶, Immobilisierung auf eine solide Unterstützung⁷, gentechnische Veränderungen⁸und Formulierungen stabilisiert werden. Derzeit Enzymstabilität bemisst sich in der Regel durch differential scanning-Kalorimetrie (DSC) und Endpunkt Enzymaktivität assays⁹. DSC misst die Temperatur, bei der ein Enzym entfaltet; Je höher die Temperatur, desto stabiler ist die Struktur. Verlust der Aktivität tritt jedoch oft bei einer niedrigeren Temperatur als erforderlich, um das Enzym oder Domänen innerhalb der Enzym-¹⁰entfalten. DSC ist daher nicht ausreichend, um festzustellen, ob eine Änderung des Enzyms die Stabilität der Enzym-Aktivität erhöht. Endpunkt-Enzym-Assays sind in der Regel Zeit intensiv, erfordern mehrere Proben und beinhalten oft eine gekoppelte kolorimetrischen Reaktion, die auf stark farbigen oder opak Lösungen oder Suspensionen nicht anwendbar ist.

Diese Arbeit zeigt eine Methode zur direkten Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). ITC misst die Geschwindigkeit von Wärme freigesetzt oder aufgenommen im Verlauf einer Reaktion. Da fast alle Reaktionen produzieren oder Wärme absorbieren, kann ITC verwendet werden, für die meisten Enzym-katalysierten Reaktionen, einschließlich der Reaktionen, die nicht über eine gekoppelte Reaktion oder auftreten in undurchsichtigen Medien wie Milch. ITC seit vielen Jahrzehnten verwendet wurde, um chemische kinetische Parameter für viele Arten von Reaktionen zu messen, aber das Protokoll hier vorgestellten mit ITC um zu messen, die Spitze Wärmerate von Enzym-katalysierten Reaktionen im Mittelpunkt und zeigt, dass Enzymaktivität linear mit der Spitze Wärmerate korreliert. ITC Messungen von Peak-Hitze-Preise sind meist autonom und benötigen sehr wenig Personal Zeit einzurichten und zu analysieren.

Protocol

1. Vorbereitung der Proben

1. 1.000 mL 0,1 M-Natrium-Acetat-Puffer bei pH 4.6
   1. 800 mL destilliertem Wasser in ein Becherglas 1.000 mL Schloss zu messen.
   2. Gewicht 8,2 g wasserfreiem Natriumacetat und fügen Sie es den Becher.
   3. Stellen Sie den Becher auf einem Teller rühren, place einen rühren Stab in das Becherglas, schalten Sie die Platte rühren und rühren vollständig aufgelöst.
   4. Wenn wasserfreiem Natriumacetat vollständig aufgelöst ist, Messen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem kalibrierten pH-Meter.
   5. Fügen Sie 1 M HCl oder NaOH entsprechend um den gewünschten pH-Wert 4,6 zu erhalten.
   6. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 1.000 mL beträgt.
   7. Bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern.
2. Enzymlösung
   1. 10 mL von dem Enzym Lösung im Bereich 10-30 mg/mL durch die erste Messung 8 mL der 0,1 M Natrium Acetat-Puffer pH 4.6 in 15 mL graduierte Zylinder vorzubereiten.
   2. Fügen Sie die Pufferlösung in ein 15 mL konische Röhrchen mit Enzym hinzu und schütteln Sie kräftig, bis sich das Enzym aufgelöst hat.
   3. Fügen Sie weitere Pufferlösung, bis das Gesamtvolumen 10 mL beträgt.
   4. Speichern Sie das Enzymlösung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
3. Substratlösung
   1. Um eine Substratlösung im Bereich von 300-600 mM vorzubereiten, berechnen Sie die Menge des Substrats in Gramm benötigt, um die gewünschte Konzentration zu machen.
   2. Wiegen Sie das Substrat und legen Sie in einem 100 mL-Becherglas
   3. Messen Sie 20 mL der Pufferlösung mit 25 mL graduierte Zylinder zu und fügen Sie ihn in das Glasgefäß.
   4. Stellen Sie den Becher auf einem Teller rühren und legen Sie einen Magnetisches Rühren Stab in das Becherglas. Schalten Sie die Hitze und anzupassen Sie die Rührgeschwindigkeit entsprechend.
   5. Lassen Sie rühren weiter, bis das Substrat aufgelöst hat.
   6. Gießen Sie die Substratlösung in ein 50 mL konische Röhrchen und 0,1 M Natrium Acetat-Puffer pH 4,6 bis 45 mL beträgt. Durch Schütteln mischen.
   7. Speichern Sie die Substratlösung bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung.

2. Durchführung des Experiments

1. Vorbereitung des ITC-Instruments
   1. Sicherstellen Sie, dass die Referenzzelle mit 350 µL destilliertes Wasser geladen wird. Sicherzustellen Sie bevor das Enzym in den Sample-Zelle geladen, dass die Sample-Zelle gereinigt wurde.
   2. Reinigung Protokoll-Füllung der Laden-Spritze mit 500 µL 2 % Reinigungslösung (Table of Materials), stechen Sie die Nadel vorsichtig in die Sample-Zelle, füllen Sie die Zelle und entfernen Sie langsam die Flüssigkeit mit der gleichen Spritze. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in einen Becher füllen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit 2 % Reinigungslösung (Table of Materials), drei Mal mit 70 % Ethanol und dann waschen Sie zehn Mal mit destilliertem Wasser.
   3. Füllen Sie die Spritze laden mit 450 µL Enzymlösung, sorgfältig stechen Sie die Nadel nach unten von der Sample-Zelle und drücken Sie den Kolben bis zu 100 µL Zeile langsam zur Bildung von Luftblasen zu verhindern.
   4. Waschen Sie die 50 µL Titration Spritze mit destilliertem Wasser dreimal durch Platzieren der Nadelspitze in Wasser langsam nimmt das Wasser in die Spritze, dann Verzicht auf das Wasser in einen Abfallbehälter.
   5. Restwasser durch das Ausspülen mit Substratlösung dreimal zu entfernen.
   6. Füllen Sie die Titration Spritze mit Substratlösung zeichnen die Lösung, bis die Spritze ohne Luftblasen voll ist.
   7. Entfernen Sie mit der Spritze immer noch in der Substratlösung den Kolben zu und ermöglichen Sie etwa 2 µL der Luft geben die Spitze der Spritze und den Kolben.
   8. Entfernen Sie die Bürette Griff des ITC, legen Sie die Spritze in die Bürette Griff und Schraube bis zum Anschlag.
   9. Wischen Sie die Spitze des Rührers mit einem fusselfreien Tuch ab, dann setzen Sie die Bürette Griff in der ITC-Instrument vorsichtig und verriegeln Sie ihn.

3. Einrichten der ITCrun

1. Öffnen Sie auf dem Computer ITCrun und klicken Sie auf Einrichten.
2. Klicken Sie unter ständigem Rühren Rate und bis 350 u/min eingestellt. Überprüfen Sie die Spritze Größe (µL) und sicherzustellen Sie, dass es bei 50 µL.
3. Stellen Sie die Temperatur ein, und drücken Sie Update. Es wird empfohlen, dass dieser Schritt durchgeführt werden mindestens 1 h vor der Zubereitung der ITC. Damit genügend Zeit für das Instrument zu erwärmen oder abkühlen, je nach Bedarf.
4. Wählen Sie für das Experiment-Setup inkrementelle Titration.
5. Klicken Sie auf Einfügen , um die Injektionen setup. Passen Sie die Injektion-Intervall auf 5.400 s, Injektionsvolumen (µL) auf 4 und Anzahl der Injektionen bis 4. Drücken Sie "OK" , um die Einstellungen zu bestätigen.
6. Wählen Sie im Gleichgewichtherstellung Box Auto equilibrate und große erwartet erwärmt. (Wenn die erwarteten heizt klein sind, kann eine auswählen kleine unter erwarteten erwärmt, dadurch erhöht sich jedoch die Gleichgewichtherstellung Zeit.)
7. Legen Sie die erste Grundlinie auf 300 s.
8. Auf der Flucht, klicken Sie auf start der starten symbol neben rühren bewerten und klicken Sie neben das Schraubenschlüssel-Symbol starten .
9. Speichern Sie die Datei und lassen Sie das Gerät laufen.

4. Analyse von Daten

1. Öffnen Sie die Datei in NanoAnalyze. Klicken Sie auf Daten und wählen Sie Datenspalten.
2. Wählen Sie alle Daten, kopieren Sie und fügen Sie dann die Daten in Microsoft Excel.
3. Stellen Sie Null Grundlinie durch Mehrwert erforderlich bei 300 s zu Null. Gelten Sie diese Korrektur für die gesamte Spalte der Hitze Rate Werte.
4. Den minimalen oder maximalen Wert der Hitze Rate für jede Injektion mithilfe der Gleichung zu finden: =MIN(cell:cell) oder MAX(cell:cell). Jeder Datenpunkt stellt die Höhepunkt enzymatische Aktivität des Enzyms bei jeder Injektion.
5. Plot-Diagrammen der MIN oder MAX Werte gegen die Zeit, zu der der Wert während der Titration aufgetreten ist.

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 5 zeigen Daten aus zwei Enzyme, Laktase und Invertase. Laktase und Invertase katalysieren die Hydrolyse von einem Disaccharid in zwei Monosaccharide, endothermically und exotherm, beziehungsweise. Beide enzymatischen Reaktionen wurden bei Konzentrationen ausgeführt, die Sättigung des Enzyms ausgeschlossen.

Die Laktase-Daten zeigen, Verwendung von ITC Daten Enzymstabilität schätzen. Vier sequentiellen 4 µL Injektionen von 600 mM Laktose (Abbildung 1) wurden in 20 mg/mL Laktase titriert. Ein Intervall von 5.400 s zwischen jeder Injektion angewendet wurde, und dadurch genug Zeit, um die erste Grundlinie vor jeder Injektion wieder. Das oben beschriebene Protokoll wurde bei 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C und 55 ° c durchgeführt. Darüber hinaus war 600 mM Laktose in 100 mM Natrium-Acetat-Puffer nur bei 55 ° C als Kontrolle für die Hitze des Mischens titriert. Für jede Injektion des Enzyms in Substrat gibt es eine erste exotherme Wärme mischen und anschließend endothermen Laktase katalysierte Hydrolyse von Laktose auftritt, bis die Reaktion abgeschlossen ist und die Wärmerate kehrt zur Grundlinie zurück. Die Injektion von Laktose in die Laktase-Lösung wird dann noch dreimal mit der Scheitelhöhe der endothermen Reaktion von jeder nachfolgenden Injektion etwas weniger als die vorherigen Injektion wegen der Abnahme der Enzymaktivität wiederholt. Die Rohdaten können dann umgewandelt werden, um die Spitze Hitze bezogen auf Zeit (Abbildung 2A-D) zeigen. Für jede Injektion die Peakhöhe passen sich dann um eine lineare Regression und die Neigung zeigt Enzymstabilität bei der gewählten Temperatur. Je mehr negative Steigung, die weniger stabil das Enzym. Wie erwartet, sinkt Enzymstabilität mit steigender Temperatur (Abb. 2E).

Jeder Injektion von Laktose in Abbildung 1 Ergebnisse zu einer Verwässerung der Laktase beschrieben. Um zu demonstrieren, dass diese Verdünnung nicht die Ursache für den Rückgang der enzymatischen Aktivität ist, erfolgte der ITC Laktase-Aktivität-Test auch bei 25 ° C, die Laktase-Konzentration bei der ersten Injektion und bei der letzten Injektion (Abbildung 3). Diese Verdünnung führt eine 8 % Rückgang der Enzym-Aktivität, während der vierte Injektion in die Probe einen Rückgang der Aktivität um 73 zeigt %. Die Verdünnung des Laktase während des vier-Injektion-Experiments hatte somit eine relativ geringe Wirkung (d. h. 11 %) auf Enzymaktivität. Der tatsächliche Verlust der Tätigkeit war daher 73-8 = 65 %.

Wie erwähnt ist die Einführung einer der Vorteile der Verwendung von ITC, dass diese Reaktionen in undurchsichtigen Medien, wie z. B. Milch getan werden können. Um diese Fähigkeit von ITC zu demonstrieren, wurde die Milch direkt in Laktase (Abbildung 4) injiziert. Da der pH-Wert der Milch nicht der Natrium-Acetat-Puffer zugeordnet ist, gibt es eine große exotherme Wärme unmittelbar nach der Injektion zu mischen. Die exotherme Wärme des mischenden Peak wird in das Steuerelement, das Fehlen der Laktase (Abbildung 4, graue Linie) und die zwei Injektionen mit Milch (Abbildung 4, schwarz und gepunktete Linien) im Anschluss an die Hitze des Mischens Gipfel gesehen. Die endotherme Reaktion darauf hinweist Laktase-Aktivität auftritt. Milch enthält eine komplexe Mischung aus Eiweiß, Vitaminen, Mineralstoffen und Milchzucker. Aufgrund der Komplexität der Milch ist es wahrscheinlich, dass andere Reaktionen im Verlauf unserer Reaktion auftreten. Um zu demonstrieren, dass die endotherme Spitze durch Laktase-Aktivität, war die Milch mit 146 mM Laktose versetzt. Bei der Reaktion mit der Milch Laktose versetzt (Abbildung 4, gepunktete Linie) sind die endotherme Peak und die Fläche unter der Kurve größer als in der Milch allein (Abbildung 4, schwarze Linie), darauf hinweist, dass der endothermen Peak in der Tat durch die Laktase-Aktivität ist. Die Basislinienversatz zeigt, dass eine langsame Reaktion wird fortgesetzt, nachdem die Laktose-Reaktion abgeschlossen ist.

Um zu demonstrieren, wie dieser Assay verwendet werden kann, um die Stabilität der enzymatische Aktivität von zwei verschiedenen Enzympräparate zu vergleichen, die Stabilität der freien Invertase und Invertase auf einer Nylon-6 Nanofaser-Membran immobilisiert werden in Abbildung 5 verglichen, bei 35 ° C¹¹ . Wie in der Laktase-Assay vier 4 µL Injektionen von Saccharose wurden nacheinander und die maximale Wärme von der Peakhöhe für jede Injektion bestimmt. Wie in Abbildung 6gezeigt, verringern Sie die Peak-Höhen linear mit der Zeit abnehmende Enzymaktivität angibt.

Abbildung 1 : ITC Datenspuren Laktase Aktivität. Jede Spur zeigt vier sequentiellen 4 µL Injektionen von 600 mM Laktose in einer Laktase-Lösung bei pH 4.6 Puffer. Die Spuren wurden bei 55 ° C (schwarz), 45 ° C (dunkelgrau), 35 ° C (gestrichelt), 25 ° C (hellgrau) und ein kein Enzym-Steuerelement (punktiert) bei 55 ° c durchgeführt. Die geraden Linien repräsentieren die Passform, die endothermen Peak-mindestens nach jeder Injektion.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Stabilität der Enzym-Aktivität anhand der Änderungsrate in Spitzenaktivität. Die Gipfel enzymatische Aktivität für jede der vier Injektionen bezogen auf Zeit (s) bei 25 ° C (A), 35 ° C (B) und 45 ° C (C) 55 ° C (D). Die lineare Anpassung der Daten wird durch die durchgezogene Linie dargestellt. Die Hänge der montierten Linien in Teile A-D sind gegen Temperatur in Egeplottet.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Die Wirkung des Enzyms Verdünnung auf Scheitelhöhe bei 25 ° c Laktase-Aktivität wird bei der Enzym-Konzentration in der ersten und vierten Injektion von 20 mg/mL (schwarz) und 18,62 mg/mL (grau), bzw. gemessen. Der Einschub ist eine vergrößerte im Hinblick auf die Peak-Enzymaktivität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Messung der Laktase-Aktivität in der Milch. ITC Spur einer Injektion von BYU Creamery fette Milch in Puffer (grau), Milch in 20 mg/mL Laktase (schwarz) und Milch, gespickt mit zusätzlichen 5 % Laktose in 20 mg/mL (punktiert). Die y-Achse ist unterbrochen, die endotherme Enzymreaktion und die exotherme Wärme der Vermischung zu zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Ein repräsentatives Beispiel für wie die ITC Enzym Stabilität Assay bei 35 ° C verwendet werden könnten, um zwei verschiedene Präparate der Invertase vergleichen. Die Aktivitäten der unbeweglich auf einem Nanofaser-Membran und freien Enzym Invertase erscheinen durch die punktierten und dunklen grauen Linien. Die schwarze Linie ist die Steuerung mit keine Invertase zeigt nur die Hitze auf entsprechenden Skalen zu mischen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Die lineare Beziehung zwischen exotherme Wärme Rate und Invertase Spitzenkonzentration nach einem 4 µL Injektion von 600 mM Saccharose. Dieser standard Kurve kann verwendet werden, um die Konzentration der Invertase in einer unbekannten Probe zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Automatisierung ist ein großer Vorteil des ITC Enzym Stabilität Tests hier beschrieben. Sobald die entsprechende Puffer und Lösungen vorgenommen werden, wird die Rüstzeit für jedes Assay ca. 15 min für die Person, die den Assay. Im Gegensatz dazu die konventionellen Assays für die Invertase und Laktase-Aktivität erfordern ca. 2 h mit kontinuierlichen Beteiligung von der Person, die die Probe und viele enzymatische Aktivität Assays nehmen wesentlich mehr Personenstunden. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, wie Daten aus der ITC-Methode im Vergleich zu einer traditionelleren Spectrophotrometric Methode für Invertase-Aktivität-¹¹.

Ein weiterer Vorteil des ITC-Assays ist seine Anwendbarkeit auf fast jedem Enzym-¹². So erfordert die Prüfung der Beständigkeit von verschiedenen Enzymen unter einen bestimmten Satz von Bedingungen nicht einrichten von mehreren verschiedenen Assays. Darüber hinaus eignet sich der ITC-Test zur Bestimmung der Stabilität der Aktivität eines neuartigen Enzyms oder eines Enzyms, die nicht über einen geeigneten farbmetrischen Assay.  Die ITC-Assay kann auch in undurchsichtigen Medien erfolgen, ist ein großer Vorteil in der Ernährungswissenschaft. Da die meisten bisherigen Tests der Enzym-Aktivität Spektrophotometrie, Fluoreszenz und Lumineszenz verwenden, um Enzym-Aktivität zu messen, sind sie nicht kompatibel mit undurchsichtigen oder stark farbigen Medien. Obwohl diese Arbeit nur der Einfluss der Temperatur auf die Stabilität der Enzym-Aktivität zeigt, ist die ITC-Methode für die meisten anderen Bedingungen, die Enzymstabilität (z. B. pH-Wert, Salze, nichtwässrigen Lösungsmitteln und Geruchsstoffen Agenten) zu beeinflussen.

Wie bei allen ITC Experimente, sollte der Puffer verwendet, für das Enzym und Substrat-Lösung so eng wie möglich übereinstimmen. Missverhältnis zwischen der Konzentration oder pH-Wert kann große Hitze Effekte verursachen, die den Dynamikbereich des Kalorimeters überschreiten. Verwendung des gleichen Lager Puffers auf dem Enzym und Substrat Lösungen zu erarbeiten ist in der Regel ausreichend. Aber wenn nicht, können die Lösungen von dialyzing beide Lösungen gegen die gleichen Pufferlösung angepasst werden.

Eine weitere Voraussetzung ist, dass das Enzym sollte kein Substrat gesättigt, in welchem Fall die Peakhöhe wird unabhängig von der Substratkonzentration. Auch die Zeit für die Reaktion auf die Fertigstellung oder Gleichgewicht zwischen den Injektionen gehen kann übertrieben werden und/oder das Signal kann den Dynamikumfang des Kalorimeters überschreiten. Die Substratkonzentration muß jedoch groß genug, um eine starke Hitze-Signal liefern. Wenn das Enzym Substrat gesättigt ist, die Substratkonzentration kann verringert werden, oder die Enzym-Konzentration erhöht. Beim Laden von Kalorimeter Zelle und Spritze muss sichergestellt werden, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Wenn eine Blase injiziert oder im Laufe eines Experiments aus der Zelle entlassen, verursacht es eine ungewöhnliche Veranstaltung in der Hitze-Rate-Signal.

Die ITC-Methode ist abhängig von der Enthalpieänderung der katalysierten Reaktion und der Preis und die Menge der Reaktion. Wenn die Enthalpieänderung der Reaktion zu klein ist, das Substrat zu unlöslichen ist oder das Enzym verfügt nicht über ausreichende Aktivität, kann die Hitze zu klein, um genügend Signal zu erhalten sein. Zusätzlich, wenn das Enzym von geringen Konzentrationen der Produkte gehemmt wird, wird der Rückgang der enzymatischen Aktivität beobachtet im Laufe des Experiments durch Produkt-Hemmung sowie Verlust der Aktivität im Laufe der Zeit verursacht werden. Beispielsweise führt die Endkonzentration von 54 mM Glukose und Galaktose in der Laktase-Titration einen 27 % Rückgang der Scheitelhöhe der Enzym-Aktivität bei 55° C (Daten nicht gezeigt). Dies ist deutlich weniger als 78 % Rückgang der Scheitelhöhe von Injektion 1 Injektion 4 in Abbildung 1. Jedoch kann dies korrigiert werden, durch die Messung der Aktivität des Enzyms in Anwesenheit der Produkt-Konzentration im Verlauf des Tests erreicht. Darüber hinaus kann das Enzym mit weniger Substrat titrieren Produkt Hemmung reduzieren.

Weitere Einschränkungen können durch das Enzym auftreten. Bei jeder Injektion werden z. B. das Enzym die verdünnte. Da diese ITC ein Überlauf Reaktionsgefäß verwendet, wird im Verlauf des Experiments ein Volumen der Lösung entspricht der Größe der Injektion bei jeder Injektion entfernt. So eine kleine Menge des Enzyms wird entfernt, und die Produkte der Reaktion zu erhöhen, bei jeder Injektion. Die Auswirkungen der Verdünnung und die Menge des Enzyms entfernt können klein gehalten werden, wenn die Injektion Größe klein gehalten, und deshalb eine große Konzentration von Substrat oft notwendig ist. Weil das Verhältnis der Einspritzmenge zu Schiff Reaktionsvolumen kleiner ITCs mit größeren Reaktionsgefäßen ist der Verwässerungseffekt kleiner als bei geringer Lautstärke ITC in dieser Arbeit verwendet. Darüber hinaus erfordert jede Reaktion für viele Enzyme Mikrogramm zu niedrigen Milligramm-Mengen, so haben Sie ein Enzym, die teuer oder schwer zu reinigen ist, könnte das Verbot der Verwendung von diesem Assay.

Die meisten Probleme, die während dieser Assay entstehen können sind im Zusammenhang mit der richtigen Pflege und Reinigung der ITC-Reaktionsgefäß. Wenn die ITC eine stabile Basislinie nicht erreicht, liegt das oft an den Reaktionsbehälter wird nicht ausreichend sauber. Wir empfehlen die Verwendung eines starken Reinigungsmittels nach jedem Experiment, wenn Proteine in der ITC zu verwenden, da Proteine halten Sie sich an den Reaktionsbehälter und die Hitze Messung stören können. Für eine tiefere wird sauber, eine 50 % Ameisensäure Lösung inkubiert bei 55 ° C für bis zu 12 h gefolgt von Reinigung mit Reinigungslösung (Table of Materials), Ethanol und Wasser die meisten Verunreinigungen zu entfernen.

Schließlich, weil die ITC etwa 45 min zu equilibrate nach dem Laden Lösungen findet, kann die Aktivität von Enzymen relativ instabil oder unter Randbedingungen nicht möglich. Wenn das Enzym, während dieser inaktiviert ist Zeit kein Signal, werden zur Verfügung stehen oder der Zerfall möglicherweise zu schnell nach der ersten Injektion Stabilitätsdaten zu erhalten.

Da die ITC-Assay direkt Enzymaktivität misst, kann es zu einer Reihe von anderen Anwendungen erweitert werden. Beispielsweise könnte dieser Assay mit steigenden Konzentrationen von Inhibitor zu bestimmen, dass die Hemmung Konstante, Ki, basiert auf der Abnahme der Enzymaktivität mit zunehmender Inhibitorkonzentration erfolgen. Wie in Abbildung 5dargestellt, kann dieses Protokoll für immobilisierten Enzymen auf einer festen Unterlage angepasst werden. Eine Nanofaser-Membran wurde in dieser Arbeit verwendet, aber andere solide stützen könnte auch verwendet werden, wenn eine Methode zum Einfügen und entfernen sie durch die kleinen Zugang Rohr entwickelt werden kann. Die ITC-Methode könnte auch auf Enzyme, die chemisch oder gentechnisch verändert sind, thermischen Stabilität zu verbessern oder die Höhe der aktiven Enzym in einer unbekannten Probe bestimmen ausgeweitet werden (d.h., Abbildung 6 zeigt die lineare Beziehung zwischen Wärme Preis Peak Höhe und Enzym-Konzentration).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)