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Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59302

Summary

La stabilità termica dell'attività enzimatica è prontamente misurata tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). La maggior parte delle analisi di stabilità di proteina attualmente utilizzato misura proteina sta svolgendo, ma non forniscono informazioni sull'attività enzimatica. ITC consente la determinazione diretta dell'effetto di modifiche di enzima sulla stabilità dell'attività enzimatica.

Abstract

Questo lavoro dimostra un nuovo metodo per misurare la stabilità dell'attività enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione (ITC). Il tasso di calore picco osservato dopo una singola iniezione di soluzione substrato in una soluzione di enzima è correlata con l'attività dell'enzima. Iniezioni multiple del substrato nella stessa soluzione enzima nel tempo mostrano la perdita di attività enzimatica. Il metodo è autonomo, che richiede pochissimo tempo personale ed è applicabile alla maggior parte dei media e degli enzimi.

Introduction

Gli enzimi sono proteine in grado di catalizzare una vasta gamma di reazioni organiche. La maggior parte funzione di enzimi in soluzione acquosa al vicino a pH neutro, evitando l'uso di solventi aggressivi. A causa della loro elevata selettività, enzima catalizzata reazioni producono meno (in alcuni non casi nessun sottoprodotti) sottoprodotti rispetto catalizzatori non selettivi come acidi e basi1. Questo è particolarmente rilevante nella produzione di cibo dove tutte le reazioni chimiche devono essere fatto così il prodotto finale è sicuro per il consumo umano. Attualmente, gli enzimi sono usati per produrre alta fruttosio sciroppo di mais2, formaggio3, birra4, privo di lattosio latte5e altri prodotti alimentari importanti. Mentre questa carta si concentra sull'uso degli enzimi nell'industria alimentare, ci sono molti altri usi per enzimi compreso nella sintesi chimica e droga verde.

L'utilità degli enzimi è limitata dalla stabilità dell'attività enzimatica, che dipende dal mantenimento della struttura tridimensionale dell'enzima. La struttura dell'enzima può essere stabilizzata tramite modifiche come PEGilazione6, immobilizzazione su un supporto solido7, modificazioni genetiche8e formulazioni. Attualmente, stabilità enzimatica è in genere misurata di calorimetria differenziale a scansione (DSC), e l'attività enzimatica endpoint saggi9. DSC misura la temperatura alla quale si dispiega un enzima; la temperatura è elevata, più stabile la struttura. Tuttavia, la perdita di attività si verifica spesso ad una temperatura inferiore rispetto a richiesta per spiegare l'enzima o domini all'interno degli enzimi10. Di conseguenza, DSC non è sufficiente per determinare se una modifica di enzima aumenta la stabilità dell'attività enzimatica. Analisi dell'enzima endpoint sono solitamente tempo intensivo, richiedono campioni multipli e spesso comportano una reazione colorimetrica accoppiata che non è applicabile a soluzioni altamente colorati o opachi o sospensioni.

Questo lavoro viene illustrato un metodo per la misura diretta della stabilità dell'attività dell'enzima tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). ITC misura il tasso di calore rilasciato o assorbito nel corso di una reazione. Poiché quasi tutte le reazioni producono o assorbono calore, ITC può essere utilizzato per la maggior parte delle reazioni enzima-catalizzate, compreso le reazioni che non hanno una reazione accoppiata o verificarsi in mezzi opachi come il latte. ITC è stato utilizzato per molte decadi per misurare i parametri di cinetici chimici per molti tipi di reazioni, ma il protocollo qui presentato si concentra sull'utilizzo di ITC per misurare la velocità di picco di calore di reazioni enzima-catalizzate e dimostra che l'attività dell'enzima è linearmente correlato con il tasso di calore di picco. ITC misurazioni di velocità di picco di calore sono per lo più autonome e richiedono pochissimo tempo personale di installazione e analizzare.

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Protocol

1. preparazione dei campioni

  1. 1.000 mL di tampone di acetato di sodio 0.1 M a pH 4,6
    1. Misurare da 800 mL di acqua distillata in un becher graduato da 1.000 mL.
    2. Pesare 8,2 g di acetato di sodio anidro e aggiungerlo al bicchiere.
    3. Porre il becher su un piatto di mescolare, inserire un bastoncino per mescolare nel bicchiere graduato, accendere la piastra di mescolare e mescolare fino a completa dissoluzione.
    4. Quando l'acetato di sodio anidro è completamente sciolto, misurare il pH della soluzione con un pHmetro calibrato.
    5. Aggiungere 1 M HCl o NaOH di conseguenza per ottenere il desiderato pH 4.6.
    6. Aggiungere acqua distillata fino a quando il volume totale è di 1.000 mL.
    7. Conservare a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
  2. Soluzione enzimatica
    1. Preparare 10 mL di enzima soluzione all'interno della gamma di 10-30 mg/mL di prima misura 8 mL del 0.1 M sodio acetato tampone pH 4.6 in un 15ml laureato cilindro.
    2. Aggiungere la soluzione tampone in una provetta conica da 15 mL con enzima ed agitare vigorosamente fino a sciolta l'enzima.
    3. Aggiungere soluzione tampone più fino a quando il volume totale è di 10 mL.
    4. Conservare la soluzione di enzima a 4 ° C fino all'utilizzo.
  3. Soluzione di substrato
    1. Per preparare una soluzione di substrato all'interno della gamma di 300-600 mM, calcolare la quantità di substrato necessario in grammi per rendere la concentrazione desiderata.
    2. Pesare il substrato e inserire in un becher di vetro da 100 mL
    3. Misurare 20 mL della soluzione tampone utilizzando un cilindro graduato da 25 mL e quindi aggiungere il bicchiere di vetro.
    4. Porre il becher su un piatto di mescolare e mettere un bastoncino per mescolare magnetico nel becher. Accendere il fuoco e regolare di conseguenza la velocità dell'agitatore.
    5. Consentire mescolando per continuare fino a quando il substrato ha dissolto.
    6. Versare la soluzione di substrato in una provetta conica da 50 mL e aggiungere tampone 0,1 M a pH 4.6 sodio acetato fino a quando il volume totale è di 45 mL. Mescolare agitando.
    7. Conservare la soluzione di substrato a temperatura ambiente fino all'utilizzo.

2. esecuzione dell'esperimento

  1. Preparazione dello strumento ITC
    1. Assicurarsi che la cella di riferimento viene caricata con 350 µ l di acqua distillata. Prima di caricare l'enzima nella cella del campione, verificare che la cella del campione è stata pulita.
    2. Protocollo-riempire la siringa di caricamento con 500 µ l di soluzione di pulizia di 2% (Tabella materiali) di pulizia, inserire delicatamente l'ago nella cella del campione, riempire la cella e rimuovere lentamente il liquido utilizzando la stessa siringa. Eliminare il liquido in un becher. Ripetere questo passaggio due volte con 2% (Tabella materiali), soluzione di pulizia tre volte con etanolo al 70% e poi lavare dieci volte con acqua distillata.
    3. Riempire la siringa di caricamento con 450 µ l di soluzione degli enzimi, con attenzione inserire l'ago fino al fondo della cella campione e premere lo stantuffo verso il basso per la linea 100 µ l lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria.
    4. Lavare la siringa di titolazione di 50 µ l con acqua distillata tre volte, inserire la punta dell'ago in acqua poi lentamente riprendendo l'acqua nella siringa, poi erogare l'acqua in un contenitore per rifiuti.
    5. Rimuovere residui di acqua di risciacquo con soluzione substrato tre volte.
    6. Riempire la siringa di titolazione con soluzione di substrato disegnando la soluzione fino a quando la siringa è completa senza bolle d'aria.
    7. Con la siringa ancora nella soluzione di substrato, togliere lo stantuffo e consentire circa 2 µ l di aria per inserire la parte superiore della siringa e reinserire lo stantuffo.
    8. Rimuovere la maniglia buret dell'ITC, posizionare la siringa all'interno del manico buret e avvitare fino al stretto.
    9. Pulire la punta dell'agitatore con un panno privo di lanugine, quindi posizionare la maniglia buret nello strumento ITC e bloccarlo in posizione.

3. configurazione di ITCrun

  1. Sul computer, aprire ITCrun e fare clic su impostare.
  2. Fare clic su mescolando tasso e impostare a 350 RPM. Verificare la dimensione della siringa (µ l) e assicurarsi che sia a 50 µ l.
  3. Impostare la temperatura e premere Update. È consigliabile che questo passaggio venga eseguito almeno 1 h prima di preparare l'ITC. Questo consente un tempo sufficiente per lo strumento riscaldare o raffreddare come necessario.
  4. Per la struttura dell'esperimento, selezionare titolazione incrementale.
  5. Fare clic su Inserisci per le iniezioni di installazione. Regolare l'intervallo di iniezione a 5.400 s, volume di iniezione (µ l) per 4 e il numero di iniezioni a 4. Premere OK per confermare le impostazioni.
  6. Nella casella di equilibrazione, selezionare Auto-equilibrare e grande previsto si riscalda. (Se previste manche sono piccole, uno può selezionare piccole sotto previsto riscalda; tuttavia, questo aumenterà il tempo di equilibramento.)
  7. Impostare la previsione iniziale di 300 s.
  8. Per iniziare l'esecuzione, clicca l' avviare simbolo accanto al tasso di agitazione e quindi fare clic su Start che si trova accanto al simbolo di chiave.
  9. Salvare il file e consentire di eseguire lo strumento.

4. analisi dei dati

  1. Aprire il file in NanoAnalyze. Fare clic su dati e selezionare le colonne di dati.
  2. Selezionare tutti i dati, copiare e quindi incollare i dati in Microsoft Excel.
  3. Regolare zero base aggiungendo il valore richiesto a 300 s per renderlo zero. Applicare questa correzione per l'intera colonna di valori del tasso di calore.
  4. Individuare il valore minimo o massimo del tasso di calore per ogni iniezione utilizzando l'equazione: =MIN(cell:cell) o MAX(cell:cell). Ogni punto di dati rappresenta il picco di attività enzimatica dell'enzima ad ogni iniezione.
  5. Tracciare grafici dei valori di MIN o MAX contro il tempo in cui il valore si è verificato durante la titolazione.

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Representative Results

I risultati rappresentativi nella Figura 1 e Figura 5 Visualizza dati da due enzimi, lattasi e invertasi. Lattasi e invertasi catalizzare l'idrolisi di un disaccaride in due monosaccaridi, endothermically ed esotermico, rispettivamente. Entrambe le reazioni enzimatiche sono state eseguite alle concentrazioni che ha precluso la saturazione dell'enzima.

I dati di lattasi dimostrano come ITC dati possono essere utilizzati per stimare la stabilità dell'enzima. Quattro sequenziale 4 iniezioni µ l di lattosio 600 mM (Figura 1) sono state titolate in lattasi di 20 mg/mL. Un intervallo di 5.400 s tra ogni iniezione è stata applicata, e questo consente un tempo sufficiente tornare al valore iniziale di riferimento prima di ogni iniezione. Il protocollo descritto sopra è stato effettuato a 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C e 55 ° C. Inoltre, lattosio 600 mM è stato titolato in tampone di acetato di sodio 100 mM solo a 55 ° C come un controllo per il calore di miscelazione. Per ogni iniezione dell'enzima nel substrato, c'è un calore esotermico iniziale di miscelazione, e successivamente la lattasi catalizzata endotermico idrolisi del lattosio si verifica fino a quando la reazione è completata e il tasso di calore restituisce alla linea di base. L'iniezione di lattosio nella soluzione di lattasi viene quindi ripetuto tre volte di più con l'altezza di picco della reazione endotermica da ogni successiva iniezione un po' meno che l'iniezione precedente a causa della diminuzione dell'attività enzimatica. I dati grezzi possono quindi essere convertiti per mostrare il calore di picco rispetto al tempo (Figura 2A-D). L'altezza di picco per ogni iniezione può quindi attaccare ad una regressione lineare e la pendenza indica stabilità enzimatica presso la temperatura scelta. Più negativo la pendenza, la meno stabile l'enzima. Come previsto, la stabilità dell'enzima diminuisce all'aumentare della temperatura (Figura 2E).

Ogni iniezione di lattosio descritto in Figura 1 risultati in diluizione di lattasi. Per dimostrare che questa diluizione non è la causa della diminuzione nell'attività enzimatica, l'analisi di attività della lattasi ITC è stato fatto anche a 25 ° C, la concentrazione di lattasi presso l'iniezione prima e l'ultima iniezione (Figura 3). Questa diluizione provoca una diminuzione dell'8% nell'attività dell'enzima, mentre la quarta iniezione nell'analisi mostra una diminuzione di 73% nell'attività. La diluizione della lattasi durante l'esperimento di quattro-iniezione così ha avuto un effetto relativamente piccolo (cioè, 11%) sull'attività dell'enzima. La perdita effettiva di attività è stato pertanto 73-8 = 65%.

Come accennato nella introduzione uno dei vantaggi dell'utilizzo di ITC è che queste reazioni possono essere fatto in mezzi opachi, come il latte. Per illustrare questa funzionalità di ITC, latte è stato iniettato direttamente nel lattasi (Figura 4). Poiché il pH del latte non è abbinato al buffer di acetato di sodio, c'è un grande calore esotermico di miscelazione immediatamente dopo l'iniezione. Il calore esotermico di miscelazione picco è visto nel controllo che manca di lattasi (Figura 4, linea grigia) e in due iniezioni con latte (Figura 4, nero e linee tratteggiate) dopo il calore del picco di miscelazione. La reazione endotermica che indica attività lattasica si verifica. Il latte contiene una miscela complessa di proteine, vitamine, minerali e lattosio. A causa della complessità di latte, è probabile che altre reazioni si verificano nel corso della nostra reazione. Per dimostrare che il picco endotermico è dovuta all'attività di lattasi, il latte era a spillo con lattosio 146 mM. Nella reazione con il latte lattosio a spillo (Figura 4, linea tratteggiata), il picco endotermico e l'area sotto la curva sono più grandi nel latte da solo (Figura 4, nero linea), che indica che il picco endotermico è infatti dovuto l'attività della lattasi. L'offset della linea di base indica che una reazione lenta continua dopo la reazione di lattosio è finita.

Per dimostrare come questa analisi può essere usata per confrontare la stabilità dell'attività enzimatica di due preparazioni enzimatiche differenti, la stabilità dell'invertasi gratis e invertasi immobilizzato su una membrana di nylon-6 nanofibra sono confrontati in Figura 5 a 35 ° C11 . Come il saggio di lattasi, iniezioni di quattro 4 µ l di saccarosio sono state fatte in sequenza e il tasso massimo calore determinato dall'altezza del picco per ciascuna iniezione. Come illustrato nella Figura 6, le altezze dei picchi diminuiscono linearmente con il tempo che indica l'attività dell'enzima diminuente.

Figure 1
Figura 1 : Tracce dati ITC dell'attività lattasica. Ogni traccia Mostra quattro sequenziale 4 iniezioni µ l 600 mm lattosio in una soluzione di lattasi in tampone a pH 4,6. Le tracce sono state fatte a 55 ° C (nero), 45 ° C (grigio scuro), 35 ° C (tratteggiata), 25 ° C (grigio chiaro) e un senza controllo di enzima (puntinato) a 55 ° C. Le linee rette rappresentano la misura al minimo di picco endotermico dopo ogni iniezione.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Stabilità dell'attività enzimatica sulla base del tasso di cambiamento nel picco di attività. L'attività enzimatica di picco per ciascuno dei quattro iniezioni rispetto al tempo (s) a 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) e 55 ° C (D). La vestibilità lineare dei dati è rappresentata dalla linea solida. Le piste delle linee componibile in parti A-D vengono confrontate con temperatura in EClicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : L'effetto di diluizione di enzima su altezza di picco a 25 ° C. Attività lattasica viene misurata la concentrazione di enzima presso le iniezioni prime e la quarta di 20 mg/mL (nero) e 18,62 mg/mL (grigio), rispettivamente. L'inserto è una zoomata in considerazione l'attività enzimatica di picco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Misurazione dell'attività della lattasi in latte. Traccia ITC di un'iniezione di BYU creamery grasso latte gratuito nel buffer (grigio), latte in lattasi di 20 mg/mL (nera) e latte addizionato con 5% di lattosio ulteriori in 20 mg/mL (puntinato). L'asse y è discontinuo per mostrare la reazione enzimatica endotermico e il calore esotermico di miscelazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Un esempio rappresentativo di come l'analisi di stabilità dell'enzima ITC a 35 ° C potrebbe essere usato per confrontare due diverse preparazioni di invertasi. Le attività di invertasi immobilizzato su una membrana di nanofibra e l'enzima libero sono esposte dalle linee grigie punteggiate e scure, rispettivamente. La linea nera è il controllo con nessun invertasi mostrando solo il calore di miscelazione su scale appropriate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : La relazione lineare tra concentrazione tasso e invertasi calore esotermico di picco dopo un'iniezione di 4 µ l di saccarosio di 600 mM. Questa curva standard può essere utilizzata per determinare la concentrazione di invertasi in un campione sconosciuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Dei principali vantaggi dell'analisi di stabilità dell'enzima ITC descritto qui è l'automazione. Una volta che tutti i buffer appropriato e le soluzioni sono fatte, il tempo di set-up per ogni dosaggio è circa 15 min per la persona che fa il test. Al contrario, i dosaggi convenzionali per attività invertasi e lattasi richiedono circa 2 h con continuo coinvolgimento della persona facendo il test e molti saggi di attività enzimatica prendere considerevolmente più ore per persona. In una pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato come dati dal metodo ITC paragona ad un metodo più tradizionale di spectrophotrometric per invertasi attività11.

Un altro vantaggio del dosaggio ITC è la sua applicabilità a quasi qualsiasi enzima12. Così, testare la stabilità di enzimi diversi in un insieme particolare di condizioni non richiedono configurazione di diversi saggi diversi. Inoltre, il dosaggio ITC è utile per determinare la stabilità dell'attività di un enzima romanzo o di un enzima che non dispone di un saggio colorimetrico adatto.  Il dosaggio ITC può avvenire anche in mezzi opachi che è un grande vantaggio in scienza dell'alimentazione. Poiché la maggior parte delle precedenti saggi di attività enzimatica utilizzano spettrofotometria, fluorescenza o luminescenza per misurare l'attività dell'enzima, essi non sono compatibili con supporti opachi o molto colorati. Anche se questo lavoro dimostra solo l'effetto della temperatura sulla stabilità dell'attività dell'enzima, il metodo ITC è applicabile alla maggior parte delle altre condizioni che influiscono sulla stabilità dell'enzima (ad es., pH, sali, solventi non acquosi e denaturanti).

Come con tutti gli esperimenti ITC, il buffer utilizzato per la soluzione di enzima e substrato deve corrispondere quanto più possibile. Mancata corrispondenza della concentrazione o pH può causare effetti di grande calore che superano la gamma dinamica del calorimetro. Uso dello stesso buffer stock per preparare le soluzioni sia l'enzima e substrato è solitamente sufficiente. Ma se non, le soluzioni possono essere eguagliate da dialisi entrambe le soluzioni contro la stessa soluzione tampone.

Un'ulteriore condizione è che l'enzima non dovrebbe essere saturato di substrato, nel qual caso, l'altezza di picco diventa l'indipendente dalla concentrazione del substrato. Inoltre, il tempo per la reazione di andare al completamento o all'equilibrio tra iniezioni può diventare eccessivo e/o il segnale può superare l'intervallo dinamico del calorimetro. Tuttavia, la concentrazione di substrato deve essere grande abbastanza per fornire un segnale di forte calore. Se l'enzima è substrato saturata, la concentrazione di substrato può essere diminuita o aumentata la concentrazione di enzima. Quando si carica il cellulare calorimetro e la siringa, si deve garantire che nessun bolle sono presente. Se una bolla viene iniettata o rilasciata dalla cella nel corso di un esperimento, causerà un evento anomalo del segnale del tasso di calore.

Il metodo ITC dipende il cambiamento di entalpia di reazione catalizzata e sulla frequenza e quantità di reazione. Se la variazione di entalpia per la reazione è troppo piccolo, il substrato è troppo insolubile o l'enzima non dispone di sufficiente attività, il tasso di calore può essere troppo piccolo per ottenere segnale sufficiente. Inoltre, se l'enzima è inibita da basse concentrazioni dei prodotti, la diminuzione nell'attività enzimatica osservata durante il corso dell'esperimento sarà causata da inibizione del prodotto nonché da perdita di attività nel corso del tempo. Ad esempio, nella titolazione di lattasi, la concentrazione finale di 54 millimetri di glucosio e di galattosio provoca una diminuzione del 27% dell'altezza del picco dell'attività dell'enzima a 55° C (dati non mostrati). Questo è significativamente di meno che la riduzione di 78% dell'altezza del picco da iniezione 1 a iniezione 4 nella Figura 1. Tuttavia, questo può essere corretto misurando l'attività dell'enzima in presenza la concentrazione del prodotto ha raggiunta nel corso del test. Ulteriormente, la titolazione dell'enzima con meno substrato può ridurre la quantità di inibizione del prodotto.

Altre limitazioni possono verificarsi a causa dell'enzima. Ad esempio, con ogni iniezione dell'enzima sarà il diluito. Poiché questa ITC utilizza un vaso di reazione di tracimazione, nel corso dell'esperimento un volume di soluzione equivalente alla dimensione di iniezione viene rimosso con ogni iniezione. Così, una piccola quantità di enzima viene rimosso e i prodotti della reazione di aumentano ad ogni iniezione. Gli effetti di diluizione e la quantità di enzima rimosso possono essere mantenuti piccoli se la dimensione di iniezione è mantenuta piccola, e di conseguenza una grande concentrazione di substrato è spesso necessaria. Perché il rapporto di volume di iniezione al volume del recipiente di reazione è minore in ITCs con grandi recipienti di reazione l'effetto di diluizione è più piccolo del volume basso ITC utilizzato in questo lavoro. Inoltre, ogni reazione per molti enzimi richiederà microgrammi per milligrammo bassa quantità, quindi se avete un enzima che è costoso o difficile da purificare, questo potrebbe vietare l'uso di questo test.

La maggior parte dei problemi che possono sorgere durante questo test sono correlate a una corretta manutenzione e pulizia del recipiente di reazione di ITC. Se l'ITC non raggiunge una linea di base stabile, ciò è spesso dovuto il recipiente di reazione, non essendo sufficientemente pulito. Si consiglia di utilizzare un detergente forte dopo ogni esperimento quando si utilizza proteine in ITC perché proteine possono attaccare per il recipiente di reazione e interferire con la misurazione del tasso di calore. Per una più profonda pulita, una soluzione di acido formico 50% incubata a 55 ° C per fino a 12 h seguita da pulizia con soluzione detergente (Tabella materiali), etanolo e acqua rimuoverà la maggior parte delle sostanze contaminanti.

Infine, poiché l'ITC impiega circa 45 minuti per equilibrare dopo il caricamento di soluzioni, l'attività degli enzimi relativamente instabili o in condizioni marginali potrebbe non essere possibile. Se l'enzima è inattivato durante questo tempo nessun segnale, sarà disponibile o il deperimento può essere troppo veloce dopo la prima iniezione per ottenere dati di stabilità.

Poiché il dosaggio ITC misura direttamente l'attività dell'enzima, può essere esteso a un numero di altri usi. Ad esempio, questo test potrebbe essere fatto con aumento delle concentrazioni di inibitori per determinare che la costante di inibizione, Ki, basato sulla diminuzione nell'attività enzimatica con l'aumento della concentrazione nell'inibitore. Come illustrato nella Figura 5, il presente protocollo può essere adattato per gli enzimi immobilizzati su un supporto solido. Una membrana di nanofibra è stata utilizzata in questo lavoro, ma altri supporti solidi potrebbero essere utilizzati anche se può essere sviluppato un metodo per inserire e rimuovere attraverso il tubo piccolo accesso. Il metodo ITC potrebbe essere esteso anche agli enzimi che sono alterati chimicamente o geneticamente per migliorare la stabilità termica o per determinare la quantità di enzima attivo in un campione sconosciuto (cioè, la figura 6 Mostra la relazione lineare tra picco del tasso di calore concentrazione di altezza e l'enzima).

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Disclosures

Nessuno

Acknowledgments

Nessuno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Lactose Fisher Scientific  unknown (too old) 500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min Alfa Aesar A13184-30 250g
Lactase  MP Bio 100780 5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N  Fisher Scientific  SA48-500 500mL
Benchtop Meter- pH VWR 89231-622
Ethanol 70% Fisher Scientific  BP8231GAL 1gallon
Micro-90 Fisher Scientific  NC024628 1L (cleaning solution)

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References

  1. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  2. Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
  3. Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
  4. van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
  5. Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
  6. Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
  7. Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
  8. Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
  9. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
  10. Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
  11. Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
  12. Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).

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Chan, W. K. D., Mason, M., Hansen,More

Chan, W. K. D., Mason, M., Hansen, L. D., Kenealey, J. D. Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry. J. Vis. Exp. (145), e59302, doi:10.3791/59302 (2019).

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