Summary
酵素の熱安定性は、等温滴定型熱量計 (ITC) によって容易に測定されます。ほとんどの蛋白質の安定性の試金は現在メジャー タンパク質の変性を使用、酵素活性についての情報を提供しません。ITC は、酵素活性の安定性に関する酵素の変更の効果の直接測定できます。
Abstract
この作品は、等温滴定熱量測定 (ITC) による酵素活性の安定性を測定するための新しいメソッドを示します。酵素活性と相関している酵素液に基板の解決の単回投与後の観察のピーク熱速度。時間をかけて同じ酵素溶液に基板の複数の注射は、酵素活性の損失を示します。アッセイ、自律、非常に少しの担当者の時間を必要とするほとんどのメディアおよび酵素に適用されます。
Introduction
酵素は、蛋白質多彩な有機反応を触媒することができます。過酷な溶剤の使用を避けるため中性付近の水溶液でほとんど酵素機能。選択性が高く、酵素触媒反応生成少ない (いくつかのケースでは、副産物) 酸および塩基の1のような非選択性触媒よりも副産物。これは最終製品が人間の消費のために安全であるのですべての化学反応を行う必要がある食品の製造に特に関連します。現在、酵素は、高果糖コーン シロップ2チーズ3ビール4牛乳の乳糖無料5、およびその他の重要な食品の製造に使用されます。本稿では、食品産業における酵素利用、緑の化学、医薬品合成などの酵素のための他の多くの用途があります。
酵素の有用性は、酵素の立体構造を維持するのに依存する酵素活性の安定性によって制限されます。酵素の構造は、peg 修飾操作6、しっかりサポート7、遺伝の修正の8、および製剤の固定化などの変更により安定化することができます。現在、示差走査熱量測定 (DSC) で酵素の安定性通常計測、エンドポイント酵素試金9。DSC 測定温度で酵素が繰り広げられます。温度が高いほど安定した構造。ただし、活動の損失は多くの場合酵素または酵素10内のドメインを展開するために必要なよりも低い温度で発生します。したがって、DSC は酵素修飾酵素活性の安定性が向上するかどうかを判断するのに十分ではありません。エンドポイント酵素試金は通常集中の時間、複数のサンプルを必要とする、高い色または不透明なソリューションまたは懸濁液には適用されません結合比色反応も多い。
この作品は、等温滴定熱量測定 (ITC) による酵素活性の安定性の直接測定法を示します。ITC は、リリースや反応の中に吸収される熱の率を測定します。ほぼすべての反応生成熱を吸収するので、ミルクなど不透明なメディアの結合反応を持っていないか、発生する反応を含む、ほとんどの酵素触媒反応の ITC を使用できます。ITC は、反応の多くの種類の化学動力学的パラメーターを計測する何十年も使用されていますが、ここで提示されたプロトコル ITC を使用して酵素触媒反応のピーク熱率の計測に着目し、酵素活性が直線状にあることを示して熱のピークの速度と相関した.ピーク熱率の ITC 測定主自律やほとんど人件費をセットアップし、分析が必要です。
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Protocol
1. 試料の準備
-
0.1 M 酢酸緩衝液 ph 4.6 の 1,000 mL
- 800 mL の卒業 1,000 mL のビーカーに蒸留水を測定します。
- 無水ナトリウムのアセテートの 8.2 グラムの重量を量る、それをビーカーに追加します。
- 撹拌プレートにビーカーを置き、ビーカーに攪拌ロッドを置く、攪拌プレートをオンに、完全に溶けるまでかき混ぜます。
- 無水ナトリウムのアセテートが完全に解散したときは、校正 pH メーターで、溶液の pH を測定します。
- 目的 pH 4.6 を取得にそれに応じて 1 M 塩酸または水酸化ナトリウムを追加します。
- 総容積が 1,000 mL になるまで蒸留水を追加します。
- 使用するまで常温で保存します。
-
酵素液
- 酵素ソリューション 15 mL に 0.1 M のナトリウム酢酸バッファー pH 4.6 の最初の測定 8 mL で 10-30 mg/mL の範囲内で卒業したシリンダー 10 mL を準備します。
- 酵素と 15 mL の円錐管に緩衝液を追加し、酵素が溶けるまで、積極的に振る。
- 総容積が 10 mL になるまでより多くの緩衝液を追加します。
- 使用するまで 4 ° C で酵素液を格納します。
-
基板の解決
- 300-600 mM の範囲で基板の解決を準備するには、望ましい集中にグラムで必要な基質の量を計算します。
- 基板重量を量り、100 mL のガラス製ビーカーに
- 25 mL のメスシリンダーのシリンダーを用いた緩衝液 20 mL を測定し、ガラス ビーカーに追加します。
- 撹拌プレートにビーカーを置き、ビーカーに電磁攪拌棒を配置します。暖房をつけて、攪拌速度を調整します。
- 基板が解散するまで継続する攪拌を許可します。
- 50 mL の円錐管に基質溶液を注ぐし、総容量が 45 mL になるまで 0.1 M ナトリウム酢酸バッファー pH 4.6 を追加します。振って混ぜます。
- 使用するまで保管常温基板ソリューションです。
2. 実験を実行します。
- ITC 計測器の準備
- 参照セルが蒸留水の 350 μ L でロードされていることを確認します。サンプル セルに酵素をロードする前に、サンプル細胞を掃除されていることを確認します。
- プロトコル-塗りつぶし 2% 洗浄液 (材料表) の 500 μ L で読み込みシリンジを洗浄、サンプル セルに慎重に針を挿入、セルを記入、同じ注射器を使用して液体をゆっくりと除去。ビーカーに液体を破棄します。70% のエタノールと 2% 洗浄液 (材料表) で 2 回この手順を 3 回繰り返すし、蒸留水で 10 倍を洗います。
- 450 μ L の酵素液で読み込みシリンジをいっぱいサンプル セルの下部に針を挿入、慎重にゆっくりと気泡の形成を防ぐために 100 μ L の線までプランジャーを押します。
- 針の先端を水の中に配置し、ゆっくりと、注射器に水を取って、廃棄物容器に水を分配して 3 回蒸留水 50 μ L 滴定シリンジを洗浄します。
- 基板の解決と 3 回洗浄によって残留水を削除します。
- 注射器は空気の泡なしいっぱいまでソリューションを描画することによって基板の解決の滴定シリンジを入力します。
- 基板の解決にまだシリンジとプランジャーを取り外し、約 2 μ L の空気注射器の上部に入力し、プランジャーを挿入を許可します。
- ITC のビュレットのハンドルを取り外してビュレット ハンドル内注射器を配置までタイトなネジします。
- 糸くずの組織と攪拌機の先端を拭く、ITC 楽器にビュレットのハンドルを配置し、慎重に場所でロックします。
3 ITCrun の設定
- コンピューターで、 ITCrunを開き、設定をクリックします。
- 攪拌率をクリックし、350 RPM に設定します。シリンジ サイズ (μ L) を確認し、50 μ L であることを確認します。
- 温度を設定し、更新を押します。この手順を実行することをお勧めしますが、ITC を準備する前に少なくとも 1 時間。これはヒートアップまたは必要に応じて冷却器に十分な時間をことができます。
- 実験のセットアップでは、増分の滴定を選択します。
- 注射をセットアップする挿入をクリックします。5,400 に射出間隔を調整 s、4 と番号 4 に注入する注入量 (μ L)。設定を確認する[ok]を押します。
- 平衡ボックス、自動平衡し、大予想加熱を選択します。(1 つが期待される加熱下で小さな選択できます予想される加熱が小さい場合; ただし、この平衡化時間が長くなります)。
- 最初のベースラインは 300 に設定 s。
- 実行、クリックを開始するには、開始攪拌率の横にある記号し、開始レンチ シンボルの横にあるをクリックします。
- ファイルを保存し、実行する楽器を許可します。
4 データの分析
- NanoAnalyze でファイルを開きます。データをクリックし、データの列を選択します。
- すべてのデータを選択、コピー、および Microsoft Excel にデータを貼り付けます。
- 300 で必要な値を追加することによってゼロのベースラインを調整する s ゼロします。この補正を熱率値の列全体に適用されます。
- 式を使用して各注射用熱率の最小値または最大値を見つける: =MIN(cell:cell) または MAX(cell:cell)。各データ ポイントは、各注入で酵素の酵素の活動のピークを表します。
- 滴定の間に値が発生した時間に対して MIN または MAX 値のグラフをプロットします。
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Representative Results
図 1と図 5に代表的な結果は、2 つの酵素ラクターゼおよびインベルターゼからデータを表示します。ラクターゼおよびインベルターゼは、endothermically と発熱を汎って、それぞれに 2 つの単糖類に、二糖類の加水分解を触媒します。両方の酵素反応は、酵素の飽和を妨げ濃度で実行しました。
ラクターゼ データは、ITC データことができます使用して酵素の安定性を推定する方法をデモンストレーションします。600 mM 乳糖 (図 1) の 4 連続 4 μ L 注入で 20 mg/mL ラクターゼに滴定します。5,400 の間隔各注入の間 s を適用し、これにより、各注入の前に最初のベースラインに戻るのに十分な時間。上記で説明したプロトコルは 25 ° C、35 ° C、45 ° C、および 55 ° C で行われました。また、600 mM の乳糖は混合熱のコントロールとして 100 mM 酢酸緩衝液のみで 55 ° C に滴定。基板への酵素の各注入、混合の初期発熱熱があるし、反応が完了し、熱率のベースラインを返しますまで続いて乳糖乳糖分解酵素触媒による吸熱加水分解が発生します。乳糖乳糖分解酵素のソリューションへの注入は繰り返されます各後続の注入から吸熱反応のピークの高さをさらに 3 回少し前の注射よりも酵素活性が低下しています。Raw データは、時間 (図 2 a-d) に比例したピーク熱を変換できます。各注入のピークの高さは、線形回帰に合うことができる、斜面が選択した温度で酵素の安定性を示します。負の勾配の少ない安定した酵素です。予想通り、酵素の安定性 (図 2 e) 温度の上昇とともに減少します。
乳糖はラクターゼの希釈により、図 1に記載の各注入。この希釈が酵素活性の低下の原因ではないことを示すため、ITC 乳糖分解酵素の活性も最後の注入 (図 3)、最初の注射で乳糖分解酵素濃度 25 ° C で行われました。この希釈結果酵素活性の 8% 減少、対しアッセイの第四注入活性の 73% の減少を示しています。4 注入実験における、乳糖分解酵素の希釈したがっていた影響は比較的小さい (すなわち、11%)酵素活性。活動の実際の損失したがって 73 8 = 65%。
前述のように ITC を使用しての導入の利点の 1 つは牛乳などの不透明なメディアでこれらの反応を行うことができます。この ITC の機能を示すためには、ミルクは乳糖分解酵素 (図 4) に直接注入されます。牛乳の pH はナトリウム酢酸バッファーに一致していない、ために、混合注射の直後の大発熱熱があります。混合ピークの発熱の熱は、ピークを混合熱後、ラクターゼ (図 4、灰色の線) を欠いているコントロールおよびミルク (図 4黒とドットのライン) と 2 つの注射を見られています。ラクターゼ活性を示す吸熱反応が発生します。牛乳には、タンパク質、ビタミン、ミネラル、および乳糖の複雑な混合物が含まれています。ミルクの複雑さ、他の反応が私たちの反応の過程で発生すると考えられます。ラクターゼの活動により吸熱ピークが示すために、ミルクは 146 mM 乳糖のスパイクだった。スパイク乳糖牛乳 (図 4点線) との反応、吸熱ピークと曲線下面積が牛乳に単独で (図 4、黒線)、吸熱ピークがラクターゼの活動により実際にことを示すよりも大きい。ベースライン オフセットは、遅い反応は続く乳糖反応が終了することを示します。
この試金を使用して、2 つの異なる酵素製剤の酵素活性の安定性を比較する方法を示すため、図 5に無料インベルターゼとナイロン 6 ナノファイバー膜上に固定されたインベルターゼの安定性の比較 35 ° c11.乳糖分解酵素アッセイのようにショ糖の 4 4 μ L 注入が順番に行われた、最大熱率は各注入のピークの高さから決定されます。図 6のように、ピーク高さ減少時間減少酵素活性を示す直線的。
図 1: ラクターゼ活性の ITC データ トレース。各トレースは、pH 4.6 バッファー内のラクターゼ ソリューションに 600 mM の 4 連続 4 μ L 注入乳糖を示しています。トレースは 55 ° C (黒) で行われた 45 ° C (濃い灰色)、35 ° C (破線)、25 ° C (薄い灰色)、および 55 の ° C の (ドット) ない酵素コントロール直線は、次の各注入吸熱ピーク最小にフィットを表しています。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 活動のピークの変化率に基づく酵素活性の安定性。55 ° C (D) 45 ° C (C)、35 ° C (B) 25 ° C (A) 時間 (秒) を基準にして 4 回の注射ごとに酵素活性のピーク。データの線形フィットは実線で表されます。A ~ Dの部分でフィット ラインの斜面はEの温度に対してプロットされます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 25 のピーク高さに酵素の希釈の効果 ° Cラクターゼ活性はそれぞれ 20 mg/mL (黒) と 18.62 mg/mL (グレー) の最初と 4 番目の注射で酵素の濃度で測定されます。はめ込みは酵素の活動のピークで拡大されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 牛乳の乳糖分解酵素活性を測定します。BYU クリーマリー無脂肪牛乳バッファー (グレー) に、20 mg/mL ラクターゼ (黒) に牛乳と牛乳 20 mg/mL (点線) に 5% 追加乳糖とスパイクの注入の ITC トレース。Y 軸は吸熱反応の酵素反応を示し、混合発熱熱に不連続です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 35 ° C で ITC 酵素安定性試金を使用して、インベルターゼの 2 つの異なる製剤を比較する方法の代表的な例です。インベルターゼ ナノファイバー膜と遊離酵素固定化の活動は、それぞれ点線および暗い灰色の線で示されます。黒い線は、適切なスケールで混合の熱だけを見せないインベルターゼとコントロールです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 600 mM ショ糖の 4 μ L 注入ピーク発熱熱率およびインベルターゼ濃度の線形関係。この標準曲線は、インベルターゼ未知試料の濃度を決定するために使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明した ITC 酵素安定性分析の主な利点は自動化です。すべての適切なバッファーおよび解決が行われると、各測定のセットアップ時間はアッセイを行う人のため約 15 分です。対照的に、インベルターゼ、ラクターゼの活動の従来の試金はアッセイを行う人の継続的な関与と約 2 時間を必要とし、多くの酵素活性アッセイを取るかなり増えた。前の文書では、インベルターゼ活性11より伝統的な spectrophotrometric 方法と ITC メソッドからデータを比較する方法を説明してきました。
ITC 試験の別の利点は、ほぼすべての酵素12への適用性です。したがって、特定の条件下での異なる酵素の安定性のテストにはいくつかの異なるアッセイの設定必要はありません。また、ITC の試金は新規酵素または適切な比色定量法を持たない酵素の活性の安定性を判断するのに役立ちます。 ITC アッセイは、食品科学の主要な利点である不透明なメディアで行うことができます。以来、酵素のほとんどの前のアッセイは、酵素活性を測定する発光、蛍光、吸光光度法を使用して、不透明なまたは強い色のメディアと互換性がありません。この作品は、酵素活性の安定性に対する温度の効果だけを示して、ITC メソッドは (例えば、pH、塩、非水溶媒および変性剤) 酵素の安定性に影響を与える他のほとんどの条件に該当します。
ITC のすべての実験と同様、酵素と基質の解決のために使用されるバッファーはできるだけ密接に一致しなければなりません。濃度や pH の不一致カロリメータのダイナミック レンジを超える大規模な熱効果があります。酵素と基質の両方のソリューションを準備する同じ在庫バッファーの使用は通常は十分です。しかし、同じ緩衝液に対して両方のソリューションをおこしがソリューションに一致する場合でも。
それ以上の条件は酵素の飽和基板はならない、その場合、ピーク高さ基質濃度の独立者はなります。また、注射の間に完了または平衡反応の時間が過度になることができますおよび/または信号はカロリメータのダイナミック レンジを超えることができます。ただし、基質濃度は強い熱信号を提供するために十分な大きさである必要があります。酵素が飽和する基板の場合、基質濃度を減少することができます、または酵素濃度が増加しました。熱量計セルと注射器を読み込みとき気泡が存在しない必要があります。バブルは注入か、実験の過程で、細胞から解放、それは熱率信号の異常イベントを引き起こします。
ITC メソッドは触媒反応のエンタルピー変化、速度、反応の量に依存します。反応のエンタルピー変化が小さすぎる、基板はあまりにも溶ける、または酵素に十分な活動がない、熱率は十分な信号を取得するには小さすぎるかもしれない。さらに、製品の低濃度で酵素が抑制され、観察、実験の過程で酵素活性の低下を産物阻害および活動の損失によって時間の経過になってしまいます。たとえば、ラクターゼ滴定 54 mM グルコースとガラクトースの最終濃度は 55 ° C (データは示されていない) で酵素活性のピーク高さの 27% 減少を引き起こします。これは図 1の注入 4 注射 1 からピーク高さの 78% 減少を大幅に下回るです。しかし、これは、アッセイのコース中に到達した製品の濃度の存在下で酵素活性を測定することによって修正できます。さらに、以下の基板を用いた酵素を滴定生産物阻害の量を減らすことができます。
その他の制限は、酵素のため発生します。たとえば、各注入と酵素は、希釈されます。この ITC は、オーバーフローの反応容器を使用しているので実験の過程で溶液注入サイズと同等のボリュームが各注入と削除されます。したがって、少量の酵素が削除され、各注入の反作用の製品が増加します。削除される酵素の量と希釈の効果保つことができる小さな注入サイズは小さく、基板の大規模な濃度が必要なため。反応容器に対する射出体積の比は大きく反応容器と ITCs で小さいので、希釈効果は低量この作業で使用する ITC のより小さい。また、多くの酵素の各反応低ミリグラム量マイクログラムが必要になりますので、高価なまたは浄化することは困難である酵素があれば、これはこの試金の使用を禁止する可能性があります。
この試金の時に発生する問題のほとんどは、適切な維持管理に関連して ITC 反応容器の洗浄です。ITC が安定したベースラインが到達しない場合、これは多くの場合十分にきれいなされていない反応容器原因です。タンパク質が反応容器に固執することができるので、熱率測定と干渉、ITC でタンパク質を使用する場合、各実験の後強力な洗剤を使用してお勧めします。深いきれいな洗浄液 (資材表)、エタノール、水と洗浄が続く 12 h まで 55 ° C で培養した 50% ギ酸溶液がほとんど汚染物質を除去します。
最後に、ITC は、平衡ソリューションを読み込み後に約 45 分かかるので比較的不安定な酵素または最底限の条件の下で活動できない場合があります。この中に酵素が不活化される場合時間信号がない、できない、または崩壊可能性があります安定性のデータを取得する最初の注射後も迅速であります。
ITC アッセイは、酵素活性を測定する直接するためは、他の用途の数を拡張できます。たとえば、この試金は阻害定数 Ki、阻害剤濃度を増加させると酵素活性の低下に基づいて決定する阻害剤濃度の増加を行うことができます。図 5のように、このプロトコルは固体支持体に固定化した酵素の合わせることができます。ナノファイバーの膜は、この作品で使用されていたが、挿入し、小さなアクセス管を通してそれを削除する方法を開発することができる場合にも、他の固体サポートが使用します。ITC メソッドは、熱的安定性を改善するためにまたは未知の試料の活性酵素の量を決定する化学的にまたは遺伝的に変更されている酵素に拡張すること(すなわち、図 6に示します熱率ピークの線形関係高さと酵素濃度)。
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Disclosures
どれも
Acknowledgments
どれも
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
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