Måle enzymatisk stabilitet av isotermiske titrering Calorimetry

Summary

Termisk stabilitet av enzym aktivitet måles lett isotermiske titrering calorimetry (ITC). De fleste protein stabilitet analyser for tiden brukt mål protein utspiller seg, men gir ikke informasjon om enzymatisk aktivitet. ITC kan direkte fastsettelse av effekten av enzymet modifikasjoner på stabiliteten av enzym aktivitet.

Abstract

Dette arbeidet demonstrerer en ny metode for å måle stabiliteten av enzym aktivitet av isotermiske titrering calorimetry (ITC). Topp varme hastigheten observert etter en enkelt injeksjon av substratløsningen i et enzym løsning er korrelert med enzym aktivitet. Flere injeksjoner av underlaget i samme enzym løsningen over tid viser tap av enzym aktivitet. Analysen er autonome, krever lite personell tid, og de fleste medier og enzymer.

Introduction

Enzymer er proteiner i stand til å utløse en rekke organiske reaksjoner. De fleste enzymer funksjon i vandig løsning på nær nøytral pH dermed unngår bruk av sterke løsemidler. På grunn av deres høye selektivitet, katalysert enzymreaksjoner produserer færre (i noen tilfeller ingen biprodukter) biprodukt enn ikke-selektive katalysatorer som syrer og baser¹. Dette er spesielt relevant i mat foredling der alle kjemiske reaksjoner må gjøres så det endelige produktet er trygg for menneskelig konsum. Foreløpig brukes enzymer til å produsere høy fruktose mais sirup², ost³, øl⁴, laktose-fri melk⁵og andre viktige matvarer. Mens dette papiret fokuserer på enzymet bruk i næringsmiddelindustrien, er det mange andre bruksområder for enzymer inkludert i grønn kjemi og narkotika syntese.

Nytten av enzymer er begrenset av stabiliteten av enzym aktivitet, som avhenger av opprettholde tredimensjonale strukturen av enzymet. Enzym strukturen kan stabiliseres av modifikasjoner som PEGylation⁶, immobilisering på en solid støtte⁷, genetiske modifikasjoner⁸og formuleringer. Foreløpig enzym stabilitet måles vanligvis differensial skanning calorimetry (DSC) og sluttpunktet enzym aktivitet søk⁹. DSC måler temperaturen som utfolder seg et enzym; det høyere temperaturen, mer stabil struktur. Imidlertid forekommer tap av aktivitet ofte ved lavere temperatur enn nødvendig å utfolde det enzym eller domener i enzym¹⁰. Derfor er DSC ikke tilstrekkelig til å fastslå om en enzym modifikasjon øker stabiliteten på enzymaktiviteten. Endepunktet enzym analyser er vanligvis tidkrevende, krever flere eksempler, og ofte innebære en kombinert kolorimetrisk reaksjon som ikke gjelder for svært farget eller ugjennomsiktig løsninger eller suspensjoner.

Dette arbeidet viser en metode for direkte måling av stabiliteten av enzym aktivitet ved isotermiske titrering calorimetry (ITC). ITC måler varme eller opptatt i løpet av en reaksjon. Siden nesten alle reaksjoner produsere eller absorberer varme, kan ITC brukes til de fleste enzym-katalysert reaksjoner, inkludert reaksjoner som ikke har en kombinert reaksjon eller oppstår i ugjennomsiktig medier som melk. ITC har vært brukt i mange tiår for å måle kjemiske kinetic parametere for mange typer reaksjoner, men protokollen presenteres her fokuserer på bruk av ITC for å måle peak varme hastigheten enzym-katalysert reaksjoner og viser at enzym aktivitet er lineært korrelert med topp varme hastighet. ITC målinger av topp varme er hovedsakelig autonome og krever lite personell tid å setup og analysere.

Protocol

1. klargjør prøver

1. 1000 mL 0.1 M natrium acetate buffer ved pH 4.6
   1. Måle 800 mL destillert vann i et 1000 mL uteksaminert beaker.
   2. Veie 8.2 g vannfri natrium acetate og legge den til begeret.
   3. Legg begeret på en røre tallerken, plassere rør stang i begeret, slå på rør platen og rør til fullstendig oppløst.
   4. Når vannfri natrium acetate er fullstendig oppløst, kan du måle pH av løsningen med en kalibrert pH-meter.
   5. Legg 1 M HCl eller NaOH tilsvarende for å få ønsket pH 4.6.
   6. Legg destillert vann til det totale volumet er 1000 mL.
   7. Lagre ved romtemperatur før bruk.
2. Enzym løsning
   1. Forberede 10 mL av enzymet løsning innen 10-30 mg/mL av første måler 8 mL 0.1 M natrium acetate buffer pH 4.6 i en 15 mL uteksaminert sylinder.
   2. Legg til buffer løsning i en 15 mL konisk rør med enzym og rist kraftig frem enzymet er oppløst.
   3. Legge til flere buffer løsning til det totale volumet er 10 mL.
   4. Lagre enzym løsningen på 4 ° C før bruk.
3. Substratløsningen
   1. For å forberede en substratløsningen innen 300-600 mM, beregne mengden substrat måtte gram gjøre ønskede konsentrasjonen.
   2. Veie ut underlaget og plasser i en 100 mL glass kanne
   3. Måler 20 mL buffer løsning med en 25 mL uteksaminert sylinder og deretter legge den til glasset begeret.
   4. Legg begeret på en røre tallerken og plasser magnetic røre stang i begeret. Slå på varmen, og justere omrøring hastigheten deretter.
   5. Tillate stirring å fortsette til underlaget er oppløst.
   6. Hell substratløsningen i en 50 mL konisk rør og legge 0.1 M natrium acetate buffer pH 4.6 til det totale volumet er 45 mL. Bland ved risting.
   7. Lagre substratløsningen ved romtemperatur før bruk.

2. utføre eksperimentet

1. Forbereder ITC instrumentet
   1. Kontroller at referansen cellen er lastet med 350 µL destillert vann. Før du legger enzymet i eksempel cellen, kontroller at prøven cellen har blitt renset.
   2. Rengjøring protokollen fylle lasting sprøyten med 500 µL av 2% rengjøringsmiddel (Tabell for materiale), nøye inn nålen eksempel cellen, fylle cellen og sakte Fjern væsken bruker samme sprøyten. Kast væsken i et beaker. Gjenta dette trinnet to ganger med 2% rengjøringsmiddel (Tabell for materiale), tre ganger med 70% etanol, og deretter vaske ti ganger med destillert vann.
   3. Fyller lasting sprøyten med 450 µL av enzymet løsning, nøye sette inn nålen helt til bunnen av prøven cellen og trykker stempelet til 100 µL linjen sakte for å hindre dannelse av luftbobler.
   4. Vask 50 µL titrering sprøyten med destillert vann tre ganger ved å plassere nålen i vannet så sakte tar opp vannet i sprøyten, og utlevering vannet i en avfallsbeholderen.
   5. Fjern gjenværende vann av skylling med substratløsningen tre ganger.
   6. Fyll sprøyten titrering med substratløsningen ved løsningen til sprøyten er full uten noen luftbobler.
   7. Sprøyten fremdeles i substratløsningen, fjerne stempelet og tillate ca 2 µL av luft for å angi øverst på sprøyten og sette inn stempelet.
   8. Fjerne buret håndtaket ITC, plassere sprøyten inne i buret håndtaket og skru til stramt.
   9. Tørk spissen av rørestang med en lofri vev, og forsiktig plassere buret håndtaket i ITC instrumentet og låse den på plass.

3. sette opp ITCrun

1. På datamaskinen, åpner ITCrun og klikker Definer.
2. Klikk omrøring hastigheten satt til 350 RPM. Kontroller sprøyte størrelsen (µL) og sikre det er på 50 µL.
3. Still temperatur og trykk oppdateringen. Det anbefales at dette trinnet utføres minst 1 time før forberede ITC. Dette tillater nok tid for instrumentet å varme opp eller kjøle deg ned etter behov.
4. Velg trinnvis titrering eksperimentoppsettet.
5. Klikk Sett inn å sette injeksjoner. Justere injeksjon intervallet til 5400 s, injeksjon volum (µL) til 4 og antall injeksjoner til 4. Trykk OK for å bekrefte innstillingene.
6. Velg Auto-equilibrate og stor forventet varmeri balanse-boksen. (Hvis de forventede varmer er liten, kan man velge små under forventet varmer, men dette vil øke balanse tid.)
7. Angi den første grunnlinjen til 300 s.
8. Starte løpe, klikk Start symbol ved omrøring hastigheten og deretter starte som fastnøkkel symbolet.
9. Lagre filen og at maskinen skal kjøre.

4. analysere data

1. Åpne filen i NanoAnalyze. Klikk Data og velg datakolonner.
2. Velg alle data, kopiere og deretter lime inn dataene i Microsoft Excel.
3. Justere null planlagt ved å legge til verdien kreves for 300 s å gjøre det null. Gjelde endringen for hele kolonnen av varme verdier.
4. Finne den minste eller største verdien av varme rate for hver injeksjon ved ligningen: =MIN(cell:cell) eller MAX(cell:cell). Hvert datapunkt representerer toppen enzymatiske aktiviteten av enzymet på hver injeksjon.
5. Tegne diagrammer av MIN- eller MAX verdier mot tidspunktet som verdien oppstod under Serine.

Representative Results

Representant resultatene i figur 1 og figur 5 viser data fra to enzymer, laktase og invertase. Laktase og invertase katalysere hydrolyse av et smakløst i to monosaccharides, endothermically og exothermically, henholdsvis. Begge enzymatiske reaksjoner ble kjørt i konsentrasjoner som utelukket metning av enzymet.

Laktase dataene viser hvordan ITC data kan brukes til å beregne enzym stabilitet. Fire sammenhengende 4 µL injeksjoner av 600 mM laktose (figur 1) var titreres i 20 mg/mL laktase. Et intervall på 5400 s mellom hver injeksjon ble brukt, og dette tillater nok tid til å gå tilbake til den første opprinnelige planen før hver injeksjon. Protokollen beskrevet ovenfor ble utført ved 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C og 55 ° C. I tillegg var 600 mM laktose titreres til 100 mM natrium acetate buffer bare ved 55 ° C som en kontroll for varmen av miksing. For hver injeksjon av enzym i underlaget, det er en innledende eksoterm varme blanding, og senere laktase katalysert endoterm hydrolyse av laktose oppstår før reaksjonen er fullført og varme hastigheten tilbake til den opprinnelige planen. Injeksjon av laktose i laktase løsningen er så gjentatt tre ganger med topp høyde av endoterm reaksjon fra hver etterfølgende injeksjon litt mindre enn foregående injeksjon på grunn av nedgangen av enzymatisk aktivitet. Rådata kan deretter konverteres for å vise toppen varmen i forhold til tid (figur 2A-D). Topp høyden for hver injeksjon kan deretter være passer til en lineær regresjon og skråningen angir enzym stabilitet på valgte temperaturen. Mer negativ skråningen, mindre stabile enzymet. Som forventet, avtar enzym stabilitet med økende temperatur (figur 2E).

Hver injeksjon av laktose beskrevet i figur 1 resultater i fortynning av laktase. For å demonstrere at dette fortynning ikke er årsaken til nedgangen i enzymatisk aktivitet, ble ITC laktase aktivitet analysen også utført ved 25 ° C, laktase konsentrasjonen på første injeksjon og siste injeksjon (Figur 3). Dette fortynning resulterer i en 8% nedgang i enzym aktivitet, mens den fjerde injeksjonen i analysen viser en 73% nedgang i aktivitet. Fortynning av laktase under fire-injeksjon eksperimentet dermed hadde en relativt liten effekt (dvs. 11%) på enzymaktiviteten. Faktiske tap av aktivitet var derfor 73-8 = 65%.

Som nevnt i er innføringen en av fordelene med å bruke ITC at disse reaksjonene gjøres i ugjennomsiktig medier, som melk. For å demonstrere denne funksjonen i ITC, ble melk injisert direkte inn i laktase (Figur 4). PH i melk ikke er samsvarer med natrium acetate bufferen, er det en stor eksoterm varme blanding umiddelbart etter injeksjon. Eksoterm varmen av miksing topp sett i kontrollen som mangler laktase (Figur 4, grå linjen) og to injeksjoner med melk (Figur 4, svart og prikkete linjer) etter varmen av miksing peak. Endoterm reaksjon indikerer laktase aktivitet oppstår. Melk inneholder en kompleks blanding av proteiner, vitaminer, mineraler og laktose. På grunn av kompleksiteten i melk er det sannsynlig at andre reaksjonene i løpet av vår reaksjon. For å demonstrere at endoterm toppen skyldes laktase aktivitet, var melk tilsatt 146 mM laktose. I reaksjon med laktose piggete melk (Figur 4, prikket linje) er endoterm peak og området under kurven større enn i melk alene (Figur 4, svart linje), som indikerer at endoterm toppen er virkelig laktase aktiviteten. Grunnlinjeforskyvningen angir at en treg reaksjon fortsetter etter laktose reaksjonen er fullført.

For å demonstrere hvordan denne analysen kan brukes til å sammenligne stabiliteten av enzymatisk aktivitet to forskjellige enzym forberedelser, sammenlignes stabiliteten av gratis invertase og invertase immobilisert på en nylon-6 nanofiber membran i figur 5 på 35 ° C¹¹ . Som laktase analysen, 4 fire µL injeksjoner av sukrose ble gjort sekvensielt og maksimalt varme prisen bestemmes av topp høyden for hver injeksjon. Som vist i figur 6, redusere peak høydene lineært tid indikerer nedadgående enzym aktivitet.

Figur 1 : ITC data spor laktase aktivitet. Hvert spor viser fire sammenhengende 4 µL injeksjoner av 600 mM laktose til en laktase løsning i pH 4.6 buffer. Spor ble gjort ved 55 ° C (svart), 45 ° C (mørk grå), 35 ° C (stiplet), 25 ° C (lys grå) og en ingen enzym kontroll (prikket) på 55 ° C. De rette linjene representerer passer til endoterm peak minimum etter hver injeksjon.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Stabilitet av enzym aktivitet basert på graden av endring i topp aktivitet. Topp enzymatiske aktiviteten for hver av fire injeksjoner i forhold til tid (s) ved 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) og 55 ° C (D). Den lineære passformen til dataene er representert ved den heltrukne linjen. Av montert linjene i deler A-D plottes mot temperatur i E.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Effekten av enzymet fortynning på topp høyde på 25 ° C. Laktase aktivitet måles på enzymet konsentrasjonen på første og fjerde injeksjoner av 20 mg/mL (svart) og 18.62 mg/mL (grå), henholdsvis. Rammemargen er en zoomet i lys av topp enzymaktiviteten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Måler laktase aktivitet i melk. ITC spor av en injeksjon av BYU creamery gratis lettmelk i buffer (grå), melk i 20 mg/mL laktase (svart) og melk tilsatt 5% ekstra laktose i 20 mg/mL (prikket). Y-aksen er usammenhengende vise reaksjonen endoterm enzym og eksoterm varmen blanding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 : Et representativt eksempel på hvordan ITC enzym stabilitet analysen på 35 ° C kan brukes til å sammenligne to forskjellige preparater av invertase. Aktiviteter invertase immobilisert nanofiber membran og gratis enzym vises etter den prikkete og mørk grå linjer, henholdsvis. Den svarte linjen er kontrollen med ingen invertase viser bare varmen blanding på riktig nivå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6 : Lineær forholdet mellom topp eksoterm varme rate og invertase konsentrasjon etter en 4 µL injeksjon av 600 mM sukrose. Denne standardkurve kan brukes til å bestemme konsentrasjonen av invertase i en ukjent prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En stor fordel for ITC enzym stabilitet analysen beskrevet her er automatisering. Når alle aktuelle buffere og løsninger er gjort, er oppsett-tid for hver analysen ca 15 min for personen gjør analysen. I kontrast, de konvensjonelle analyser for invertase og laktase aktivitet krever ca 2 timer med kontinuerlig involvering av personen gjør analysen og mange enzymatisk aktivitet analyser ta betydelig konstant. I en tidligere publikasjon, har vi vist hvordan data fra metoden ITC sammenlignet med en mer tradisjonell spectrophotrometric metode for invertase aktivitet¹¹.

En annen fordel med ITC analysen er brukbarheten til nesten alle enzym¹². Derfor krever teste stabiliteten i forskjellige enzymer under et bestemt sett med betingelser ikke definere flere forskjellige analyser. Dessuten er ITC analysen nyttig for å bestemme stabiliteten i aktiviteten av en roman enzym eller av et enzym som ikke har en passende kolorimetrisk analysen.  ITC analysen kan også gjøres i ugjennomsiktig media som er en stor fordel i mat. Siden de fleste tidligere analyser av enzym aktivitet bruker spectrophotometry, fluorescens eller luminescence måle enzym aktivitet, er de ikke kompatibel med ugjennomsiktig eller svært farget. Selv om dette arbeidet viser bare effekten av temperatur på stabiliteten av enzym aktivitet, er ITC metoden gjelder for de fleste andre forhold som påvirker enzym stabilitet (f.eks pH, salter, ikke-vandig løsemidler og denaturing agenter).

Som med alle ITC eksperimenter, tilsvare bufferen for det enzym og underlaget så tett som mulig. Mellom den konsentrasjon eller pH kan føre til store varme effekter som overstiger dynamiske område på calorimeter. Bruk av samme lager bufferen å forberede både enzym og underlaget løsninger er vanligvis tilstrekkelig. Men hvis ikke, løsningene kan matches av dialyzing både løsninger mot den samme buffer løsningen.

Et ytterligere vilkår er at enzymet ikke bør substrat mettet, i så fall, topp høyden blir uavhengig av underlaget konsentrasjon. Også tiden for reaksjonen å gå til ferdigstillelse eller likevekt mellom injeksjoner kan bli overdreven og/eller signalet kan overskride dynamiske område på calorimeter. Men må substrat konsentrasjonen være stor nok til å gi en sterk varme signal. Hvis enzymet substrat mettet, substrat konsentrasjonen kan reduseres, eller enzym konsentrasjonen økt. Når du legger den calorimeter cellen og sprøyte, må ettall sikre at ingen er bobler. Hvis en boble er injisert eller løslatt fra cellen i løpet av et eksperiment, får det unormalt hendelse i varme rate signalet.

Metoden ITC er avhengig entalpi endring av catalyzed reaksjonen og på hastighet og mengde reaksjon. Hvis entalpi endringen for reaksjonen er for liten, underlaget er også uløselig eller enzymet har ikke tilstrekkelig aktivitet, være varme hastigheten for liten til å få tilstrekkelig signal. I tillegg hvis enzymet er hemmet av lave konsentrasjoner av produktene, vil nedgangen i enzymatisk aktivitet observert i løpet av eksperimentet være forårsaket produktet hemming og tap av aktivitet over tid. For eksempel i laktase-titrering forårsaker siste konsentrasjonen av 54 mM glukose og galaktose en 27% nedgang i topp høyden på enzymaktiviteten ved 55° C (data ikke vist). Dette er betydelig mindre enn den 78% nedgangen i topp høyde fra injeksjon 1 injeksjon 4 i figur 1. Men kan dette korrigeres ved å måle enzymaktiviteten i nærvær av produktet konsentrasjonen nådd i løpet av analysen. Videre kan titrating enzymet med mindre underlaget redusere mengden produkt hemming.

Andre begrensninger kan oppstå på grunn av enzymet. For eksempel med hver injeksjon blir enzymet den utvannet. Denne ITC bruker en overflyt reaksjon fartøyet, i løpet av eksperimentet er et volum på løsning tilsvarer injeksjon størrelsen fjernet med hver injeksjon. Således, en liten mengde enzym fjernes, og produkter av reaksjonen øker med hver injeksjon. Effekten av fortynning og mengden av enzymet fjernet kan holdes liten hvis injeksjon størrelsen er holdt liten, og derfor en stor konsentrasjon av underlaget er ofte nødvendig. Fordi injeksjon volum reaksjon fartøyet volumet er mindre i ITCs med større reaksjon fartøy er fortynning effekten mindre enn i lavt volum ITC brukt i dette arbeidet. I tillegg hver reaksjon for mange enzymer krever mikrogram til lav mg mengder, så hvis du har et enzym dyrt eller vanskelig å rense, dette kan forby bruk av denne analysen.

De fleste av problemene som kan oppstå under denne analysen er knyttet til riktig vedlikehold og rengjøring av ITC reaksjonen fartøyet. Hvis ITC ikke når en stabil plan, er dette ofte på grunn av reaksjon fartøyet ikke er tilstrekkelig ren. Vi anbefaler å bruke en sterk vaskemiddel etter hvert eksperiment når du bruker proteiner i ITC fordi proteiner kan holde seg til reaksjonen fartøyet og forstyrre den varme målingen. For en dypere ren, en 50% maursyre løsning ruges ved 55 ° C i opptil 12 h etterfulgt av rengjøring med rengjøringsmiddel (Tabell for materiale), etanol og vann vil fjerne de fleste forurensninger.

Til slutt, fordi ITC tar ca 45 min å equilibrate etter lasting løsninger, aktiviteten av relativt ustabil enzymer eller under marginale forhold kan ikke være mulig. Hvis enzymet er inaktiv i løpet av denne tiden noe signal, vil være tilgjengelig eller forfallet er for rask etter første injeksjon å anskaffe stabilitet.

Fordi ITC analysen direkte tiltak enzym aktivitet, kan det bli utvidet til en rekke andre bruker. Denne analysen kan for eksempel gjøres med økende konsentrasjoner av en inhibitor for å bestemme hemming konstanten, Ki, basert på nedgangen i enzym aktivitet med økende hemmer konsentrasjon. Som vist i figur 5, kan denne protokollen tilpasses for immobilisert enzymer på en solid støtte. En nanofiber membran ble brukt i dette arbeidet, men andre solid støtter også kunne brukes hvis en metode for å sette inn og fjerne det gjennom små tilgang røret kan utvikles. Metoden ITC kan også bli utvidet til enzymer som er endret kjemisk eller genetisk å forbedre termisk stabilitet eller å bestemme mengden av aktiv enzym i en ukjent prøve (dvs., figur 6 viser lineær forholdet mellom varme hastighet peak høyde og enzym konsentrasjon).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)