Summary
A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.
Abstract
Este trabalho demonstra um novo método para medir a estabilidade da actividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de calor máxima observada após uma única injeção da solução de substrato em uma solução de enzima está correlacionada com a atividade da enzima. Múltiplas injeções do substrato para a mesma solução de enzima ao longo do tempo mostram a perda da atividade enzimática. O ensaio é autónomo, exigindo pouco tempo pessoal e é aplicável à maioria dos meios de comunicação e enzimas.
Introduction
As enzimas são proteínas capazes de catalisar uma ampla gama de reações orgânicas. Função da maioria das enzimas em solução aquosa a perto de pH neutro, evitando assim o uso de solventes ásperos. Por causa de sua alta seletividade, reacções enzimáticas catalisadas produzem menos (em alguns casos, sem subprodutos) subprodutos do que não-seletivo catalizadores tais como ácidos e bases1. Isto é especialmente relevante na fabricação de alimentos onde todas as reações químicas devem ser feitas para que o produto final é seguro para consumo humano. Atualmente, as enzimas são usadas para produzir alta frutose xarope de milho2, queijo3, cerveja4, leite sem lactose5e outros produtos alimentares importantes. Enquanto este artigo centra-se na utilização de enzimas na indústria de alimentos, existem muitos outros usos para enzimas, incluindo na síntese química e droga verde.
O utilitário de enzimas é limitado pela estabilidade da atividade enzimática, que depende de manter a estrutura tridimensional da enzima. A estrutura da enzima pode ser estabilizada por modificações como PEGylation6, imobilização em um suporte sólido7, as modificações genéticas8e formulações. Atualmente, a estabilidade da enzima é normalmente medida por Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e9ensaios de atividade enzimática de ponto de extremidade. DSC mede a temperatura na qual uma enzima se desenrola; Quanto maior a temperatura, mais estável a estrutura. No entanto, a perda de atividade ocorre frequentemente em uma temperatura mais baixa do que o necessário para desdobrar a enzima ou domínios dentro do enzima10. Portanto, DSC não é suficiente para determinar se uma modificação da enzima aumenta a estabilidade da atividade enzimática. Ensaios enzimáticos de ponto de extremidade são geralmente tempo intensivo, requerem amostras múltiplas e muitas vezes envolvem uma reação colorimétrica acoplada que não é aplicável para soluções altamente coloridas ou opacas ou suspensões.
Este trabalho demonstra um método para a medição direta da estabilidade da atividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC mede a taxa de calor liberado ou absorvido durante o curso de uma reação. Desde que quase todas as reações produzem ou absorvem calor, ITC pode ser usado para a maioria das reações catalisada por enzimas, incluindo reações que não têm uma reação de acoplamento ou ocorrem em meios opacos, como leite. ITC tem sido usado por muitas décadas para medir parâmetros de cinéticos químicos para muitos tipos de reações, mas o protocolo apresentado aqui se concentra no uso ITC para medir a taxa de pico de calor de reações catalisadas por enzimas e demonstra que a atividade da enzima é linearmente correlacionada com a taxa de pico de calor. ITC medições de taxas de pico de calor na maior parte são autônomas e exigem muito pouco tempo pessoal para configurar e analisar.
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Protocol
1. preparação de amostras
-
1.000 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M em pH 4,6
- Medir a 800 mL de água destilada num copo graduado de 1.000 mL.
- Pesa 8,2 g de acetato de sódio anidro e adicioná-lo para o copo.
- Coloque o copo sobre um prato de agitar, colocar uma haste de agitação no copo medidor, ligue a placa de agitação e mexa até dissolver completamente.
- Quando o acetato de sódio anidro é completamente dissolvido, medir o pH da solução com um medidor de pH calibrado.
- Adicione 1 M de HCl ou NaOH em conformidade para obter o pH desejado 4.6.
- Adicione água destilada até que o volume total é de 1.000 mL.
- Armazenar em temperatura ambiente até o uso.
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Solução de enzima
- Prepare-se 10 mL do cilindro de solução dentro da faixa de 10-30 mg/mL por primeira medição 8 mL do 0,1 M de sódio Acetato tampão pH 4.6 em um 15 mL formou-se a enzima.
- Adicionar a solução-tampão em um tubo cônico de 15 mL com enzima e agitar vigorosamente até dissolver a enzima.
- Adicione mais solução-tampão, até que o volume total é de 10 mL.
- Armazene a solução de enzima a 4 ° C até o uso.
-
Solução de substrato
- Para preparar uma solução de substrato dentro da faixa de 300-600 mM, calcule a quantidade de substrato necessário em gramas para fazer a concentração desejada.
- Pesar o substrato e colocar em um copo de vidro de 100 mL
- Medir 20 mL da solução-tampão usando um cilindro graduado de 25 mL e adicioná-lo para o copo de vidro.
- Coloque o copo sobre um prato de agitar e colocar uma haste de agitação magnética para o copo. Ligue o calor e ajustar a velocidade de agita em conformidade.
- Permitir que mexendo para continuar até que o substrato se dissolva.
- Despeje a solução de substrato em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 0,1 M de sódio Acetato tampão pH 4.6 até o volume total é de 45 mL. Misturar por agitação.
- Armazene a solução de substrato à temperatura ambiente até o uso.
2. realizando o experimento
- Preparando o instrumento ITC
- Certifique-se de que a referência de célula é carregada com 350 µ l de água destilada. Antes de carregar a enzima na célula de amostra, verifique se que a célula de amostra ter sido limpo.
- Limpeza de protocolo-encha a seringa de carregamento com 500 µ l de solução de limpeza de 2% (Tabela de materiais), insira cuidadosamente a agulha para a célula de amostra, preencher a célula e retire lentamente o líquido usando a mesma seringa. Descarte o líquido para um copo. Repetir esta etapa duas vezes com 2% de solução de limpeza (Tabela de materiais), três vezes com etanol 70% e em seguida lavar dez vezes com água destilada.
- Encha a seringa de carregamento com 450 µ l de solução enzimática, cuidadosamente, introduza a agulha até a parte inferior da célula de amostra e pressione o êmbolo até a linha de 100 µ l lentamente para evitar a formação de bolhas de ar.
- Lave a seringa de titulação de 50 µ l com água destilada três vezes, colocando a ponta da agulha em água e depois lentamente levando a água para a seringa, em seguida, dispensando a água em um recipiente de resíduos.
- Remova a água residual por uma lavagem com solução de substrato três vezes.
- Encha a seringa de titulação com solução de substrato, desenhando-se a solução até que a seringa está cheia sem quaisquer bolhas de ar.
- Com a seringa ainda na solução de substrato, retire o êmbolo e deixe aproximadamente 2 µ l de ar a entrar no top da seringa e insira novamente o êmbolo.
- Retire a alça buret do ITC, coloque a seringa dentro da alça buret rosca e até apertar.
- Limpe a ponta do agitador com um pano livre de fiapos, depois cuidadosamente coloque a alça buret dentro do instrumento ITC e bloqueá-la.
3. criação de ITCrun
- No computador, abra o ITCrun e clique em Configurar.
- Clique em taxa de agitação e conjunto para 350 RPM. Verifique o tamanho da seringa (µ l) e se é em 50 µ l.
- Definir a temperatura e clique em Update. Recomenda-se que esta etapa seja realizada pelo menos 1 h antes de preparar o ITC. Isso permite tempo suficiente para o instrumento aquecer ou refrigerar para baixo, conforme necessário.
- Para a instalação do experimento, selecione titulação incremental.
- Clique em Inserir para configurar as injeções. Ajustar o intervalo de injeção para 5.400 s, volume de injeção (µ l) 4 e o número de injeções para 4. Pressione Okey para confirmar as configurações.
- Na caixa de equilibração, selecione Autoequilibrar e grande esperado aquece. (Se o esperado aquece-se pequeno, um pode selecionar pequenos sob aquece esperado; no entanto, isto irá aumentar o tempo da equilibração).
- Definir a linha de base inicial para 300 s.
- Para iniciar a execução, clique a começar símbolo ao lado de taxa de agitação e, em seguida, clique Iniciar que está localizado ao lado do símbolo de chave.
- Salve o arquivo e permitir que o instrumento executar.
4. análise de dados
- Abra o arquivo em NanoAnalyze. Clique em dados e selecionar as colunas de dados.
- Selecionar todos os dados, copiar e colar os dados para o Microsoft Excel.
- Ajustar o zero da linha de base, adicionando o valor exigido em 300 s para torná-lo zero. Aplica esta correção de toda a coluna de valores de taxa de calor.
- Encontrar o valor mínimo ou máximo da taxa de calor para cada injeção usando a equação: =MIN(cell:cell) ou MAX(cell:cell). Cada ponto de dados representa a atividade enzimática de pico da enzima em cada injeção.
- Plotar gráficos dos valores MIN ou MAX contra o tempo em que o valor ocorreu durante a titulação.
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Representative Results
Os resultados representativos na Figura 1 e Figura 5 mostram dados de duas enzimas, lactase e a invertase. Lactase e a invertase catalisam a hidrólise de um dissacarídeo em dois monossacarídeos, endothermically e exotermicamente, respectivamente. Ambas as reações enzimáticas foram executadas em concentrações que impediam a saturação da enzima.
Os dados de lactase demonstram como ITC dados podem ser usados para estimar a estabilidade da enzima. Quatro sequencial 4 injeções µ l de lactose 600 mM (Figura 1) foram tituladas em lactase de 20 mg/mL. Um intervalo de 5.400 s entre cada injeção foi aplicada, e isso permite tempo suficiente retornar à linha de base inicial antes de cada injeção. O protocolo descrito acima foi realizado em 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C e 55 ° C. Além disso, à lactose 600mm foi titulada em tampão de acetato de sódio 100 mM somente a 55 ° C, como um controle para o calor da mistura. Para cada injecção da enzima no substrato, há um calor exotérmico inicial da mistura, e posteriormente a lactase catalisada endotérmica hidrólise da lactose ocorre até que a reação é concluída e a taxa de calor retorna à linha de base. A injeção de lactose na solução de lactase é então repetida três vezes mais com a altura do pico da reação endotérmica de cada injeção subsequente um pouco menos do que a injeção anterior devido a diminuição da atividade enzimática. Os dados brutos, em seguida, podem ser convertidos para mostrar o calor do pico em relação ao tempo (Fig. 2A-D). A altura do pico para cada injecção pode então estar apto para uma regressão linear e a inclinação indica a estabilidade da enzima à temperatura escolhida. Os mais negativo a inclinação, o menos estável a enzima. Como esperado, a estabilidade da enzima diminui com o aumento da temperatura (Figura 2E).
Cada injecção de lactose descrita na Figura 1 resulta em diluição de lactase. Para demonstrar que esta diluição não é a causa da diminuição na atividade enzimática, o ensaio de atividade de lactase ITC também foi feito a 25 ° C, a concentração de lactase, a primeira injeção e a última injeção (Figura 3). Esta diluição resulta em uma diminuição de 8% na atividade da enzima, Considerando que a quarta injeção no ensaio mostra uma diminuição de 73% na atividade. A diluição da lactase durante a experiência de quatro-injeção, portanto, teve um efeito relativamente pequeno (ou seja, 11%) na atividade da enzima. A perda real de atividade foi, portanto, 73-8 = 65%.
Conforme mencionado na introdução uma das vantagens de usar o ITC é que estas reações podem ser feitas em mídia opaca, tais como o leite. Para demonstrar essa capacidade do ITC, leite foi injetado diretamente lactase (Figura 4). Porque o pH do leite não é correspondido com o tampão de acetato de sódio, há um grande calor exotérmico da mistura imediatamente após a injeção. O calor exotérmico do pico misturando é visto no controle que carece de lactase (Figura 4, linha cinza) e em duas injeções com leite (Figura 4, preto e linhas pontilhadas) apresentarem o calor da mistura de pico. Ocorre a reação endotérmica indicando atividade de lactase. O leite contém uma mistura complexa de proteínas, vitaminas, minerais e lactose. Devido à complexidade de leite, é provável que outras reações ocorrem durante o curso da nossa reação. Para demonstrar que o pico endotérmico é devido à atividade de lactase, o leite foi cravado com lactose 146 mM. Na reação com o leite à lactose cravado (Figura 4, linha pontilhada), o pico endotérmico e a área sob a curva são maiores do que no leite sozinho (Figura 4, preto linha), indicando que o pico endotérmico é realmente devido à atividade de lactase. O deslocamento de linha de base indica que uma reação lenta continua após a reação à lactose é terminada.
Para demonstrar como este ensaio pode ser usado para comparar a estabilidade da atividade enzimática de duas preparações diferentes de enzima, a estabilidade da enciclopédia invertase e a invertase imobilizada em uma membrana de nylon-6 Nanofibras são comparadas na Figura 5 a 35 ° C11 . Como o ensaio de lactase, injeções de quatro 4 µ l de sacarose foram feitas sequencialmente e a taxa de calor máximo determinado a partir da altura do pico para cada injeção. Como mostrado na Figura 6, as alturas de pico diminuem linearmente com o tempo, indicando a diminuição de atividade da enzima.
Figura 1 : Traços de dados ITC de atividade da lactase. Cada traço mostra quatro sequencial 4 injeções µ l de 600 mM à lactose em uma solução de lactase em tampão de pH 4.6. Os traços foram feitos a 55 ° C (preto), 45 ° C (cinza escuro), 35 ° C (tracejado), 25 ° C (cinza claro) e um não controle de enzima (pontilhado) a 55 ° C. As linhas retas representam o ajuste para o mínimo de pico endotérmico após cada injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Estabilidade da atividade da enzima baseado na taxa de mudança na atividade de pico. A atividade enzimática de pico para cada um dos quatro injeções em relação ao tempo (s) a 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) e 55 ° C (D). O ajuste linear dos dados é representado pela linha sólida. As encostas das linhas cabidas em partes A-D são plotadas contra temperatura em mi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : O efeito de diluição de enzima na altura do pico em 25 ° C. Atividade de lactase é medida a concentração de enzima em injeções a primeira e a quarta de 20 mg/mL (preto) e 18,62 mg/mL (cinza), respectivamente. A inserção é uma ampliada, tendo em conta a actividade das enzimas de pico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Medindo a atividade da lactase no leite. Rastreamento ITC de uma injeção de BYU cremosa gordura livre do leite em buffer (cinza), leite em lactase de 20 mg/mL (preto) e leite cravado com lactose adicional de 5% em 20 mg/mL (pontilhado). O eixo y é descontínuo para mostrar a reacção enzimática endotérmica e exotérmico calor da mistura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Um exemplo representativo de como o ensaio de estabilidade de enzima ITC a 35 ° C pode ser usado para comparar duas preparações diferentes de invertase. As atividades de invertase imobilizada em uma membrana de nanofibras e enzima livre são mostradas pelas linhas pontilhadas e escuras cinza, respectivamente. A linha preta é o controle com nenhum invertase mostrando apenas o calor da mistura em escalas adequadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : A relação linear entre o Pico exotérmico calor taxa e a invertase concentração após uma injeção de 4 µ l de sacarose de 600 mM. Esta curva padrão pode ser usada para determinar a concentração de invertase em uma amostra desconhecida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma grande vantagem do ensaio de estabilidade de enzima do ITC descrito aqui é automação. Uma vez que todos os buffers de adequadas e soluções são feitas, o tempo de set-up para cada ensaio é aproximadamente 15 min. para a pessoa que faz o ensaio. Em contraste, os ensaios convencionais para atividade de invertase e lactase requerem cerca de 2 h com envolvimento contínuo da pessoa fazendo o ensaio e muitos ensaios de atividade enzimática levar consideravelmente mais de homens-hora. Em uma publicação anterior, demonstrámos como dados do método ITC de compara a um método mais tradicional de spectrophotrometric para a invertase atividade11.
Outra vantagem do ensaio do ITC é sua aplicabilidade para quase qualquer enzima12. Assim, testar a estabilidade das enzimas diferentes sob um determinado conjunto de condições não requer configuração vários ensaios diferentes. Além disso, o ITC é útil para determinar a estabilidade da atividade de uma enzima de romance ou de uma enzima que não tem um ensaio colorimétrico adequado. O ensaio ITC também pode ser feito em mídia opaca, que é uma grande vantagem em ciência dos alimentos. Desde que a maioria dos ensaios anteriores de atividade enzimática usam espectrofotometria, fluorescência ou luminescência para medir a atividade da enzima, eles não são compatíveis com mídia altamente coloridas ou opaca. Embora este trabalho demonstra apenas o efeito da temperatura sobre a estabilidade da atividade da enzima, o método ITC é aplicável à maioria das outras condições que afetam a estabilidade da enzima (por exemplo, pH, sais, solventes não aquosos e agentes de desnaturação).
Tal como acontece com todas as experiências do ITC, o buffer usado para a solução de enzima e substrato deve corresponder tanto quanto possível. Incompatibilidade do pH ou concentração pode causar efeitos de calor grande que excedem o alcance dinâmico do calorímetro. Uso a mesma reserva de estoque para preparo de soluções a enzima e o substrato é geralmente suficiente. Mas se não, as soluções podem ser igualadas por dializando ambas as soluções contra a mesma solução-tampão.
Uma outra condição é que a enzima não deve ser o substrato saturado, nesse caso, a altura torna-se independente da concentração de substrato. Além disso, o tempo para a reação de ir até a conclusão ou ao equilíbrio entre as injeções pode tornar-se excessivo e/ou o sinal pode exceder o intervalo dinâmico do calorímetro. No entanto, a concentração de substrato deve ser grande o suficiente para fornecer um sinal de forte calor. Se a enzima está saturado de substrato, a concentração de substrato pode ser diminuída, ou aumentou a concentração de enzima. Ao carregar o celular do calorímetro e a seringa, um deve garantir que não há bolhas estão presentes. Se uma bolha é injectada ou liberada da célula no decurso de uma experiência, ela gerará um evento anômalo no sinal de taxa de calor.
O método ITC é dependente sobre a mudança de entalpia da reação catalisada e sobre a taxa e a quantidade de reação. Se a mudança de entalpia para a reação é muito pequena, o substrato é muito insolúvel ou a enzima não tem atividade suficiente, a taxa de calor pode ser demasiado pequena para obter sinal suficiente. Além disso, se a enzima é inibida por baixas concentrações dos produtos, a diminuição da atividade enzimática observada durante o curso do experimento será causada pela inibição do produto, bem como pela perda da atividade ao longo do tempo. Por exemplo, na titulação lactase, a concentração final de 54 mM glicose e galactose provoca uma diminuição de 27% da altura do pico da atividade da enzima a 55° C (dados não mostrados). Isto é significativamente menor do que a diminuição de 78% da altura do pico de injeção 1 a injeção 4 na Figura 1. No entanto, isso pode ser corrigido através da medição da atividade enzimática na presença da concentração do produto alcançada no decorrer do ensaio. Além disso, titulada a enzima com menos substrato pode reduzir a quantidade de inibição do produto.
Outras limitações podem ocorrer por causa da enzima. Por exemplo, com cada injeção a enzima será o diluídos. Porque esta ITC usa um recipiente de reação de estouro, durante o curso do experimento, um volume de solução equivalente ao tamanho de injeção é removido com cada injeção. Assim, uma pequena quantidade de enzima é removida, e os produtos da reação aumentam com cada injeção. Os efeitos de diluição e a quantidade de enzima removida podem ser mantidos pequenos se o tamanho de injeção é mantido pequeno, e, portanto, uma grande concentração de substrato é muitas vezes necessária. Porque a relação do volume de injeção de volume do recipiente de reação é menor na EIC com vasos de reação maiores o efeito de diluição é menor do que no volume baixo ITC utilizado neste trabalho. Além disso, cada reação para muitas enzimas exigirá micrograma para miligrama baixas quantidades, então se você tem uma enzima que é caro ou difícil de purificar, isto poderia proibir o uso deste teste.
A maioria das questões que podem surgir durante este ensaio está relacionadas com a manutenção adequada e limpeza da embarcação da reação do ITC. Se o ITC não atingir uma base estável, isto é frequentemente devido a embarcação da reação não ser suficientemente limpa. Recomendamos usar um detergente forte após cada experimento quando usando proteínas em ITC porque proteínas podem manter a embarcação da reação e interferir com a medição de taxa de calor. Para uma mais profunda limpa, uma solução de ácido fórmico 50% incubada a 55 ° C por até 12 h seguido de limpeza com solução de limpeza (Tabela de materiais), etanol e água irá remover a maioria dos contaminantes.
Finalmente, o ITC leva cerca de 45 min para equilibrar-se após o carregamento de soluções, a atividade de enzimas relativamente instáveis ou sob condições marginais pode não ser possível. Se a enzima é inativada durante este tempo sem sinal, estará disponível ou a decadência pode ser muito rápida após a primeira injeção para obter dados de estabilidade.
Porque o ensaio da ITC diretamente mede a atividade da enzima, ele pode ser estendido a um número de outros usos. Por exemplo, este ensaio poderia ser feito com o aumento da concentração de um inibidor para determinar que a constante de inibição, Ki, baseia-se a diminuição da atividade da enzima com o aumento da concentração de inibidor. Como mostrado na Figura 5, este protocolo pode ser adaptado para enzimas imobilizadas em um suporte sólido. Neste trabalho, utilizou-se uma membrana de nanofibras, mas outros suportes sólidos também poderiam ser usados se pode ser desenvolvido um método para inserir e removê-lo através do tubo de acesso pequeno. O método ITC também pode ser estendido para as enzimas que são alteradas quimicamente ou geneticamente para melhorar a estabilidade térmica ou para determinar a quantidade de enzima activa em uma amostra desconhecida (isto é, a Figura 6 mostra a relação linear entre o pico de taxa de calor concentração de altura e enzima).
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
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