Mäta enzymatisk stabilitet av isotermiska titrering Kalorimetri

Summary

Den termiska stabiliteten av enzymaktiviteten mäts lätt genom isotermiska titrering calorimetry (ITC). De flesta protein stabilitet analyser för närvarande används åtgärd protein utspelas, men ger inte information om enzymaktivitet. ITC möjliggör direkt bestämning av effekten av enzymet ändringar på stabiliteten av enzymaktivitet.

Abstract

Detta arbete visar en ny metod för att mäta stabiliteten av enzymaktivitet av isotermiska titrering calorimetry (ITC). Den topp värme hastighet observerats efter en enstaka injektion substratlösningen i en enzym-lösning är korrelerad med enzymaktivitet. Flera injektioner av substratet i samma enzym lösning över tiden visar förlust av enzymaktivitet. Analysen är autonoma, som kräver väldigt lite tid för personal, och gäller till de flesta media och enzymer.

Introduction

Enzymer är proteiner som kan katalysera en mängd organiska reaktioner. De flesta enzymer funktion i vattenlösning med nära neutralt pH därmed undvika användning av starka lösningsmedel. På grund av deras hög selektivitet, katalyseras enzymreaktioner producerar färre (i vissa fall inga biprodukter) biprodukter än icke-selektiva katalysatorer t.ex. syror och baser¹. Detta är särskilt relevant i livsmedel tillverkning där alla kemiska reaktioner måste göras så att den slutliga produkten är säker för konsumtion. För närvarande används enzymer att producera hög-fruktos majssirap², ost³, öl⁴, laktosfri mjölk⁵och andra viktiga livsmedel. Medan denna uppsats fokuserar på enzym användning inom livsmedelsindustrin, finns det många andra användningsområden för enzymer inklusive grön kemi och läkemedel syntes.

Nyttan av enzymer begränsas av stabiliteten av enzymaktivitet, vilket beror på att upprätthålla den tredimensionella strukturen av enzymet. Enzymet strukturen kan stabiliseras av ändringar, till exempel Pegylering⁶, immobilisering på ett fast stöd⁷, genmodifieringar⁸och formuleringar. För närvarande enzym stabiliteten mäts vanligtvis genom differential scanning calorimetry (DSC) och endpoint enzymaktivitet analyser⁹. DSC mäter temperaturen vid vilken ett enzym utspelar sig; ju högre temperatur, desto mer stabil struktur. Förlust av aktivitet sker dock ofta vid en lägre temperatur än nödvändigt för att veckla upp det enzym eller domäner inom de enzym¹⁰. Därför räcker det inte med DSC för att avgöra huruvida ett enzym ändring ökar stabiliteten av enzymaktivitet. Endpoint enzym analyser är oftast tid intensivt, kräver flera prover och innebär ofta en kopplat kolorimetrisk reaktion som inte gäller för starkt färgade eller ogenomskinliga lösningar eller suspensioner.

Detta arbete visar en metod för direkt mätning av enzymaktivitet stabilitet genom isotermiska titrering calorimetry (ITC). ITC mäter graden av värme släppt eller absorberas under loppet av en reaktion. Eftersom nästan alla reaktioner producerar eller absorbera värme, kan ITC användas för de flesta enzymkatalyserade reaktioner, inklusive reaktioner som inte har en kopplat reaktion eller uppstå i ogenomskinliga media såsom mjölk. ITC har använts under många decennier för att mäta kemiska kinetiska parametrar för många typer av reaktioner, men protokollet presenteras här fokuserar på att använda ITC för att mäta peak värme frekvensen av enzymkatalyserade reaktioner och visar att enzymaktiviteten är linjärt korrelerade med maximal värme. ITC mätningar av peak värme priser är mestadels autonoma och kräver väldigt lite personal tid att setup och analysera.

Protocol

1. förbereda prover

1. 1000 mL 0,1 M natrium acetatbuffert med pH 4,6
   1. Mäta 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL graderad bägare.
   2. Väger 8,2 g vattenfri natriumacetat och lägga till bägaren.
   3. Placera bägaren på en uppståndelse tallrik, placera en uppståndelse stav i bägaren, slå på uppståndelse plattan och rör tills helt upplöst.
   4. När den vattenfri natriumacetat är helt upplöst, mäta pH-värdet i lösningen med en kalibrerad pH-mätare.
   5. Lägg till 1 M HCl eller NaOH med detta för att erhålla önskad pH 4,6.
   6. Tillsätt destillerat vatten tills den totala volymen är 1 000 mL.
   7. Förvara i rumstemperatur fram till användning.
2. Enzymet lösning
   1. Förbereda 10 mL av enzymet lösning inom intervallet 10-30 mg/mL genom att första mäta 8 mL av 0,1 M natrium acetat buffert pH 4,6 i en 15 mL graderade cylindern.
   2. Tillsätt buffertlösningen i en 15 mL konisk slang med enzym och skaka kraftigt tills enzymet är upplöst.
   3. Tillsätt mer buffertlösning tills den totala volymen är 10 mL.
   4. Lagra enzym lösningen vid 4 ° C fram till användning.
3. Substratlösning
   1. För att förbereda en substratlösningen inom intervallet 300-600 mM, beräkna mängden substrat behövs i gram för att göra önskad koncentration.
   2. Väg upp substratet och placera i en 100 mL-glasbägare
   3. Mät upp 20 mL av buffertlösningen med en 25 mL graderad cylinder och sedan lägga till glasbägaren.
   4. Placera bägaren på en uppståndelse tallrik och placera en magnetiska rör stav i bägaren. Slå på värmen och justera omrörning hastigheten.
   5. Tillåta omrörning för att fortsätta tills underlaget är upplöst.
   6. Substratlösningen och häll i en 50 mL konisk tub 0,1 M natrium acetat buffert pH 4,6 tills den totala volymen är 45 mL. Blanda genom att skaka.
   7. Lagra substratlösningen i rumstemperatur fram till användning.

2. utför experimentet

1. Förbereda ITC instrumentet
   1. Kontrollera att cellen referens laddas med 350 µL destillerat vatten. Innan du laddar enzymet i cellen prov, verifierar du att cellen prov har städats.
   2. Rengöring protokoll-fylla lastning sprutan med 500 µL av 2% rengöringslösning (Tabell för material), försiktigt in nålen i cellen provet, fyll cellen och avlägsna sakta den vätskan som använder samma spruta. Släng vätskan i en bägare. Upprepa detta två gånger med 2% rengöringslösningen (Tabell för material), tre gånger med 70% etanol och tvätta sedan tio gånger med destillerat vatten.
   3. Fyll sprutan lastning med 450 µL enzym lösning, försiktigt in nålen hela vägen till botten av cellen prov och tryck kolven ner till raden 100 µL långsamt för att förhindra bildandet av luftbubblor.
   4. Tvätta 50 µL titrering sprutan med destillerat vatten tre gånger genom att placera nålspetsen i vatten långsamt tar upp vatten i sprutan och sedan dispenseras vattnet i en avfallsbehållare.
   5. Ta bort kvarstående vatten genom att skölja med substratlösningen tre gånger.
   6. Fyll sprutan titrering med substratlösningen genom att rita lösningen tills sprutan är full utan eventuella luftbubblor.
   7. Med sprutan fortfarande i substratlösningen, avlägsna kolven och låt ca 2 µL av luft in i toppen av sprutan och sätt tillbaka kolven.
   8. Ta bort byrett handtaget av ITC, placera sprutan inuti handtagets byrett och skruva tills tight.
   9. Torka av spetsen på omröraren med en luddfri vävnad, och sedan försiktigt placera byrett handtaget i ITC instrument och låsa den på plats.

3. ställa in ITCrun

1. Öppna ITCrun på datorn, och klicka på Ställ in.
2. Klicka på omrörning kurs och satt till 350 RPM. Kontrollera sprutan storlek (µL) och det är på 50 µL.
3. Ställa in temperatur och tryck på Uppdatera. Det rekommenderas att detta steg utföras minst 1 h innan du förbereder ITC. Detta tillåter tillräckligt med tid för instrumentet att värma eller kyla som behövs.
4. För experiment inställningar, Välj stegvis titrering.
5. Klicka på Infoga för att ställa injektionerna. Justera intervallet injektion till 5 400 s, Injektionsvolym (µL) 4 och antalet injektioner till 4. Tryck på OK för att bekräfta inställningarna.
6. Jämviktstiden rutanVälj Auto-jämvikt och stora förväntade värmer. (Om det förvänta heaten är små, en kan välja små under förväntade värmer, men detta kommer att öka Jämviktstiden tiden.)
7. Ange den första originalplanen till 300 s.
8. För att starta kör, klicka starta symbol bredvid omrörning rate och klicka sedan på starta som ligger bredvid symbolen skiftnyckel.
9. Spara filen och låt instrumentet att köra.

4. analysera data

1. Öppna filen i NanoAnalyze. Klicka på Data och välj datakolumner.
2. Markera alla data, kopiera och klistra in data i Microsoft Excel.
3. Justera noll originalplan genom att lägga till värdet som krävs på 300 s att göra det noll. Gäller denna korrigering för hela kolumnen av värme värden.
4. Hitta det lägsta eller högsta värdet av värme för varje injektion med hjälp av ekvation: =MIN(cell:cell) eller MAX(cell:cell). Varje datapunkt representerar den peak enzymatiska aktiviteten av enzymet vid varje injektion.
5. Rita grafer över MIN eller MAX värden mot den tidpunkt vid vilken värdet uppstod under titrering.

Representative Results

Representativa resultaten i figur 1 och figur 5 visar data från två enzym, laktas och invertas. Laktas och invertas katalyserar hydrolysen av en disackarid till två monosackarider, endothermically och exotermt, respektive. Båda enzymatiska reaktioner kördes vid koncentrationer som förhindrat mättnad av enzymet.

Laktas data visar hur ITC data kan användas för att uppskatta enzym stabilitet. Fyra sekventiella 4 µL injektioner av 600 mM laktos (figur 1) var titreras till 20 mg/mL laktas. Ett intervall på 5 400 s mellan varje injektion tillämpades, och detta tillåter tillräckligt med tid att återgå till den ursprungliga baslinjen före varje injektion. Protokollet beskrivs ovan utfördes vid 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C och 55 ° C. Dessutom titrerades 600 mM laktos till 100 mM natrium acetatbuffert endast vid 55 ° C som en kontroll för värmen i blandning. För varje injektion av enzym substrat, det finns en inledande exotermiska värme att blanda, och därefter laktas katalyseras endoterma hydrolys av laktos sker tills reaktionen är klar och den värme som återvänder till baslinjen. Injektion av laktos i laktas lösningen upprepas sedan tre gånger med topphöjden av den endoterma reaktionen från varje efterföljande injektion lite mindre än föregående injektionen på grund av minskningen av enzymaktivitet. Raw-data kan sedan konverteras för att Visa topp värmen i förhållande till tid (figur 2A-D). Maximala höjden för varje injektion kan då passa till en linjär regression och lutningen indikerar enzym stabilitet på den valda temperaturen. Ju mer negativ lutning, mindre stabil enzymet. Som förväntat, minskar enzym stabilitet med ökande temperatur (figur 2E).

Varje injektion av laktos som beskrivs i figur 1 resulterar i utspädning av laktas. För att visa att denna utspädning inte är orsaken till minskningen av enzymaktivitet, gjordes ITC laktas aktivitet analysen också vid 25 ° C, laktas koncentrationen på första och den sista injektionen (figur 3). Denna utspädning medför en minskning med 8% av enzymaktivitet, medan den fjärde injektionen i analysen visar en 73% minskning i aktivitet. Utspädning av laktas under fyra-injektion experimentet hade således en relativt liten effekt (dvs 11%) på enzymaktivitet. Den faktiska förlusten av aktivitet var därför 73-8 = 65%.

Som nämnts i är inledningen en av fördelarna med att använda ITC att dessa reaktioner kan ske i ogenomskinliga media, till exempel mjölk. För att visa denna förmåga av ITC, var mjölk injiceras direkt i laktas (figur 4). Eftersom pH-värdet i mjölken inte är matchas till natrium acetatbuffert, finns det en stor exotermiska värme att blanda omedelbart efter injektionen. Exotermiska värme av blandande topp ses i den kontroll som saknar laktas (figur 4, grå linje) och i de två injektionerna med mjölk (figur 4, svart och streckade linjerna) efter värmen blandar peak. Den endoterma reaktionen som visar laktas aktivitet uppstår. Mjölk innehåller en komplex blandning av proteiner, vitaminer, mineraler och laktos. På grund av komplexiteten av mjölk är det sannolikt att andra reaktioner inträffa under loppet av vår reaktion. För att visa att den endoterma toppen är på grund av laktas aktivitet, var mjölken spetsat med 146 mM laktos. I reaktionen med laktos spetsade mjölk (figur 4, streckade linjen) är den endoterma peak och area under kurvan större än i mjölk ensam (figur 4, svarta linje), vilket indikerar att den endoterma toppen verkligen beror på aktiviteten laktas. Förskjutningen av baslinje indikerar att en långsam reaktion fortsätter efter laktos reaktionen är klar.

För att visa hur denna analys kan användas för att jämföra stabilitet av enzymaktivitet av två olika enzympreparat, stabilitet gratis invertas och invertas orörlig på en nylon-6 nanofiber membran jämförs i figur 5 vid 35 ° C¹¹ . Liksom i laktas analysen, fyra 4 µL injektioner av sackaros gjorts sekventiellt och maximal värme priset bestäms från topphöjden för varje injektion. Som visas i figur 6, minskar peak höjder linjärt med tiden indikerar minskande enzymaktivitet.

Figur 1 : ITC data spår av laktas aktivitet. Varje trace visar fyra sekventiella 4 µL injektioner av 600 mM laktos laktas lösning i pH 4,6 buffert. Spåren var gjort vid 55 ° C (svart), 45 ° C (mörkgrå), 35 ° C (streckad), 25 ° C (ljusgrå) och ett enzym kontroll (prickig) vid 55 ° C. De raka linjerna representerar passformen till den endoterma peak minimum efter varje injektion.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Stabilitet av enzymaktivitet baserat på graden av förändring i peak aktivitet. Den topp enzymatiska aktiviteten för varje fyra injektioner i förhållande till tid (s) vid 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) och 55 ° C (D). Den linjära passformen data representeras av den heldragna linjen. Sluttningarna av monterade raderna i delar A-D ritas mot temperaturen i E.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Effekten av enzym utspädning på topphöjden vid 25 ° C. Laktas aktivitet mäts enzym koncentration på första och fjärde injektionerna 20 mg/mL (svart) och 18.62 mg/mL (grå), respektive. Infällt är en inzoomad version med tanke på peak enzymaktiviteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Mäta laktas aktivitet i mjölk. ITC spår av en injektion av BYU creamery fettfri mjölk till buffert (grå), mjölk till 20 mg/mL laktas (svart) och mjölk spetsad med 5% ytterligare laktos till 20 mg/mL (prickig). Y-axeln är diskontinuerlig att visa den endoterma enzym reaktionen och exotermiska värme blandning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : Ett representativt exempel på hur ITC enzym stabilitet analysen vid 35 ° C kunde användas för att jämföra två olika preparat av invertas. Verksamheten i invertas orörlig på en nanofiber membran och gratis enzym visas genom de prickade och mörk grå linjerna, respektive. Den svarta linjen är kontrollen med ingen invertas som visar bara värmen blandar på lämpliga skalor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 : Linjära förhållandet mellan maximal exotermiska värme hastighet och invertas koncentration efter en 4 µL injektion av sackaros 600 mM. Detta standardkurva kan användas för att bestämma koncentrationen av invertas i ett okänt prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

En stor fördel med ITC enzym stabilitet analysen beskrivs här är automation. När alla lämpliga buffrar och lösningar är gjorda, är ställtid för varje analys ca 15 min för den som utför analysen. Däremot de konventionella analyserna för invertas och laktas aktivitet kräver ca 2 h med kontinuerlig medverkan av den som utför analysen och många enzymatiska aktivitet analyser ta betydligt fler arbetstimmar. I en tidigare publikation, har vi visat hur data från metoden ITC kan jämföras med en mer traditionell spectrophotrometric metod för invertas aktivitet¹¹.

En annan fördel med ITC analysen är dess tillämplighet på nästan alla enzym¹². Testa stabiliteten i olika enzymer under en viss uppsättning villkor kräver således inte ställa in flera olika analyser. Dessutom är ITC analysen användbart för att bestämma stabilitet i aktiviteten av en roman enzym eller av ett enzym som inte har en lämplig kolorimetriska analys.  ITC analysen kan också göras i ogenomskinliga media vilket är en stor fördel i livsmedelsvetenskap. Eftersom de flesta tidigare analyser av enzymaktivitet använder spektrofotometri, fluorescens eller Luminiscens för att mäta enzymaktiviteten, är de inte kompatibel med ogenomskinlig eller starkt färgade media. Även om detta arbete visar endast temperaturens inverkan på stabiliteten i enzymaktivitet, är ITC metoden tillämplig på de flesta andra förhållanden som påverkar enzymet stabilitet (t.ex. pH, salter, vattenbaserade lösningsmedel och denatureringen agenter).

Som med alla ITC experiment, ska bufferten används för enzym och substrat lösningen matcha så nära som möjligt. Felmatchning av koncentration eller pH kan orsaka stor värme effekter som överskrider det dynamiska omfånget av kalorimetern. Användning av samma lager bufferten att förbereda både enzym och substrat lösningar räcker oftast. Men om inte, lösningarna som kan matchas av dialyzing båda lösningarna mot samma buffertlösningen.

Ytterligare ett villkor är att enzymet inte bör substrat mättad, i vilket fall, topphöjden blir oberoende av substrat koncentrationen. Dessutom tid för reaktionen att gå till fullbordan eller till jämvikt mellan injektionerna kan bli överdriven eller signalen kan överstiga det dynamiska omfånget av kalorimetern. Substrat koncentrationen måste dock vara tillräckligt stor för att ge en stark värme signal. Om enzymet är substrat mättad, substrat koncentrationen kan minskas eller enzym koncentrationen ökade. När du laddar kalorimeter cellen och spruta, måste man säkerställa att det finns inga bubblor. Om en bubbla är injiceras eller släppt från cellen under ett experiment, kommer att det orsaka en avvikande händelse i värme hastighet signalen.

Metoden ITC är avhängig entalpi ändringen av den katalyseras reaktionen och hastighet och mängd reaktion. Om förändringens entalpi för reaktionen är för liten, underlaget är alltför olösligt eller enzymet har inte tillräcklig aktivitet, kan värme för liten för att erhålla tillräcklig signal. Dessutom om enzymet hämmas av låga koncentrationer av produkter, kommer minskningen av enzymaktivitet som observerats under loppet av experimentet att orsakas av produkten hämning samt förlust av aktivitet över tiden. Till exempel i laktas titreringen orsakar 54 mM glukos och galaktos slutliga koncentration en 27% minskning i topphöjden av enzymaktiviteten vid 55° C (inga data anges). Detta är betydligt mindre än 78% minskningen av topphöjden från injektion 1 injektion 4 i figur 1. Dock kan detta korrigeras genom att mäta enzymaktiviteten i närvaro av produkten koncentrationen nådde under analysen. Ytterligare, titrering enzymet med mindre substrat kan minska mängden produkt hämning.

Andra begränsningar kan uppstå på grund av enzymet. Exempelvis vid varje injektion blir enzymet utspädda. Eftersom denna ITC använder en overflow reaktionskärlet, avlägsnas en mängd lösning motsvarar storleken injektion under experimentet vid varje injektion. Således en liten mängd enzym tas bort, och produkter av reaktionen ökar med varje injektion. Effekterna av utspädning och mängden enzym som tagits bort kan hållas små om injektion storlek hålls små och en stor koncentration av substrat är därför ofta nödvändigt. Eftersom förhållandet mellan Injektionsvolym till reaktion fartyget volym är mindre i ITC: er med större reaktionskärl är utspädningseffekten mindre än i den låga volymen ITC som används i detta arbete. Dessutom varje reaktion för många enzymer kräver mikrogram låg milligram kvantiteter, så om du har ett enzym som är dyra eller svåra att rena, detta kunde förbjuda användningen av denna analys.

De flesta av de frågor som kan uppkomma under denna analys är relaterade till korrekt underhåll och rengöring av ITC reaktionskärlet. Om ITC inte når en stabil baslinje, beror detta ofta på reaktionskärlet inte är tillräckligt rena. Vi rekommenderar att du använder ett starkt rengöringsmedel efter varje experiment när du använder proteiner i ITC eftersom proteiner kan hålla sig till reaktionskärlet och störa värme hastighet mätning. För en djupare ren, en 50% myrsyra lösning inkuberas vid 55 ° C för upp till 12 h följt av rengöring med rengöringsmedel (Tabell för material), etanol och vatten tar bort de flesta föroreningar.

Slutligen, eftersom ITC tar ca 45 min temperera efter lastning lösningar, kan aktiviteten av relativt instabil enzymer eller marginell villkor inte vara möjligt. Om enzymet inactivateds under denna tid ingen signal, kommer att vara tillgängliga eller förfalla kan vara alltför snabb efter första injektionen för att erhålla stabilitetsdata.

Eftersom ITC analysen mäter direkt enzymaktivitet, kan den förlängas till ett antal andra användningsområden. Denna analys kan till exempel göras med ökande koncentrationer av en hämmare att bestämma konstanten hämning, Ki, baserat på minskningen av enzymaktivitet med ökande hämmare koncentration. I figur 5visas detta protokoll kan anpassas för immobiliserade enzymer på ett fast stöd. Nanofiber membran användes i detta arbete, men andra solid stöder kunde också användas om en metod för att infoga och ta bort den genom små tillgång röret kan utvecklas. ITC metoden skulle också kunna utvidgas till enzymer som ändras kemiskt eller genetiskt att förbättra termisk stabilitet eller bestämma mängden aktiva enzym i ett okänt prov (dvs, figur 6 visar linjära förhållandet mellan värme hastighet peak höjd och enzym koncentration).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)