Præsenteret her er protokoller for immunhistokemiske karakterisering og lokalisering af orexin peptid, orexin receptorer, og endocannabinoide receptorer i tarmen og hjernen af normale og kost-induceret fedme (Dio) voksne: zebrafisk modeller ved hjælp af immunoperixidase og dobbelte immunofluorescens metoder.
Immun histokemi (IHC) er en meget følsom og specifik teknik, der er involveret i påvisning af Target antigener i vævs sektioner med mærkede antistoffer. Det er en MultiStep proces, hvor optimering af hvert trin er afgørende for at opnå det optimale specifikke signal. Gennem IHC kan der påvises distribution og lokalisering af specifikke biomarkører, som afslører oplysninger om evolutionær bevaring. Desuden giver IHC mulighed for at forstå udtryks-og distributions ændringer af biomarkører under patologiske forhold, såsom fedme. IHC, hovedsagelig immunofluorescens teknik, kan anvendes i voksne zebrafisk til at detektere organiseringen og distributionen af phylogenerede molekyler, men en standard IHC-protokol er ikke estasblished. Orexin og endocannabinoide er to meget velbevaret systemer, der er involveret i kontrol af fødeindtagelse og fedme patologi. Rapporteret her er protokoller, der anvendes til at få oplysninger om orexin peptid (oxa), orexin receptor (Ox-2R), og cannabinoid receptor (CB1R) lokalisering og distribution i tarmen og hjernen af normale og kost-induceret fede (Dio) voksne: zebrafisk modeller. Også beskrevet er metoder til immunoperoxydaseteknik og dobbelt immunofluorescens, samt forberedelse af reagenser, fiksering, paraffin-indlejring, og kryoprotektion af zebrafiske væv og forberedelse til en endogen aktivitet-Blokering trin og baggrund modfarvning. Det komplette sæt af parametre er opnået fra tidligere IHC eksperimenter, hvorigennem vi har vist, hvordan immunofluorescens kan hjælpe med forståelsen af oxs, Ox-2R, og CB1R distribution, lokalisering, og bevaring af udtrykket i voksne: zebrafisk Væv. De resulterende billeder med meget specifik signalintensitet førte til bekræftelsen af, at zebrafisk er egnede dyremodeller til immunohistokemiske studier af distribution, lokalisering og evolutionær bevaring af specifikke biomarkører i fysiologiske og patologiske tilstande. De protokoller, der præsenteres her, anbefales til IHC-eksperimenter i voksne zebrafisk.
Immunohistochemistry (IHC) er en veletableret klassisk teknik, der anvendes til at identificere cellulære eller vævs komponenter (antigener) ved antigen-antistof interaktion1,2. Det kan bruges til at identificere lokalisering og distribution af målbiomolekyler i et væv. IHC anvender immunologiske og kemiske reaktioner til påvisning af antigener i vævs afsnit3. De vigtigste markører, der anvendes til visualisering af antigen-antistof interaktioner omfatter fluorescerende farvestoffer (immunofluorescens) og enzym-substrat farve reaktioner (immunoperoxidase), både konjugeret til antistoffer4. Brug af mikroskopisk observation er muligt at bestemme lokalisering af mærkede væv, som omtrent svarer til lokalisering af målantigen i vævet.
Der findes to metoder til fluorescerende eller kromogeniske reaktioner til påvisning af protein: den direkte påvisningsmetode, hvor det specifikke primære antistof er direkte mærket; og den indirekte detektionsmetode, hvor det primære antistof er ukonjugeret, mens det sekundære antistof bærer etiketten5,6,7. Den indirekte metode har nogle fordele, som primært er dens signal forstærkning. Desuden, i modsætning til andre molekylære og cellulære teknikker, med immunofluorescens, er det muligt at visualisere fordelingen, lokalisering, og coexpression af to eller flere proteiner differentielt udtrykt i celler og væv7. Valget af den detekterings metode, der anvendes, afhænger af eksperimentelle detaljer.
Til dato, IHC er meget udbredt i grundforskning som et kraftfuldt og vigtigt redskab til at forstå fordelingen og lokalisering af biomarkører og den generelle profilering af forskellige proteiner i biologisk væv fra humane til hvirvelløse dyr8, 9 ud af , 10 stk. , 11. teknikken hjælper med at vise et kort over protein ekspression i et stort antal normale og ændrede dyreorganer og forskellige vævstyper, der viser mulig ned-eller op-regulering af udtryk induceret af fysiologiske og patologiske ændringer. IHC er en meget følsom teknik, der kræver nøjagtighed og det korrekte valg af metoder for at opnå optimale resultater12. Først og fremmest kan mange forskellige faktorer, såsom fiksering, Cross-reaktivitet, antigen hentning, og følsomhed af antistoffer føre til falsk positive og falsk negative signaler13. Udvælgelsen af antistoffer er et af de vigtigste trin i IHC og afhænger af antigen specificiteten og dens affinitet til det protein og de arter, der er omfattet af undersøgelsen7.
For nylig har vi optimeret IHC teknik til at detektere medlemmer af orexin/hypocretin og endocannabinoide systemer i voksne: zebrafisk væv. Vi har primært fokuseret på fiksering, vævs integrering ved hjælp af to forskellige tilgange, skæring og montage (hvilket kan påvirke opløsningen og detaljerne under mikroskopisk analyse) og blokering (for at forhindre falsk positiver og reducere baggrunden)14. Andre vigtige karakteristika er antistof specificitet og selektivitet og reproducerbarhed af individuelle IHC-protokoller. Nøglen til at give antistof specificitet er brugen af negative kontroller (herunder ingen primære antistoffer eller væv, der vides ikke at udtrykke målproteinerne) samt positive kontroller (herunder væv, der er kendt for at udtrykke målproteinerne)15 . Udvælgelsen af antistoffer mod IHC sker på grundlag af deres Arts specificitet (sandsynligheden for, at de reagerer med det antigen, der er af interesse), og de antigen-antistof-bindings detektionssystemer, der anvendes4,5,6 ,7. I tilfælde af immunoperoxidase bestemmes reaktions farven ved valg af det udfællende kromogen, sædvanligvis diaminobenzidin (brun)16. På den anden side, jegmmunofluorescence udnytter antistoffer konjugeret med en fluorophor at visualisere protein udtryk i frosne væv sektioner og giver mulighed for nem analyse af flere proteiner i forhold til det kromogene detekteringssystem 5 ) i , 7. der er
I immunoperoxidaseteknikken er det sekundære antistof konjugeret til biotin, et linker-molekyle, der kan rekruttere et kromogen reporter molekyle [Avidin-biotin Complex (ABC)], hvilket fører til forstærkning af farvnings signalet. Med ABC reporter-metoden reagerer enzymet peroxidase med 3, 3 ‘-diaminobenzidin (DAB), hvilket producerer en intenst brunfarvet farvning, hvor enzymet binder sig til det sekundære antistof, som derefter kan analyseres med et almindeligt lysmikroskop. ABC farvning, på grund af den høje affinitet af begærlighed for biotin, producerer en hurtig og optimal reaktion, med få sekundære antistoffer knyttet til stedet for den primære antistof reaktivitet. Denne kromogene detektionsmetode giver mulighed for en densitometrisk analyse af signalet, der giver semi-kvantitative data baseret på korrelationen af brune signal niveauer med protein Expression niveauer18.
Med immunofluorescens teknikker er samtidig påvisning af flere proteiner mulig på grund af forskellige fluorchrominers evne til at udsende lys ved unikke bølgelængder, men det er vigtigt at vælge fluorokromer omhyggeligt for at minimere spektral overlap 5. Desuden minimerer brugen af primære antistoffer i forskellige værtsarter vanskeligheder med hensyn til kryds reaktivitet. I dette tilfælde genkender hvert artsspecifikt sekundært antistof kun én type primær antistof. Fluorescerende reportere er små organiske molekyler, herunder kommercielle derivater, såsom Alexa fluor farvestoffer.
Mange dyremodeller bruges til at forstå særlige fysiologiske og patologiske tilstande. Til dato er det fastslået, at mange metaboliske veje er bevaret i løbet af udviklingen. Derfor kan IHC-studier i modelorganismer såsom zebrafisk give indsigt i tilblivelsen og vedligeholdelsen af patologiske og ikke-patologiske tilstande17. Det er et formål med denne rapport at illustrere IHC protokoller, der kan udføres på voksne zebrafiske væv og anvendes til at opnå detaljerede billeder af distributionen og lokalisering af OXA, OX-2R, og CB1R på perifert og centralt niveau. Også rapporteret er protokoller for anvendelse af to store IHC indirekte metoder i perifert og centralt væv af voksne zebrafish. Beskrevet er den indirekte metode, som giver mulighed for signal forstærkning i tilfælde, hvor et sekundært antistof konjugeres til et fluorescerende farvestof (immunofluorescens metode) eller enzym reporter (immunoperoxidasemetode). Både kromogeniske og fluorescerende detekteringsmetoder besidder fordele og ulemper. Rapporteret i denne protokol er brugen af IHC, hovedsagelig immunofluorescens, i voksne zebrafisk, en dyremodel udbredte til at studere systemer, der er evolutionære bevaret på tværs af forskellige fysiologiske og patologiske betingelser.
Forberedelse af prøver
Prøveforberedelse er det første kritiske trin i IHC. En pålidelig protokol giver mulighed for vedligeholdelse af cellernes morfologi, vævs arkitektur og antigenicitet. Dette trin kræver korrekt vævs indsamling, fikse ring og skæring22,23. Formålet med fiksering er at bevare væv og reducere virkningen af vævs enzymer eller mikroorganismer. Fikserings trinnet bevarer især cellul?…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, University of Sannio.
Anti CB1 | Abcam | ab23703 | |
Anti OX-2R | Santa Cruz | sc-8074 | |
Anti-OXA | Santa Cruz | sc8070 | |
Aquatex | Merck | 1,085,620,050 | |
Biotinylated rabbit anti-goat | Vector Lab | BA-5000 | |
citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
Confocal microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti2 | |
Cryostat | Leica Biosystem | CM3050S | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Digital Camera | Leica Biosystem | DFC320 | |
Digital Camera for confocal microscope | Nikon | DS-Qi2 | |
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A11055 | |
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A11058 | |
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A21206 | |
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo Fisher | A21207 | |
Ethanol absolute | VWR | 20,821,330 | |
Frozen section compound | Leica Biosystem | FSC 22 Frozen Section Media | |
H2O2 | Sigma Aldrich | 31642 | |
HCl | VWR | 20,252,290 | |
ImmPACT DAB | Vector lab | SK4105 | |
Microscope | Leica Biosystem | DMI6000 | |
Microtome | Leica Biosystem | RM2125RT | |
Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4H2O | Sigma Aldrich | S9638 | |
NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
Normal Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Normal Rabbit Serum | Vector lab | S-5000 | |
paraffin wax | Carlo Erba | 46793801 | |
Paraphormaldeyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
Triton X-100 | Fluka Analytical | 93420 | |
Trizma | Sigma Aldrich | T1503 | |
VectaStain Elite ABC Kit | Vector lab | PK6100 | |
Xylene Pure | Carlo Erba | 392603 |