Summary
توفير حساسية خلية واحدة، قياس التدفق في الوقت الحقيقي مناسبة فريدة لتحديد وظائف مستقبلات المتعدد الثقافات الحية. باستخدام خلايا السلف العصبية الكبار، تم تقييم وظيفة مستقبلات P2X7 عن طريق تدفق الكالسيوم الكشف عنها بواسطة الكالسيوم مؤشر صبغ، تشكيل المسام transmembrane اثيديوم بروميد امتصاص، واستخدام الخرز مطاط الفلورسنت البلعمه.
Abstract
خلية يعيش التدفق الخلوي يستخدم متزايد بين علماء الأحياء الخلية للتحديد الكمي للعمليات البيولوجية في العيش خلية ثقافة. هذا البروتوكول وصف أسلوب حيث يتم توسيع خلية يعيش التدفق الخلوي عند تحليل الوظائف المتعددة لتنشيط مستقبلات P2X7 في الوقت الحقيقي. استخدام وحدة نمطية وقت مثبتة على سيتوميتير تدفق، يمكن تقييم وظائف خلية يعيش وتآمروا على مدى فترة زمنية معينة لاستكشاف حركية تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام transmembrane البلعمه. هذا الأسلوب البسيط مفيد كما يمكن تقييم جميع المهام المتعارف عليه ثلاثة من مستقبلات P2X7 باستخدام آلة واحدة، والبيانات المجمعة المرسومة على مر الزمن ويقدم معلومات عن كل خلية يعيش السكان بدلاً من خلية واحدة تسجيلات غالباً الحصول عليها باستخدام أساليب التصحيح-المشبك تحديا من الناحية التقنية. استخدام صبغة مؤشر كالسيوم الكالسيوم تدفق التجارب، في حين تعتمد فحوصات تشكيل المسام P2X7 على اثيديوم بروميد السماح لهم بالمرور عبر ترانسميمبراني المسام المشكلة عند تركيزات عالية مؤثر. الأصفر والأخضر الخرز مطاط (YG) تستخدم لقياس البلعمه. يتم تطبيق يضع محددة والخصوم للتحقيق في آثار نشاط مستقبلات P2X7. كل على حدة، يمكن تعديل هذه الأساليب لتوفير البيانات الكمية على أي عدد من قنوات الكالسيوم ومستقبلات بورينيرجيك والكاسح. أخذت معا، أنها تسلط الضوء على كيفية استخدام الخلوي في الوقت الحقيقي يعيش خلية تدفق طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه، وقابلة للقياس الكمي للتحقيق في وظيفة مستقبلات P2X7.
Introduction
دراسة الإشارات بورينيرجيك واسعة النطاق ومتعددة الأوجه، والتي تنطوي على الفيزيولوجيا الخلوية والكيمياء الحيوية، وعلم الأدوية. إشارات بورينيرجيك وتشارك في عدد لا حصر له من العمليات الخلوية والجزيئية، من السرطان، وتنظيم دورة الخلية إلى خلية خلية الاتصالات وبيولوجيا الخلايا الجذعية؛ على هذا النحو، هناك غالباً ما يمكن أن تعدل بورينيرجيك الإشارات لفائدة علاجية. مستقبلات بورينيرجيك، تلقت مستقبلات P2X7 قدر كبير من الاهتمام في السنوات الأخيرة بسبب إمكاناتها كهدف علاجي للعديد من الأوضاع الملتهبة1. تطورت أساليب لدراسة المستقبلات وتم تكييفها على مر السنوات لتسهيل هذا البحث2،3،،من45. هنا، يمكننا وصف أسلوب تدفق الخلية يعيش الخلوي للتحقيق في مهام متعددة من مستقبلات P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار المستمدة من منطقة سوبفينتريكولار (SVZ) والمغزلي المسنن هيبوكامبال.
ووصفت مستقبلات P2X7 أولاً مستقبلات P2Z، أو مستقبلات 'موت الخلية'، التنشيط مع تركيزات عالية من النتائج الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في تشكيل المسام transmembrane كبيرة إنفاذا للجزيئات تصل إلى 900 دا6. وهذا يؤدي إلى إعادة ترتيب سيتوسكيليتال، تشكيل المسام transmembrane، وربما المبرمج و/أو نخر7. تقليديا، هو كمية هذه الدالة P2X7 بامتصاص الأصباغ كبيرة الوزن الجزيئي مثل يو-برو-1 أو اثيديوم بروميد، الذي فلوريس عندما أولمبية صيفية مع الحمض النووي3،8. لوحة القارئ الأساليب، وهي سريعة والسماح لرفع مستوى، عموما لا تسمح بمراقبة حركية. الأسلوب الموصوفة هنا يستند على امتصاص اثيديوم ويسمح زيادة الأسفار يحتفل بمرور الوقت، توفير مزيد من عمق للمعلومات فيما يتعلق بالسرعة لتشكيل المسام. مستقبلات P2X7 أظهرت منذ ذلك الحين تيسير عدد من الوظائف نونيموني، مع ردود متميزة اعتماداً على التعرض الوقت ومؤثر تركيز9،10. موجز التنشيط بتركيزات أقل من النتائج ATP في تدفق الأيونات الموجبة لأغراض توصيل العصبي وإشارة11. استخدام التدفق الخلوي لقياس تدفق الكالسيوم ويتغلب على المشاكل المرتبطة بأساليب معقدة وصعبة من الناحية الفنية – وخاصة التصحيح لقط لقياس التيارات إلى الداخل التي لا تقدر بثمن من التفاصيل فيما يتعلق بالتغيير في إمكانات عبر تقديم غشاء الخلية ولكن لا تسمح للسكان تحليل2. الوظيفة الثالثة لمستقبلات P2X7 يحدث في غياب ATP، حيث أثبتت مستقبلات P2X7 لتسهيل البلعمه في جهاز المناعة والجهاز العصبي9،،من1213. التطورات في تقنيات الفحص المجهري سمحت التصور من ترتيبات جديدة سيتوسكيليتال أثناء عملية الامتصاص، على الرغم من أن التحليل الكمي والسكان يمكن أن لا يزال يمثل تحديا.
خلية يعيش تدفق الخلوي طريقة مفصلة هنا يسمح للتحقيق في جميع الوظائف الرئيسية الثلاث لمستقبلات P2X7 في الوقت الحقيقي. يسمح بإدراج جهاز وحدة الوقت على سيتوميتير تدفق التحكم في درجة الحرارة والتحريك المستمر للخلايا في التعليق. يمكن تسليم المحفزات مؤثر وخصم داخل ثانية، مما يسمح بقياس الاستجابة الخلوية دون انقطاع القريب. وهذا يمثل طريقة سريعة وبسيطة لتكاثر قياس الدالة مع تجنب استخدام العديد من أنظمة التحليل. من المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول قد تكييفها بسهولة لتناسب أي نوع من الخلايا، ويمكن أن تستخدم لفحص أنواع فرعية مستقبلات أخرى نظراً لإدراج يضع محددة أو مثبطات، اعتماداً على خصائصها.
Protocol
الحيوانات تعامل وفقا "قانون الممارسة الأسترالية" لرعاية واستخدام الحيوانات "أغراض علمية" وأقرته لجنة "أخلاقيات الحيوان جامعة غريفيث" للاستخدام.
1-نيوروسفيري الثقافة من الخلايا العصبية السلف من سفز الكبار والحصين
ملاحظة: البروتوكول تشريح المقدمة هنا يستند العمل بوكر، وكيمبيرمان، وبروتوكول مفصل لتشريح الخلايا العصبية السلف من الفئران الكبار متاحة في أماكن أخرى14. تم تعديل شروط الثقافة من أبو والزملاء15. وقد استخدمت الفئران C57BL/6 الإناث البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 8 – 12 أسبوعا.
- في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، إعداد الثقافة المتوسطة (متوسطة القاعدية العصبية) تستكمل مع الملحق انتشار الخلايا الجذعية العصبية، الجلوتامين مم 2، 20 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (لو)، 10 نانوغرام/مل عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف)، و 2 ميكروغرام/مل الهيبارين.
- Euthanize اثنين من الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 . وبدلاً من ذلك، تخدير الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وفورا euthanize لهم بخلع عنق الرحم. رش رؤوسهم مع الإيثانول 70% وقطع رأس لهم. نقل كل رئيس في أنبوب عقيم يحتوي على هانك لحل متوازن الملح (حبس) مع الحل البنسلين/ستربتوميسين x 1 (P/S).
- إجراء تشريح في غطاء الاندفاق الصفحي تحت مجهر تشريح.
- باستخدام مقص ملقط والتشريح، إزالة الأنسجة والعظام لفضح الدماغ، وأنه نقل إلى طبق عقيمة التي تحتوي على حبس مع P/s.
- موقف الجانب البطني الدماغ أعلى واستخدام شفرة المبضع لإجراء شق الاكليلية كاملة عبر chiasm البصرية. عقد الدماغ ثابت مع الملقط واستخدام أحد سويفت، ونظيفة والحركة نحو الانخفاض. تجنب النشر للحد من موت الخلايا، ويساعد في الحفاظ على بنية الأنسجة.
ملاحظة: إذا لم تجر بشكل أمن، الدماغ قد الميل إلى الأمام أثناء قص والمساس بعدد الخلايا السلف الحصول عليها من سفز. - عزل سفز من النصف روسترال من الدماغ.
- قم بتحديد موقع كلا البطينين، مفصولة الحاجز، مع كلثوم الإحضار تشكيل جسر أبيض فوقها.
- استخدام الملقط لإزالة الحاجز يفصل بين البطينين اثنين وعزل جدران البطينين الجانبية الأمامية الجانبية. القيام بذلك عن طريق خفض بعيداً أعلاه وأدناه، وعلى الجانبين وفي الجبهة مع مقص تشريح غرامة. سوف تظل هناك مجرد شكل مثل كأس صغيرة.
- إعداد غطاء صحن بيتري نظيفة مع بضع قطرات من حبس في الوسط ونقل سفز للسائل. لا تسمح الأنسجة الجافة أو لمس سطح جاف. الوقوف إلى الجانب بينما تشريح في هيبوكامبي.
- عزل هيبوكامبي من النصف والذيلية للدماغ.
- جعل خط الوسط قطع بين نصفي الكرة الأرضية بقطع كلثوم الإحضار. استخدام البطينات الجانبية كدليل وتتكشف بلطف القشرة لفضح الحصين. بمجرد القشرة مفتوح، يمكن اعتبار الحصين بنية كثيفة، بيضاء، ومنحني.
- استخدام مقص تشريح غرامة أو الملقط لعزل الحصين من الأنسجة المجاورة.
- مع الملقط، إزالة الزائدة الأبيض المسألة والأوعية الدموية والأنسجة غشائي أي تغطي الحصين.
- إعداد غطاء نظيف بيتري طبق على استعداد مع بضع قطرات من حبس ونقل الحصين للسائل. كرر لنصف الكرة الأرضية الأخرى.
- بمجرد الحصين وسفز من اثنين من الفئران تم معزولة وتحويلها إلى أغطية طبق بيتري كل منهما على، ميكانيكيا النرد الأنسجة باستخدام شفرة المبضع. ختم الأنسجة في غطاء صحن بيتري واحد لحوالي 1 دقيقة، بالتناوب كل 10 s حتى تظهر الأنسجة ناعمة والقطع الجميلة إلا تبقى. تأخذ شفرة المبضع نظيفة وتكرار للطبق الأخرى، لعب النرد الأنسجة لمدة 1 دقيقة.
- باستخدام ماصة 1 مل، نقل جميع الأنسجة من كل غطاء صحن بيتري لفصل الأنابيب التي تحتوي على 1 مل حمض التربسين-الإيثيلين 0.25% (يدتا). استخدام أنبوب واحد سفز وأنبوب واحد الحصين.
- القيام بذلك بأول بيبيتينج حوالي نصف التربسين-يدتا للنسيج في الطبق للتقليل من فقاعات الهواء ومنع الأنسجة ملامسة تلميح ماصة جافة كما يتم تحويله إلى الأنبوب. شطف الطبق وشفرة المبضع مع بقية التربسين-أدتا جمع الأنسجة قدر الإمكان وإضافته إلى الأنبوب.
- احتضان الأنسجة مع التربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، التحريض على أنبوب كل 10 دقيقة ننأى الأنسجة بشكل صحيح.
- تريتوراتي الأنسجة استخدام زجاج المصقول النار ماصة باستور لإنشاء تعليق خلية مفردة. الحرص على عدم أوفيرتريتوراتي أن هذا سوف يسبب تحلل الخلية المفرط. هذا خطوة حاسمة لتفكك النسيج الأمثل.
- مراقبة محتويات الأنبوبة أثناء عملية تريتوريشن والتوقف عند أقرب علامات أن غالبية كتل الأنسجة قد أزيلت. الحل التربسين ينبغي أن يصبح غائم قليلاً عندما ذهبت الخلايا إلى تعليق خلية واحدة، على الرغم من أن قد تظل بعض كتل.
ملاحظة: كإشارة إلى تمرير تعليق صعودا وهبوطاً 10 x-15 x كاف. - إضافة ثقافة متوسطة تصل إلى 5 مل لتحييد التربسين، وتدور في 300 x ز للغسيل 3 دقيقة أخرى x 2 مع حبس وتمرير الوسيطة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة أي أنسجة كتل.
- نقل كافة الخلايا في 15 مل متوسطة إلى قارورة ثقافة الخليوي T75.
ملاحظة: وينبغي أن تشكل مجالات في الممر صفر (P0) الثقافة سفز بعد 7 – 10 أيام وبعد 15-20 يوما في الثقافة هيبوكامبال. الامتناع عن الغسيل أو تغذية الخلايا أثناء هذا الوقت إلى أقصى حد عدد الخلايا العصبية السلف في الثقافة. إذا كانت مطلوبة من فروعه أكثر، أو لتقليل الوقت P0 الحضانة، فمن الممكن زيادة عدد الفئران ضحى. - الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ، وبعد مرحلة الثقافة P0 الأولية، ومرور كل 7 – 10 أيام حسب الاقتضاء، استخدام ممارسات زراعة الأنسجة في مجلس الوزراء ومعيار سلامة بيولوجية.
ملاحظة: ينبغي أن تولد ثقافة هيبوكامبال P0 مجالات كافية للمرور في قارورة T25؛ سيقوم بإنشاء العديد من المجالات أكثر ثقافة سفز ويمكن باساجيد في T75. إذا انضمت مجالات P0 هيبوكامبال، استخدم ماصة 200 ميليلتر لأرفع برفق في المجال. - ممر في المجالات عندما تصل إلى 150 إلى 200 ميكرومتر في القطر. جمع المجالات والمتوسطة في أنبوب 15 مل وتتيح المجال لتسوية بالجاذبية لحوالي 5 دقيقة بدلاً من ذلك، تدور بسرعة منخفضة (100 x ز) لمدة 2 دقيقة.
- إزالة المتوسطة وننأى بالخلايا مع كاشف الانفصال عن 7 – 10 دقيقة، تبعاً لحجم المجالات.
ملاحظة: الكاشف تفارق المستخدمة سيكون لها آثار كبيرة على نتائج الثقافة، حتى، يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة للتفاصيل. - غسل الخلايا بإضافة 5 مل حبس لحل الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا في الثقافة المتوسطة، والبذور في الخلايا 150,000 تقريبا في 5 مل متوسطة في قارورة ثقافة الخليوي T25 أو ما يعادلها. الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- تأكيد حالة الخلية العصبية السلف بتحديد التعبير عن علامات الخلايا الجذعية مثل Sox2 و ASCL1 قبل الشروع في أي بروتوكول المصب9.
ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك بالأسلوب المفضل للباحث (مثلاً، إيمونوتشيميستري بالفحص المجهري، والتدفق الخلوي أو لطخة غربية، أو باستخدام الكمية البلمرة المتسلسل (qPCR)).
2-إعداد تعليق خلية واحدة للتحليل بالتدفق الخلوي
-
إعداد الوسائط المطلوبة. وهذه تشمل ما يلي:
- إعداد متوسطة نا+ التي تحتوي على 145 كلوريد الصوديوم، 5 ملم كوه، 10 مم حبيس، 5 ملم د-الجلوكوز، 0.1% ألبومين المصل البقري (BSA)، و 0.1 ملم كاكل2. كما يستخدم هذه الوسيلة بشكل خال من الكالسيوم، مع 0.1 مم كاكل2 حذف.
- إعداد متوسطة ك+ التي تحتوي على 145 مم بوكل، 5 ملم كوه، 10 مم حبيس، 5 ملم د-الجلوكوز، وجيش صرب البوسنة 0.1%.
ملاحظة: هذه الوسائط كانت الأمثل على نطاق واسع وهي مفصلة في المنشورات السابقة4،5. - إعداد ATP المخزون حسب وزنها كافية مسحوق ATP لحوالي 20 مل مخزون 100 مم. يحل المسحوق في 17 مل من المخزن المؤقت بوكل (145 مم بوكل، 5 ملم كوه، و 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5) و ببطء، بينما التحريك، إضافة 2 مل هيدروكسيد تيتراميثيلامونيوم 18% (w/v) (تي أم أية) إلى حل لتحقيق درجة الحموضة إلى 6.8 – 7.0.
- ضبط الحجم النهائي إلى 20 مل. عدم تخطي الرقم الهيدروجيني في الماضي 7.0. تخزين المخزون في-80 درجة مئوية؛ ملاحظة أن مختبرين ATP مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.
ملاحظة: الوزن الجزيئي مجاناً من ATP اللامائى 551.14 غ/مول، ولا يشمل هذا الوزن الجزيئي لجزيئات الماء وثنائي، التي قد تختلف من دفعة إلى دفعة، وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار للعمليات الحسابية. الجمعية التونسية للأمهات سامة، ويجب توخي الحذر عند التعامل. قراءة ورقة بيانات السلامة وإعداد الأرصدة في خزانة الأبخرة. - إعداد الأسهم بزاتب بحل بزاتب في عالي النقاوة ح2س لتركيز مخزون نهائي من 10 ملم.
- إنشاء تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الخطوات 1.16 و 1.17. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو العداد خلية التلقائي. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة المطلوبة (مثلاً، نا+ المتوسطة والمتوسطة الثقافة) للتجربة التي تجري (كما هو موضح أدناه) ووضع الخلايا على الجليد في الوقت نفسه.
- لكل تجربة، وضمان وجود عينة كافية لتضمين عناصر تحكم المبعثر إلى الأمام والجانب، وكذلك لمعايرة إعدادات الجهد والتعويض. ملاحظة، كإشارة إلى أن المجالات التي نمت في قارورة T75 عادة ما تسفر عن حوالي 8 × 106 خلايا كل قارورة.
-
ضبط التدفق إعدادات سيتوميتير باستخدام عينات مراقبة.
- استخدام إلى الأمام والجانب مبعثر بشكل انتقائي من بوابة الخلايا الحية.
ملاحظة: مبعثر إلى الأمام يوفر معلومات بشأن حجم الخلية استناداً إلى حيود الضوء، بينما الجانب مبعثر توفر قدرا من التعقيد الداخلي أو تقسيمات. يمكن اعتبار أحداث تدفق مع الصغيرة إلى الأمام ومبعثر الجانب الخلايا الميتة. - ضبط الجهد والحصول على سيتوميتير التدفق وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تشغيل نموذج لمحاكمة لضمان القبض على البيانات في حدة الأقصى الأسفار. مطلوب دفع أي تعويض لامتلاك قناة واحدة.
- استخدام إلى الأمام والجانب مبعثر بشكل انتقائي من بوابة الخلايا الحية.
3-قياس تدفق الكالسيوم من خلايا حية التدفق الخلوي
- وبعد إعداد تعليق خلية واحدة، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل متوسطة نا+ خالية من الكالسيوم وتحميلها مع 2 نانوغرام/مليلتر من الكالسيوم مؤشر صبغ وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الرجوع إلى الجدول للمواد) مع 10 ميليلتر حمض بلورونيك 5%. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا بإضافة 3-5 مل من خالية من الكالسيوم المتوسطة نا+ وسينتريفوجينج بلطف (200 x ز ل 4 دقيقة). إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المتوسطة نا+ خالية من الكالسيوم، الغسل مرة ثانية.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل متوسطة نا+ خالية من الكالسيوم ووضعها على الجليد، وتسمح لهم بإزالة استيريفي لمدة 30 دقيقة.
- أغسل 1 x أكثر من خلال إضافة 3-5 مل متوسطة ك+ وسينتريفوجينج (200 x ز لمدة دقيقة 4)؛ ثم، ريسوسبيند الخلايا في ك+ الكوة والمتوسطة منها في الأسفار أنابيب خلية مساعدة الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) بتركيز 1 × 106 خلايا الواحدة 500 ميليلتر كل أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية.
ملاحظة: عدد أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة سيتوقف على عدد العلاجات ويكرر المضمنة. - وضع أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد حتى الخلايا على استعداد ليتم تحليلها. لا تترك الخلايا على الجليد لفترة طويلة ولكن تبدأ الفحص وقت ممكن.
- لبعض العينات، بريينكوباتي الخلايا مع مثبطات مستقبلات محددة P2X7 AZ10606120 (ميكرومتر 1 لمدة 10 – 15 دقيقة) أو A438079 (10 ميكرون لمدة 30 دقيقة) عند 37 درجة مئوية قبل التحليل.
- إضافة كاكل2 (إلى تركيز نهائي من 1 ملم في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية) بضع دقائق قبل تشغيل العينة الأولى، ووضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لاسترداد.
- إسقاط نظيفة، محرض المغناطيسية الصغيرة في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية ووضع الأنبوب في الوحدة النمطية وقت المرتبطة بحمام مائي 37 درجة مئوية المتداولة للتحكم درجة حرارة العينة. حدد سرعة إثارة منخفضة لضمان حركة العينة دون إدخال تأثير دوامة. ضع محول أنبوب الماء سترة على منصة العينة وإغلاق ذراع رافعة للجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- الشروع في الحصول على عينة وتشغيل العينة لمدة 3 دقائق في حوالي 1,000 الأحداث في الثانية الواحدة.
- عند علامة s 40، بسرعة إزالة الأنبوب وإضافة مؤثر P2X7، أما ATP 1 ملم أو 300 ميكرون بزاتب، واستبدال أنبوب لمواصلة اقتناء.
- في حين يتم تسجيل العينة الأولى، إعداد العينة الثانية مع كاكل2 ووضعه في 37 درجة مئوية للسماح بوقت كاف للخلايا للاحماء قبل التحليل. وبمجرد الانتهاء من العينة الأولى، تنظيف المدخول عن طريق تشغيل عينة الماء، وثم يمكن البدء في الحصول على العينة الثانية كما هو موضح في الخطوات 3.8 و 3.9. دائماً قم بتنظيف المدخول بين العينات.
4-قياس المسامية تشكيل خلية يعيش التدفق الخلوي
- إنشاء تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الخطوات 1.16 و 1.17. حفظ ملليلتر بضع من الوسط القديم واستخدامه إلى ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر كل أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية، ووضعه على الجليد حتى جاهزة.
- قبل أن يعمل المقايسة، إضافة 900 ميليلتر من المتوسطة ك+ لوحدة تخزين نهائي 1 مل ووضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لاسترداد.
- إذا كان ذلك ممكناً، بريينكوباتي الخلايا مع العلاجات، بما في ذلك مثبطات محددة P2X7 AZ10606120 (ميكرومتر 1 لمدة 10 – 15 دقيقة) أو A438079 (10 ميكرون لمدة 30 دقيقة).
- فورا قبل أن يعمل المقايسة، إضافة 25 ميكرومتر اثيديوم بروميد إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية؛ ثم أضف محرض المغناطيسي، وضعه على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية وفقا للخطوة 3.7 والبدء في اقتناء.
ملاحظة: اثيديوم بروميد السامة، ويجب توخي الحذر عند التعامل مع ذلك. التخلص من أنابيب المستخدمة من نظام مراقبة الأصول الميدانية على نحو ملائم. - للحث على تشكيل المسام في غشاء الخلية، إضافة 1 مم ATP أو 100 ميكرومتر بزاتب 40 ثانية بعد بدء اكتساب.
- تشغيل العينات في أحداث حوالي 1,000 في الثانية لمدة 6 دقائق.
- بينما يتم تشغيل العينة الأولى، أخذ العينة الثانية من الجليد ووضعه في حوض ماء 37 درجة مئوية للسماح بوقت كاف للخلايا لاسترداد قبل التحليل. وبمجرد الانتهاء من العينة الأولى مع اكتساب، تنظيف كمية عن طريق تشغيل عينة مياه؛ وبعد ذلك، يمكن وضع العينة الثانية على الجهاز لبدء التسجيل كما هو موضح في الخطوات 3.8 و 3.9.
5-قياس البلعمه بخلية يعيش التدفق الخلوي
- إنشاء تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الخطوات 1.16 و 1.17. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط مكيفة وقاسمه لهم في نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب بتركيز على الأقل 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر كل أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية. تمييع الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل مع المتوسطة نا+ نهائي (مثلاً إضافة 900 ميليلتر من المتوسطة نا+ ) ووضع الخلايا على الجليد حتى يتم إجراء التحليل.
- استخدم 1 ميكرومتر من YG مطاط الخرز الجزئي (المجالات الخرز الصغير) كأهداف متجولة لفحوصات البلعمه في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: كما يمكن الاستعاضة الألوان الأخرى، ولكن الخرز بطريقة مختلفة الحجم وتبين أن الأهداف غير كافية من البلعمه4. - قبل تشغيل العينة الأولى، نقل الخلايا إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها لهم لحوالي 7 – 10 دقيقة للسماح للخلايا لاسترداد.
-
إضافة أي العلاجات التي تتطلب بريينكوبيشن إلى أنابيب كل منها، بما في ذلك 1 مم ATP لمدة 15 دقيقة، 300 ميكرون تتأكسد ATP (أوكساتب) لمدة 40 دقيقة، 20 ميكرومتر سيتوتشالاسين د 20 دقيقة، وبارافورمالدهيد 4% (PFA) لمدة 20 دقيقة.
- لا بريينكوبيشن مطلوب للمصل الإنسان 5%. إذا تم إضافة العلاجات في نفس الوقت تقريبا، العينات التي يمكن تشغيلها في ترتيب عكسي بينما الآخرون الاستمرار في احتضان. على سبيل المثال، تشغيل عناصر التحكم والمصل أولاً، ثم معاملة ATP العينة، تليها سيتوتشالاسين د ومنهاج عمل بيجين، وأوكساتب آخر.
- ضع العينة في سيتوميتير مع محرض المغناطيسي كما هو موضح في الخطوات 3.8 و 3.9، وثم الشروع في الحصول على عينة.
- إزالة أنبوب عينة من الجهاز 15 – 20 ثانية بعد بداية اقتناء، وإضافة 5 ميليلتر من حبات YG غير مخفف. العودة أنبوب عينة نظام مراقبة الأصول الميدانية ومواصلة اقتناء. تشغيل العينات لمدة 7 – 8 دقائق في حوالي 1,000 الأحداث/s.
- بينما يتم تشغيل العينة الأولى، أخذ العينة الثانية من الجليد ووضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية للسماح بوقت كاف للخلايا لاسترداد قبل التحليل. بمجرد الانتهاء من العينة الأولى تنظيف كمية عن طريق تشغيل عينة مياه، وتبدأ الحصول على العينة الثانية بعد ذلك، كما هو موضح في الخطوات 3.8 و 3.9.
6-بيانات التحليل
- تصدير البيانات إلى جدول بيانات. تحليل البيانات يعتمد على مسألة تجريبية.
ملاحظة: أن تدرك أن يدير مختلفة قد كثافات مختلفة من خط الأساس، ولذلك فمن المهم لتشغيل الفحص لفترة معينة في البداية (حوالي 40 s) قبل إضافة أي يضع وتطبيع البيانات عن طريق حساب التغير في الأسفار (الأسفار في أي يعطي وقت نقطة [و] مقسمة حسب الأسفار في الوقت نقطة الصفر [F0] أو F/F0). - لقياس معدل أو حركية دالة P2X7 في السؤال، حساب المساحة تحت المنحنى أو مجموع ترابيزويدس التي تم إنشاؤها تحت المنحنى لكل 10 s وقت الفترة16.
- لتحديد آثار المعالجات، ومتوسط كثافة الأسفار خلال s النهائية 10 – 20 من تسجيل ومقارنة العلاجات. تحديد الأهمية من t-اختبار أو تحليل التباين.
Representative Results
الثقافات الخلية العصبية السلف
وينبغي السلف العصبية مجال الثقافات المستمدة من استخدام هذا الأسلوب المرحلة مشرق وجولة حافة ناعمة (الشكل 1 أ، ب). في ثقافات صحية، ويمكن ملاحظة ميكروسبيكيس الصغيرة على الحواف (الشكل 1). في أواخر المقاطع، أو إذا تغذية غير كافية، يمكن أن تشكل مجالات شكل كأس جوفاء (الشكل 1) أو الأشكال مستطيل كبير (الشكل 1E، المبين بالسهم). لا ينبغي أن تستخدم هذه الثقافات للتدفق الخلوي أو أي تطبيقات أخرى المصب، كهذه الميزات قد يكون يدل على التمايز. للتأكد من حالة السلف العصبية، كانت مطلي الخلايا في كوفيرسليبس الزجاج مغلفة ببولي-L-ornithine ولامينين إيمونوسيتوتشيميستري (الشكل 1F ، وفي أعلى كونفلوينسي، الشكل 1). كانت الخلايا الملون توصيني، نيستين، Sox2، فيمنتين، ASCL1، بلبب، Prox1، و DCX لتحديد الخلايا كخلايا السلف 2 نوع (الحصين) أو "نوع ج" السلف الخلايا (SVZ)9. ينبغي أن يكون الخلايا نواة محددة تحديداً جيدا والعمليات الموسعة.
رقم 1: ممثل السلف العصبية هيبوكامبال خلية ثقافة. (A) السلف العصبية هيبوكامبال الخلايا المعزولة من الفئران الكبار واستزراع نيوروسفيريس حتى ما يقرب من 100 إلى 150 ميكرومتر في القطر. نيوروسفيريس (ب) ينبغي أن يكون هامش سلس، (ج) وقد يكون ميكروسبيكيس الصغيرة على سطحها. عندما مجالات تكون طويلة جداً في الثقافة، أنها يمكن أن تشكل كأس (د) أو (ه) مستطيل الأشكال. لا ينبغي أن تستخدم هذه الثقافات للتجارب. للتأكد من حالة الخلايا العصبية السلف، البذور لهم كتعليق خلية واحدة في بولي-L-أورنيثيني (منظمة التحرير الفلسطينية) والزجاج المغلفة لامينين كوفيرسليبس إيمونوتشيميستري. ينبغي أن يكون الخلايا سوما صغيرة وعمليات التفريع، (و) في كونفلوينسي المنخفضة و (ز) جاهزة إيمونوتشيميستري. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تدفق الكالسيوم بخلية يعيش التدفق الخلوي
يسمح هذا البروتوكول لتحليل وظيفة مستقبلات P2X7 كقناة كالسيوم في الوقت الحقيقي. يمكن أيضا تقييم الحركية من مستقبلات وظيفة، وكذلك آثار الخصوم، ويضع مختلف. عندما تآمروا على مر الوقت، تدفق الكالسيوم في هيبوكامبال والخلايا العصبية السلف سفز مشابهة عموما (الشكل 2 ألف و 2B الشكل، على التوالي). يضع (ATP أو بزاتب) أضيفت على علامة s 40، كما هو مبين بالسهم الأحمر. للحظة قصيرة، يتم إزالة الأنبوب من نقطة تسجيل لإضافة مؤثر، أسفر عن نقاط البيانات من الصفر. هذا سوف يسمح للتعرف على الوقت عندما تمت إضافة مؤثر. بزاتب سرعة ينشط مستقبلات P2X7، فتح قناة أيون والسماح بتدفق الكالسيوم، الذي يربط إلى 8 قطع وفلوريسسيس. تطبيق ATP يؤدي عادة في حدوث تدفق كالسيوم أكثر تدرجا. لها أدنى صلة إلى P2X7 بالمقارنة مع بزاتب، وسوف يؤدي أيضا إلى تفعيل مستقبلات إلى جانب البروتين ز، أبطأ مما يشير إلى طريق التي تحرر الكالسيوم من هيولى الذي. إدراج الخصوم P2X7 A438079 و AZ10606120 (البيانات لا تظهر) خفض تدفق الكالسيوم في الاستجابة لتطبيق مؤثر.
رقم 2: خلية يعيش تدفق الكالسيوم في الخلايا العصبية السلف من الحصين وسفز. P2X7 مستقبلات الكالسيوم قناة دالة تجلى في (أ) هيبوكامبال وخلايا السلف المستمدة من سفز (ب) التغييرات في الأسفار فلوو-8. تطبيق مؤثر P2X العامة ATP ونتيجة بزاتب P2X7 مؤثر في قنوات أيون P2X7 فتح، والسماح بتدفق الكالسيوم. تم منع التدفق مع مثبطات محددة P2X7 A438079 أو AZ10606120 (البيانات لا تظهر). F = الأسفار؛ F0 = الأسفار في الوقت نقطة الصفر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تشكيل المسام بخلية يعيش التدفق الخلوي
تشكيل المسام transmembrane سمة متعارف عليه من مستقبلات P2X7، النتائج في تبادل جزيء ضخم، ويمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا. اثيديوم+ جزيء كبير (دا 314) مستبعدة من الخلايا السليمة؛ أن امتصاص والالكترود اللاحقة مع الحمض النووي يؤدي إلى انبعاثات الفلورسنت ويمكن استخدامها لتقييم قدرة المستقبلات P2X7 على شكل المسام ترانسميمبراني. بعد تطبيق يضع ATP (1 مم ATP) وبزاتب (100 ميكرومتر) في 40 s (المشار إليها بالسهم)، الوقت، حل التدفق الخلوي يلتقط بروميد اثيديوم إدخال الخلايا في الوقت الحقيقي (الشكل 3A). وكان يخفف هذا التأثير مثبط محددة P2X7 AZ10606120. مقايسة الامتصاص بروميد اثيديوم يدل مستقبلات P2X7 وظيفية تيرمينوس ج17 وهو دليل جيد لكامل طول التعبير مستقبلات P2X7. فحوصات تركيز-استجابة ATP توضيح آثار تركيز مؤثر في تشكيل المسام P2X7، استخدام التغيير في اثيديوم بروميد الأسفار على مر الزمن (الشكل 3B). منحنيات تركيز الجرعة مؤثر جنبا إلى جنب مع مثبطات مستقبلات محددة توفر أدلة قوية لتنشيط مستقبلات.
الشكل 3: تشكيل المسام ترانسميمبراني P2X7 تقاس بامتصاص اثيديوم. إضافة اثيديوم بروميد لحظات قبل بدء اكتساب يستخدم لقياس تشكيل المسام ترانسميمبراني P2X7. تركيزات عالية من النتيجة ATP وبزاتب في P2X7 (A) مستقبلات المسام تشكيل, يسمح اثيديوم بروميد لإدخال الخلية. مثبط P2X7 AZ10606120 يخفف هذه الظاهرة ويقدم الأدلة على مستقبلات P2X7 الوظيفية. أظهرت فحوصات تركيز-استجابة (ب) ATP تشكيل المسام كبيرة 500 ميكرومتر و 1 مم ولكن ليس في تركيزات أقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
البلعمه بخلية يعيش التدفق الخلوي
فريقنا أثبت سابقا أن ATP الخلية يحول دون وساطة P2X7 البلعمه بالناي P2X7 ج-المحطة من سيتوسكيليتون، على وجه التحديد، نونموسكلي الميوسين معهد مراجعي الحسابات الداخليين18،19. يوسع هذا الأسلوب على هذه النتائج لإثبات تورط مستقبلات P2X7 في البلعمه هيبوكامبال والخلايا العصبية السلف سفز في الوقت الحقيقي (الشكل 4، مثال هيبوكامبال البلعمه). تم إنشاء مستويات غير مأهولة البلعمه (مراقبة) من 1 ميكرومتر YG الخرز مطاط كعنصر إيجابي. أعاق ATP البلعمه حبات YG بنفس القدر كمثبطات غير محدد، إلا وهي التثبيت بمنهاج عمل بيجين وسيتوتشالاسين المانع بلمرة الأكتين د، حين ألغى جميع البلعمه الفطرية20من المصل 5%.
الشكل 4: امتصاص حبة YG مما يدل على قدرة متجولة المتكفل العصبية عن طريق مستقبلات P2X7. YG حبة امتصاص الخلايا العصبية السلف يمكن ملاحظتها باستخدام خلية يعيش التدفق الخلوي في الوقت الحقيقي. مستويات التحكم البلعمه أنشئت في بادئ الأمر، وإذا كان يسمح لعدد الخلايا، أكدت في نهاية الشوط. يتم الإشارة إلى مشاركة مستقبلات P2X7 تثبيط البلعمه حضور ATP، كما هذا ينأى ج-المحطة من cytoskeleton غشاء، منع P2X7 بوساطة cytoskeletal ترتيبات جديدة. حظر تطبيق ATP البلعمه بنفس القدر كاستعمال مثبطات غير محدد من البلعمه، بما في ذلك بارافورمالدهيد (PFA) وسيتوتشالاسين د (سيتد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وتعرض هذه الورقة على بروتوكول مفصل لتحليل وظيفة مستقبلات P2X7 في الثقافات الخلية العصبية السلف المستمدة من منافذ العصبية الكبار. التطبيقات المحتملة للكبار من السلف العصبية الخلايا مجموعة من البحوث لأغراض علاجية، وذلك يجب أن يكون أسلوب ثقافة قوية واستنساخه. وهناك عدد من الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول، قد تؤثر على نوعية الثقافة نقطة النهاية. بمجرد إزالة من الجمجمة، الدماغ لا ينبغي أن تجف وينبغي أن يقوم التشريح بأقصى سرعة ممكنة. لا سيما مع الحصين، سيؤدي إلى الرعاية الإضافية المتخذة لإزالة أي الأوعية الدموية أو الأنسجة الغشائية في غلة خلية السلف متفوقة. عملية الانفصال وتريتوريشن يمكن أن تؤثر بشكل كبير في عدد المجالات التي تم الحصول عليها في ثقافة؛ التحريض الأنسجة خلال الاحتضان مع التربسين يدتا سيؤدي إلى حل أكثر تجانساً. استخدام زجاج مصقول النار المراعي ماصة أكثر P1000 ماصة بلاستيكية نصيحة ينصح بشدة للحد من موت الخلايا وتحسين الثقافة الناتجة عن ذلك. تجنب أوفيرتريتوراتينج. رغم هذه الاحتياطات، الإجراء يمكن إنشاء الكثير من الحطام في ثقافة P0، وتجنب فقدان الخلايا السلف أو الغسيل أو تغذية الثقافة ينبغي تجنب حتى شكلت مجالات.
عدد من الاختلافات بين هيبوكامبال والثقافات سفز سوف يكون واضحا في P0. الثقافات هيبوكامبال تسفر عن عدد أقل من المجالات، وهذه عموما الالتزام. استخدام تلميح ماصة لرفع بلطف من المجالات لمرور الأولية. ولوحظت مجالات ملتصقة لا في الفقرات اللاحقة. ماركات مختلفة من قوارير زراعة الأنسجة قد يتسبب في المجالات، مجالات هيبوكامبال خاصة، الالتزام وتنمو كمستعمرات في الجزء السفلي من الطبق. وهذا لم يتم العثور على تغيير أي النتائج النهائية لهذا البروتوكول ولكن ينبغي رصد، وينبغي الحفاظ على الاتساق حيثما كان ذلك ممكناً.
الطرق السابقة المستخدمة لقياس وظيفة مستقبلات P2X7، مثل تصحيح لقط لتسجيل تدفق الكالسيوم، هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، وربما لا تقدم سوى معلومات في خلية واحدة. ويقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة واستنساخه لتحليل جميع الوظائف الرئيسية الثلاث لمستقبلات P2X7 باستخدام جهاز واحد. الخلوي حل الوقت تدفق الخلية يعيش يسمح بتحليل جميع السكان ويوفر الباحث بمعلومات تتعلق بحركية تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام، و/أو الدالة متجولة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التدفق الخلوي بسهولة كطريقة لتقييم أنماط التعبير علامة والتحليل السكاني استناداً إلى مستويات التعبير الحجم أو البروتين في الخلية.
وعند إجراء هذه التجارب، يمكن ملاحظة الاختلافات في تدفق الكالسيوم القصوى أو امتصاص اثيديوم معدلات البلعمه بين تكرار. لتقليل هذا، حجم المجال، شروط الثقافة، وتغذية النظام يجب أن يكون متسقا صحة الخلايا سيكون لها تأثير كبير على النتائج التي تم الحصول عليها. الوقت على الجليد يمكن أن تؤثر أيضا البيانات، حتى تكفل كل شيء أعد قبل الوقت المحدد حتى لا يكون الحد الأدنى الوقت على الجليد. ضمان اتساق صبغ مؤشر الكالسيوم وقت التحميل. وثمة عامل آخر يمكن أن تؤدي إلى تناقضات كبيرة في التسجيلات الكالسيوم القصوى هو التباين بين دفعات ATP. إعداد الأرصدة ATP بالغ الأهمية، وينبغي تجنب استخدام دفعات مختلفة للتجارب نفسها. ويوصي أيضا مقارنة الدفعات القديمة والجديدة للتأكد من ATP متسقة. كما يمكن فعالية الخصوم P2X7 خط الخلية وتعتمد دفعة، لذلك قد يكون الأمثل لأوقات الاحتضان والتركيزات المطلوبة.
تجدر الإشارة إلى أن التدفق الكالسيوم/افلوكس هي واحدة من المهام الأساسية وأكثرها تعقيداً الخلوية ويمكن أن يكون توسط العديد من مستقبلات. تدفق الكالسيوم المستحثة ATP، كقياس كلاسيكية لوظيفة قناة/المسام P2X7، قد لا تعكس بدقة وظيفة حقيقية من مستقبلات P2X7، ك ATP أيضا تنشيط مستقبلات P2Y لإطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا. وفي هذه الحالة، قد تكون الباريوم الأيونات الموجبة أفضل لاستخدام بدلاً من الكالسيوم كما هو في التدفق أحادي الاتجاه16. للتمييز بين المساهمة من مستقبلات P2Y في تدفق الكالسيوم، يمكن استخدام الظروف حيث يتم إضافة يدتا 1 ملم أو جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N′، حمض N′-tetraacetic (عطا) إلى المتوسطة ك+ بدلاً من كاكل2 في هذا المقايسة.
هذا البروتوكول يمكن أيضا بسهولة تكييفها لتناسب أنواع الخلايا الأخرى، ويمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في وظيفة مستقبلات قناة أيون بديلة أو المستقبلات التي تشارك في البلعمه. هذا الأسلوب أيضا يمكن أن تتكيف مع جهاز تدفق الخلوي دون وحدة نمطية وقت. على سبيل مثال، قد يتم تنفيذ فحوصات البلعمه حيث يتم إضافة الخرز YG 7-8 دقيقة قبل التحليل بقياس التدفق التقليدي. تبقى الخلايا عند 37 درجة مئوية ودوامه مستمرة لهم. وهذا لن يوفر المعلومات في الوقت الحقيقي ولكن الاختلافات في الأسفار النهائي يعني ستبلغ ما زال الباحث فيما يتعلق بالأداء الوظيفي لمستقبلات P2X7.
الفائدة في مستقبلات P2X7 مخدرات تستهدف21،22 أو حتى بتوجيه عملية تسليم المخدرات23،24 يتزايد بسرعة، ولذا يجب أن تكون أساليب لدراسة هذا مستقبلات ملغز باستمرار تكييفها وتحسينها إلى تسهل هذه الدراسات. هذا البروتوكول يحدد المنهجيات التي يمكن استخدامها لاستكشاف الدالة P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار، ومن المأمول أن تحقيق فهم أكبر لمستقبلات P2X7 في منافذ العصبية قد تؤدي إلى إحراز تقدم في علاج السكتة الدماغية و الإصابات الدماغية الأخرى.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر ماريا قصرمان وشين هوانغ لمساهماتها في هذا البحث. بتأييد هذا العمل بمنح من "ريبيكا ل. كوبر مؤسسة البحوث الطبية" M.W.، T.C.L.، وحركة التحرير، وإلى T.C.L. من "الوطنية للصحة" ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) من أستراليا (571100 و 1048082) و (مؤسسة خيرية باكستر سيدني، أستراليا). جي أيده الزمالة مستقبل مجلس البحوث الأسترالية (ARC) (FT120100581)، وتمويل مشروع المنح (1048082 و 1061419 و 1120095) والتشغيلية منحة الحكومة الفيكتوري دعم البنية التحتية للمعهد فلوري. وأيد حركة التحرير تشارلز دال كيلمان، دكتوراه في الطب ما بعد الدكتوراه مكافأة (2010) من الدولي الشبكية بحوث مؤسسة (الولايات المتحدة الأمريكية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
References
- Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
- Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
- Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
- Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
- Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
- Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
- Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
- Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
- Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
- Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
- Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
- Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
- Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
- Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
- Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
- Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
- Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
- Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
- Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).
