Summary
단일 셀 감도 제공, 실시간 cytometry은 유일 하 게 라이브 문화의 복합 수용 체 기능을 계량 적합 합니다. 성숙한 신경 조상 세포를 사용 하 여, P2X7 수용 체 기능 칼슘 유입 칼슘 표시기 염료, ethidium 평범한 사람 통풍 관, 그리고 형광 라텍스 비즈를 사용 하 여 식 균 작용에 의해 막 횡단 기 공 형성에 의해 감지를 통해 평가 했다.
Abstract
라이브 셀 cytometry 점점는 세포 생물학 중 생활에서 생물 학적 과정을 계량 세포 배양. 이 프로토콜에 의하여 라이브 셀 cytometry 확장 시 실시간으로 P2X7 수용 체 활성화의 여러 기능을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 교류 cytometer에 설치 시간 모듈을 사용 하 여, 라이브 셀 기능 평가 고 칼슘 유입, 막 횡단 기 공 형성 및 식 균 작용의 활동을 탐구 하는 주어진된 시간 동안 꾸몄다. 이 간단한 방법은 유리 P2X7 수용 체의 모든 3 개의 정식 기능 한 기계를 사용 하 여 평가 될 수 있다 하 고 시간이 지남에 플롯 수집된 데이터 정보를 제공 합니다 단일 셀 녹음 보다는 전체 라이브 세포 인구에 자주 기술적으로 도전적인 패치 클램프 방법을 사용 하 여 얻을. 칼슘 유입 실험 칼슘 지시자 염료를 사용 하 여, P2X7 기 공 형성 분석 ethidium 평범한 사람은 막 횡단 통과를 허용에 의존 높은 주 작동 근 농도 따라 형성 된 기 공. 노란색-녹색 (YG) 라텍스 구슬 먹어서 측정에 활용 됩니다. 특정 주 작동 근 그리고 길 항 근은 P2X7 수용 체 활동의 효과 조사 하기 위해 적용 됩니다. 개별적으로 이러한 방법은 칼슘 채널 및 purinergic 및 폐품 수용 체의 수에 정량적 데이터를 제공 하도록 수정할 수 있습니다. 함께 찍은, 그들은 어떻게 실시간 라이브 셀 cytometry 사용은 P2X7 수용 체 기능을 조사 하는 빠른, 비용, 재현성, 고 정량 방법을 강조 표시 합니다.
Introduction
Purinergic 신호의 연구는 광범위 하 고 다각적인, 세포 생리학, 생화학, 약리학 관련. Purinergic 신호는 암 세포 세포 커뮤니케이션을 줄기 세포 생물학; 세포 주기 규칙에서 세포질과 분자 과정의 무한 한 수에 관여 따라서, 거기 자주 purinergic 치료 혜택에 대 한 신호를 변조 가능성이 존재 합니다. Purinergic 수용 체의 P2X7 수용 체는 수많은 염증 성 조건1에 대 한 치료 대상으로 최근 몇 년 동안 그것의 잠재력 때문에 상당한 주목을 받았다 있다. 수용 체를 공부 하는 방법 진화 하 고이 연구2,3,,45를 촉진 하기 위하여 수 년에 걸쳐 적응 되었습니다. 여기, hippocampal가 이랑 帯 (SVZ)에서 파생 된 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7의 여러 기능을 조사 하는 라이브 셀 흐름 cytometry 방법을 설명 합니다.
P2X7 수용 체 처음 P2Z 수용 체, 또는 큰 막 횡단 공 침투성 900 다6까지 분자의 형성에 아데노신 3 인산 염 (ATP) 결과의 높은 농도 가진 그것의 활성화로 '세포 죽음' 수용 체로 설명 했다. 이것은 cytoskeletal 재배치, 막 횡단 기 공 형성 하 고, 잠재적으로, apoptosis 또는 괴 사7. 전통적으로, P2X7의이 기능 형광 DNA3,8삽입 된 때 요-프로-1 또는 ethidium 평범한 사람, 같은 큰 분자량 염료의 통풍 관에 의해 정량 이다. 플레이트 리더 방법을 빠른 고 upscaling 허용, 일반적으로 활동의 관찰에 대 한 허용 하지 않습니다. 여기 설명 하는 방법을 브로민 이해에 기반 하의 기 공 형성의 속도 관하여 정보를 더 깊이 제공 시간이 지남에 관찰 형광 증가 하며 P2X7 수용 체 이후 여러 노출 시간 및 주 작동 근 농도9,10에 따라 뚜렷한 응답으로 nonimmune 기능을 촉진 하기 위해 표시 되었습니다. ATP의 낮은 농도 의해 간단한 활성화 양이온 유입에 신경 전달 물질 및 신호 변환11의 목적에 대 한 결과. Cytometry 칼슘 유입 측정을 사용 하 여 복잡 하 고 기술적으로 도전적인 방법과 관련 된 문제를 극복-특히, 걸쳐 잠재력에 있는 변화에 관해서는 귀중 한 정보를 제공 하는 내부 전류를 측정 하기 위해 클램핑 패치 세포 막 하지만 인구 분석2에 대 한 허용 하지 않습니다. P2X7 수용 체의 3 기능 ATP, 면역계와 신 경계9,,1213식 균 작용을 촉진 하기 위하여 P2X7 수용 체를 설명 했다 되었습니다의 부재에서 발생 합니다. 정량화 및 인구 분석 아직도 도전을 제시할 수 있습니다 비록 현미경 검사 법 기술에 있는 전진 이해 하는 동안 cytoskeletal 재배열의 시각화를 허용 했습니다.
여기 상세한 라이브 셀 흐름 cytometry 방법을 실시간으로 P2X7 수용 체의 모든 세 가지 주요 기능 조사 수 있습니다. 에 교류 cytometer 시간 모듈 장치 포함 온도 제어 및 현 탁 액 셀의 지속적인 감동 수 있습니다. 두 번째, 세포질 응답의 근처 중단된 측정을 수 있도록 내 주 작동 근 그리고 길 항 근 자극을 전달할 수 있습니다. 이 reproducibly 여러 분석 결과 시스템의 사용을 피하고 있는 동안 함수를 계량 하는 신속 하 고 간단한 방법을 제공 합니다. 그것은 중요 한 것이 프로토콜 모든 셀 형식에 맞게 쉽게 적용할 수 있습니다 특정 촉진제 또는 억제제, 그들의 속성에 따라 포함 주어진 다른 수용 체 하위 검사 하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
동물 과학적 목적에 대 한 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습에 따라 처리 하 고 그리피스 대학 동물 윤리 위원회에 의해 사용을 위해 승인 되었다.
1. Neurosphere 문화 성인 SVZ와 해 마의 신경 조상 세포의
참고: 여기 해 부 프로토콜 기반 작업 워커와 Kempermann, 그리고 성인 쥐에서 신경 조상 세포의 해 부에 대 한 자세한 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수14. 문화 조건 간디와 동료15에서 수정 되었습니다. 8-12 주 세 성인 여성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.
- 생물 안전 캐비닛, 준비와 신경 줄기 세포 확산 보충, 2mm 글루타민, 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF), 2 µ g/mL 보충 문화 매체 (신경 기저 매체) 헤 파 린입니다.
- CO2 흡입에 의해 두 마우스를 안락사. 또는 기관의 지침에 따라 마우스를 anesthetize 하 고 즉시 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 70% 에탄올과 그들의 머리를 스프레이 하 고 그들을 목을 벨. 1 x 페니실린/스 솔루션 (P/S)와 포함 하는 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 무 균 튜브에 각 머리를 전송.
- 해 부 현미경 아래 층 류 두건에 해를 수행 합니다.
- 집게 및 해 부가 위를 사용 하 여 조직과 뼈 노출은 뇌를 제거 하 고 HBSS P/미와를 포함 하는 메 마른 요리에 그것을 전송합니다
- 뇌 복 부 측을 놓고 메스 블레이드를 사용 하 여 광학 chiasm에 걸쳐 완전 한 코로나 절 개를 하 게 합니다. 집게와 꾸준한 두뇌를 보유 하 고 사용 하나 스위프트, 깨끗 한, 하강 운동. 세포 죽음을 최소화 하 고 조직 구조를 유지 하기 위해 톱 질 하지 마십시오.
참고: 안전 하 게 지지, 두뇌 앞으로 기울 수 컷, 동안에 SVZ에서 얻은 조상 세포의 수를 손상 시 키 지. - 두뇌의 rostral 절반에서 SVZ를 격리 합니다.
- 두 심을, 그들 위에 흰색 다리를 형성 하는 신체 callosum, 심장으로 구분을 찾습니다.
- 집게를 사용 하 여 두 심 분리 심장 제거 하 고 앞쪽 측면 심의 측면 벽을 격리. 이렇게 멀리 위, 아래, 측면, 그리고 앞에 잘 해 부가 위 절단 합니다. 그냥 작은 컵 같은 모양이 유지 됩니다.
- HBSS는 중간에 몇 방울으로 깨끗 한 Petri 접시 뚜껑을 준비 하 고 액체에는 SVZ를 전송. 건조 하거나 마른 표면을 조직을 허용 하지 않습니다. 고 된 해 부 동안 옆에 서 있다.
- 두뇌의 꼬리 반에서 된 격리 합니다.
- 중간 절단 신체 callosum에 반구 사이 컷을 확인 합니다. 측면 심 가이드로 사용 하 고 노출 해 마 피를 부드럽게 전개. 일단 피 질 압 연 하고있다, 해 마는 조밀 하 고, 백색, 곡선 구조로 볼 수 있습니다.
- 잘 해 부가 위 또는 집게를 사용 하 여 인접 조직에서 해 마를 분리.
- 집게와 초과 백색 질, 혈관, 및 해 마를 덮고 어떤 막 조직을 제거 합니다.
- 깨끗 한 Petri 접시 뚜껑 HBSS의 몇 방울과 함께 준비를 준비 하 고 액체에는 해 마를 전송. 다른 반구에 대 한 반복 합니다.
- 해 마와 두 개의 마우스에서 SVZ 절연 되었고 그들의 각각 샬레 뚜껑을 전송, 일단 기계적 조직 메스 블레이드를 사용 하 여 주사위. 약 1 분 동안 한 Petri 접시 뚜껑에 조직을 잘라, 회전 마다 10 s 조직 부드러운 때까지 및 정밀한 조각만 남아 있다. 깨끗 한 메스 블레이드를 걸릴 고 다른 접시, 1 분 동안 조직 다이 싱에 대 한 반복 합니다.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 포함 하는 튜브를 분리 하 각 페 트리 접시의 뚜껑에서 모든 조직 전송. SVZ와 해 마에 대 한 1 개의 관에 대 한 하나의 튜브를 사용 합니다.
- 이렇게 첫 번째 pipetting 기포를 최소화 하 고 튜브를 전송으로 건조 피 펫 팁의 접촉으로 오는 조직 방지 하기 위해 접시에 조직에 트립 신-EDTA의 절반 합니다. 접시와 수집 가능한 많은 조직 관에 그것을 추가 하는 트립 신-EDTA의 나머지와 함께 메스 칼 린스.
- 30 분, 제대로 조직 분리를 튜브 마다 10 분 교 반에 대 한 37 ° C 물 욕조에 트립 신으로 조직 품 어.
- 단일 세포 현 탁 액을 화재 광택 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직 triturate 알아서 하지 overtriturate이 과도 한 세포 세포의 용 해를 일으킬 것입니다. 이것은 최적의 조직 분리에 대 한 중요 한 단계 이다.
- 분쇄 과정에서 튜브 내용을 관찰 하 고 조직 덩어리의 대부분 제거 된 초기 징후에 중지. 트립 신 솔루션 해야 될 약간 흐린 셀 단일 셀 서 스 펜 션에 갔을 때 비록 일부 대단히 짧은 시간에 남아 있을 수 있습니다.
참고: 표시로 전달 10 x-15 x 위아래로 정지 적절 한입니다. - 문화 매체 추가 중화 하는 트립 신, 고 추가 3 분 세척에 대 한 300 x g 에서 회전까지 5 mL HBSS와 패스 2 x 70 µ m 셀 거르는 어떤 조직을 제거를 통해 매체 묶습니다.
- T75 셀 문화 플라스 크에 매체의 15 mL의 모든 셀을 전송 합니다.
참고: 제로 (P0) 통로에서 형성 한다 구체 SVZ 문화 그리고 hippocampal 문화에서 15-20 일 후 7-10 일 후. 세척 또는 문화에 있는 신경 조상 세포의 수를 최대화 하려면이 시간 동안 세포를 먹이 기에서 후 렴. 더 많은 창시자는 필요, 또는 경우 P0 보육 시간 감소, 그것은 희생 하는 쥐의 수를 늘릴 수 있습니다. - 37 ° C와 5% CO2 , 초기 P0 문화 단계에서 문화를 유지, 생물 안전 캐비닛 및 표준 조직 문화 사례를 사용 하 여 필요에 따라 모든 7-10 일 통행.
참고: P0 hippocampal 문화 T25 플라스 크;에 통로에 충분 한 분야를 생성 한다 SVZ 문화 많은 더 많은 분야 생성 되 고는 T75에 passaged 수 있습니다. P0 hippocampal 분야는 준수 하는 경우 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 영역을 부드럽게 리프트. - 그들은 150 ~ 200 µ m 직경에 도달 했을 때 구체 통로. 분야와 매체 15 mL 튜브에 수집 하 고 약 5 분 또는 중력에 의해 정착, 2 분 동안 저속 (100 x g)에 스핀을 구체 허용.
- 매체를 제거 하 고 분리 시 약 분야의 크기에 따라 7-10 분에 대 한 셀을 분리.
참고: 분리 시 약 사용 그래서 문화권의 결과에 상당한 영향을 있을 것 이다 구체적인 테이블의 자료 를 참조 하십시오. - 세척 셀 솔루션을 위해 3 분 300 x g 에서 원심 분리기 HBSS의 5 mL을 추가 하 여 셀 제거는 상쾌한, 문화 매체에 셀 resuspend 및 T25 세포 배양 플라스 크 또는 이와 동등한 매체의 5 mL에 약 150000 셀에서 씨앗. 37 ° C, 5% CO2에서 문화를 유지 합니다.
- 모든 다운스트림 프로토콜9를 진행 하기 전에 줄기 세포 마커 Sox2, ASCL1 등의 식 식별 하 여 신경 조상 세포 상태를 확인 합니다.
참고: 이 연구원의 선호 되는 방법 (예를 들어,: immunochemistry 현미경 검사 법, cytometry 또는 서쪽 오 점 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여)에 의해 행 해질 수 있다.
2. Cytometry 분석에 대 한 단일 세포 현 탁 액의 준비
-
필요한 미디어를 준비 합니다. 다음 포함 됩니다.
- 145 mM NaCl, 5mm 코, 10 mM HEPES, 5mm D-포도 당, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 그리고 0.1 m m CaCl2 나+ 매체 를 준비 합니다. 이 매체는 칼슘 무료 양식, 0.1 m m CaCl2 생략에 사용 됩니다.
- K+ 매체 145 m m KCl, 5mm 코, 10 mM HEPES, 5mm D-포도 당, 그리고 0.1 %BSA 준비 합니다.
참고: 이러한 미디어 최적화 광범위 하 게 했다 고 이전 간행물4,5에 자세히 나와 있습니다. - 100 m m 재고의 약 20 mL에 대 한 충분 한 ATP 분말 무게 재고 ATP 를 준비 합니다. KCl 버퍼 (145 m KCl m, 5 m m 코, 그리고 10 mM HEPES, pH 7.5)의 17 mL에 분말 고 천천히, 교 반, 동안 pH 6.8-7.0가지고 솔루션을 18% (w/v) 하거나 수산화 (TMA)의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 20 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다. PH 7.0 과거 오버 슈트 하지 마십시오. 재고-80 ° C에서 저장 참고 최소 6 개월에 대 한 ATP aliquots는 안정.
참고: 무수 ATP의 무료 분자량은 551.14 g/mol, 그리고 배치에서 배치에 따라 달라질 수 있습니다 고 계산에 대 한 고려 사항으로가지고 야 한다 물과 disodium 분자의 분자량은 포함 되지 않습니다. TMA은 독성, 그리고 주의 해야 합니다 처리 하는 경우. 안전 데이터 시트와 연기 캐비닛에 주식 준비를 읽어 보시기 바랍니다. - 주식 BzATP 초순 H2O 10 m m의 마지막 재고 농도 대 한 BzATP을 용 해 하 여 준비 합니다.
- 1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. Hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. (아래와 같이) 실시 되는 실험에 대 한 필요한 매체 (예를들면, Na+ 매체, 문화 매체)에 셀 resuspend 하 고 반면에 얼음에 셀을 놓습니다.
- 각 실험에 대 한 충분 한 샘플 전압 및 보상 설정의 교정 뿐만 아니라 앞으로 및 측면 분산형, 컨트롤을 포함 하는 확인 합니다. Note, 표시, T75 플라스 크에서 일반적으로 성장 하는 분야 플라스 크 당 약 8 x 106 세포 생성.
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교류 cytometer 설정을 컨트롤 샘플을 사용 하 여 설정 합니다.
- 앞으로 및 측면 분산형을 사용 하 여 선택적으로 살아있는 세포를 게이트.
참고: 앞으로 분산형 측면 분산형 내부 복잡성 또는 세분성의 측정값을 제공 한다 빛의 회절에 따라 셀 크기에 관한 정보를 제공 합니다. 스몰 포워드와 사이드 분산형 흐름 이벤트 죽은 세포로 간주 될 수 있습니다. - 전압을 조정 하 고 제조업체의 지침에 따라 교류 cytometer의 이득. 최대 형광 강도에서 데이터의 캡처 수 있도록 시험 샘플을 실행 합니다. 보상은 단일 채널 인수에 대 한 필요 합니다.
- 앞으로 및 측면 분산형을 사용 하 여 선택적으로 살아있는 세포를 게이트.
3. 라이브 셀 흐름 Cytometry 칼슘 유입 측정
- 단일 셀 서 스 펜 션의 준비에 따라 칼슘 무료 나+ 매체의 1 mL에 셀 resuspend 및 제조업체의 프로토콜에 따라 칼슘 지시자 염료의 2 ng/mL와 함께 그들을 로드 ( 테이블의 자료를 참조)와 10 µ L 5 %pluronic 산. 37 ° c.에 30 분에 대 한 셀을 품 어
- 세포 칼슘 무료 나+ 매체의 3-5 mL을 추가 하 고 부드럽게 centrifuging 여 세척 (200 x g 4 분). 상쾌한을 제거 하 고 두 번 세척 칼슘 무료 나+ 매체에 셀 resuspend.
- Resuspend 칼슘 무료 나+ 매체의 1 mL에 셀, 얼음에 고 드 30 분 esterify 하도록 허용.
- 1 x K+ 매체의 3-5 mL을 추가 하 고 (200 x g 4 분); centrifuging 여 더 씻으십시오 그런 다음 resuspend k+ 매체 및 aliquot 셀 그들 (FACS) 정렬 보조 셀 튜브 FACS 튜브 당 500 µ L 당 1 x 106 세포의 농도에 형광으로.
참고: FACS 튜브 샘플 당 수 치료의 수에 따라 달라 집니다 고는 포함을 반복 합니다. - 셀 분석할 준비가 될 때까지 얼음에 FACS 튜브를 놓습니다. 오랜된 기간 동안 얼음에 셀 떠나 지 마 하지만 분석 결과 최대한 빨리 시작.
- 일부 샘플에 대 한 preincubate P2X7 수용 체 특정 억제제 AZ10606120 셀 (1 µ M 10-15 분) 또는 A438079 (30 분 10 µ M) 분석 이전 37 ° C에서.
- 첫 번째 샘플을 실행 하기 전에 몇 분 (FACS 튜브에 1 mM의 최종 농도)에 CaCl2 를 추가 하 고 복구 하는 37 ° C 물 목욕에서 튜브를 놓습니다.
- 깨끗 한 삭제, FACS 튜브 및 위치에 작은 자력 제어 샘플 온도 순환 37 ° C 물 목욕 시간 모듈에 튜브 연결. 소용돌이 효과 도입 하지 않고 샘플의 움직임을 보장 하기 위해 낮은 교 반 속도 선택 합니다. 물 재킷 튜브 어댑터 샘플 플랫폼에 놓고 FACS 기계의 레버 팔을 닫습니다.
- 샘플 수집을 시작 하 고 초당 약 1000 이벤트에서 3 분에 대 한 샘플을 실행 합니다.
- 40 s 마크, 신속 하 게 튜브를 제거 하 고 추가 P2X7 주 작동 근, ATP 1 mM 또는 300 µ M BzATP, 인수를 계속 해 서 튜브를 교체 하 고.
- 첫 번째 샘플을 녹음 하는 동안 CaCl2 두 번째 샘플을 준비 하 고 분석 하기 전에 워밍업을 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 37 ° C에. 첫 번째 샘플 완료 되 면, 물 샘플을 실행 하 여 섭취를 청소 하 고 두 번째 샘플의 수집 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로 시작할 수 있습니다. 항상 샘플 사이 섭취 청소.
4. 측정 라이브 셀 Cytometry에 의해 기 공 형성
- 1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 오래 된 매체의 몇 밀리 리터를 저장 하 고 resuspend FACS 튜브 당 100 µ L 당 1 x 106 세포의 농도에서 세포를 그것을 사용 하 여 준비까지 얼음에 그것을 배치.
- 분석 결과 실행 하기 전에 1 mL의 최종 볼륨에 대 한 K+ 매체의 900 µ L을 추가 하 고 복구를 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 배치 합니다.
- 해당 되는 경우 치료, P2X7 전용 억제제 AZ10606120를 포함 하 여 셀 preincubate (10-15 분 1 µ M) 또는 A438079 (30 분 10 µ M).
- 분석 결과 실행 하기 전에 즉시 추가 25 µ M ethidium 평범한 사람 FACS 튜브; 그런 다음, 자력, 추가 단계 3.7에 따라 FACS 기계에 그것을 배치 하 고 인수를 시작.
참고: Ethidium 평범한 사람은 독성, 그리고 주의 해야 한다 그것을 처리 하는 경우. FACS 튜브 사용된 적절 하 게 폐기 합니다. - 세포 막에 있는 숨 구멍의 대형을 유도 하는 수집의 시작 후 1mm ATP 또는 100 µ M BzATP 40 s를 추가 합니다.
- 6 분 동안 초당 약 1000 이벤트에서 샘플을 실행 합니다.
- 첫 번째 샘플을 실행 하는 동안 두 번째 샘플은 얼음에서 고 37 ° C 물 목욕 분석 전 복구 하 셀에 대 한 충분 한 시간을. 첫 번째 예제는 인수 완료 되 면, 물 샘플;를 실행 하 여 섭취를 청소 그런 다음, 두 번째 샘플 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로 녹음을 하려면 컴퓨터에 배치할 수 있습니다.
5. 측정 라이브 셀 Cytometry에 의해 식 균 작용
- 1.16-1.17 단계에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다. 조건된 중에 FACS에 FACS 튜브 당 100 µ L 당 1 x 10 이상6 셀의 농도에 관 약 수 셀 resuspend 1 x 106 셀/mL 나+ 매체의 최종 농도에 세포를 희석 (예를 들어, 추가 나+ 매체의 900 µ L) 분석 수행 될 때까지 얼음에 셀을 놓습니다.
- Phagocytic 대상으로 YG 라텍스 구슬 (스피어)의 1 개의 µ m를 사용 하 여 실시간 먹어서 분석 실험에 대 한.
참고: 다른 색상도 대체 될 수 있습니다, 하지만 다르게 크기의 구슬을 먹어서4의 부적당 한 표적이 될 것을 발견 했다. - 첫 번째 예제를 실행 하기 전에 셀 37 ° C 물 목욕을 전송 하 고 복구를 셀 수 있도록 약 7-10 분 동안 그들을 품 어.
-
1mm ATP 15 분을 포함 하 여 그들의 각각 튜브에 preincubation를 요구 하는 어떤 처리 든 지 추가, 300 µ M 산화 ATP (oxATP) 40 분, 20 분 및 20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 20 µ M cytochalasin D.
- 아무 preincubation는 5% 인간 혈 청에 대 한 필요 합니다. 치료 약 동시에 추가 하는 경우 샘플 실행할 수 있습니다 반대 순서로 다른 사람 품 어를 계속 하는 동안. 예를 들어 실행 컨트롤 및 혈 청 먼저, 다음 ATP 치료 샘플, cytochalasin D와 PFA, 그리고 oxATP 마지막 다음.
- 샘플에는 자력으로 cytometer 3.8 및 3.9 단계에 설명 된 대로 놓고, 다음, 샘플 수집을 시작 합니다.
- 제거 샘플 튜브는 기계에서 15-20의 수집, 시작 후 고 undiluted YG 구슬의 5 µ L를 추가 합니다. 샘플 FACS 튜브를 반환 하 고 인수를 계속 합니다. 약 1000 이벤트/s에서 7-8 분에 대 한 샘플을 실행 합니다.
- 첫 번째 샘플을 실행 하는 동안 두 번째 샘플은 얼음에서 고 분석 전 복구 하 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 하는 37 ° C 물 목욕에. 첫 번째 샘플 완료 되 면 섭취 물 샘플을 실행 하 여 깨끗 하 고, 다음, 두 번째 샘플에 수집을 시작 하는 단계 3.8 및 3.9에에서 설명 된 대로.
6. 데이터 분석
- 스프레드시트 데이터를 내보냅니다. 데이터 분석 실험 질문에 따라 달라 집니다.
참고: 주의 시작에 지정 된 시간에 대 한 분석 결과 실행 하는 것이 중요 하다 그래서 다른 실행 다른 초기 농도을 할 수 있습니다 (약 40 s) 형광 (형광 변화를 계산 하 여 데이터를 정규화 하 고 어떤 촉진제를 추가 하기 전에 주어진 시간 포인트 [F] 형광 시간 포인트 0에서 [F0], 또는 F/F0 나눈에). - 계량 속도 또는 P2X7 함수에의 활동, 곡선 또는 곡선 각 10 s 시간 기간16에서 사다리꼴의 합계 아래 영역을 계산 합니다.
- 치료의 효과 확인 하려면 기록의 마지막 10-20 s 형광 강도 평균 고 치료 됩니다. T의미 확인-테스트 또는 분산 분석.
Representative Results
신경 조상 세포 배양
이 메서드를 사용 하 여 파생 된 신경 조상 구 문화 단계 밝은 부드러운 둥근 가장자리 (그림 1AB)을가지고 있어야 합니다. 건강 한 문화에서 작은 microspikes (그림 1C) 가장자리에 관찰할 수 있습니다. 늦은 통행, 또는 부적당 하 게 먹이 면 분야 빈 컵 모양 (그림 1D) 또는 큰 직사각형 모양 (그림 1E, 화살표로 표시)를 형성할 수 있다. 이러한 문화는 사용할 수 없습니다 cytometry 또는 다른 다운스트림 응용 프로그램, 이러한 기능으로는 것이 차별화의 지표. 신경 뿌리 상태를 확인 하려면 셀 폴 리-L-ornithine와 immunocytochemistry에 대 한 laminin 코팅 유리 coverslips에 도금 했다 (그림 1 층 고, 더 높은 confluency, 그림 1G에서). 세포는 GFAP nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1, 및 DCX 타입 2 조상 세포 (해 마) 또는 C 조상 세포 (SVZ)9셀을 식별 하기 위해 얼룩 했다. 셀은 확장된 프로세스는 잘 정의 된 핵 있어야 합니다.
그림 1: 대표적인 hippocampal 신경 조상 세포 배양. (A) Hippocampal 신경 조상 세포 성인 쥐에서 격리 되며 약 100 ~ 150 µ m 직경에서까지 neurospheres로 교양. (B) Neurospheres 부드러운 주변, (C) 고 작은 microspikes 수 있습니다 그들의 표면에 관찰. 분야는 문화에 너무 오래, 그들은 (D) 컵 또는 (E) 직사각형 모양을 형성할 수 있다. 이러한 문화는 실험을 위해 사용할 수 없습니다. 세포의 신경 뿌리 상태를 확인 하려면 폴 리-L-ornithine (PLO)와 immunochemistry에 대 한 laminin 코팅 유리 coverslips에 단일 세포 현 탁 액으로 종자. 세포는 낮은 confluency 및 immunochemistry에 대 한 준비 (G)에서 작은 소마 및 분기 프로세스, (F) 있어야 한다. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
라이브 셀 cytometry에 의해 칼슘 유입
이 프로토콜은 실시간으로 칼슘 채널 P2X7 수용 체 기능 분석에 대 한 수 있습니다. 수용 체 기능의 활동 뿐만 아니라 다른 주 작동 근 그리고 길 항 근의 효과 평가 수 있습니다. 이상의 플롯 될 때에 있는 hippocampal 칼슘 유입 시간과 SVZ 신경 조상 세포 일반적으로 유사 했다 (그림 2A 및 그림 2B, 각각). 촉진제 (ATP 또는 BzATP)는 빨간색 화살표로 표시 된 대로 40 s 마크에 추가 되었습니다. 짧은 순간에 대 한 튜브는 주 작동 근, 결과 0의 데이터 요소에 추가 하려면 기록 지점에서 제거 됩니다. 이 주 작동 근 추가할 때 시간의 식별에 허용할 것 이다. BzATP 이온 채널을 열고 있는 Fluo-8에 바인딩하고 fluoresces 칼슘 유입 수 있도록 빠르게 P2X7 수용 체를 활성화 합니다. ATP 응용 프로그램은 일반적으로 더 점진적 칼슘 유입에서 발생합니다. 그것은 P2X7 BzATP에 비해 선호도 낮은 있으며 또한 G 단백질 결합 된 수용 체 활성화, 느린 신호 통로 바인딩과 그물에서 칼슘을 해제 귀 착될 것 이다. P2X7 길 항 근 A438079와 AZ10606120의 포함 (데이터 표시 되지 않음) 주 작동 근 응용 프로그램에 대 한 응답에서 칼슘 유입 감소.
그림 2: 해 마 및 SVZ에서 신경 조상 세포에서 라이브 셀 칼슘 유입. P2X7 수용 체 칼슘 채널 기능 (A)에서 설명 되었다 hippocampal 변화 Fluo-8 형광에 의해 (B) SVZ에서 파생 된 조상 세포. 일반 P2X 주 작동 근 ATP와 P2X7 이온 채널 개방, 허용 칼슘 유입의 P2X7 주 작동 근 BzATP 결과의 응용 프로그램. A438079 또는 AZ10606120 P2X7 전용 억제제와 유입 차단 (데이터 표시 되지 않음). F = 형광; F0 = 0 시간 시점 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
라이브 셀 cytometry에 의해 기 공 형성
막 횡단 기 공 형성은 P2X7 수용 체, 고분자 교환, 결과의 정식 기능 및 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 브로민+ 은 건강 한 세포;에서 제외는 큰 분자 (314 다) 그것의 이해 및 DNA와 후속 윤 형광 방출 귀착되 고 막 횡단 숨 구멍을 형성 하는 P2X7 수용 체의 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 촉진제 ATP (1mm ATP) 및 BzATP의 응용 프로그램에 따라 (100 μ M) 40에 s (화살표로 표시), 시간 해결 cytometry 실시간 (그림 3A)에 셀 입력 ethidium 평범한 사람을 캡처합니다. 이 효과 P2X7 전용 억제제 AZ10606120에 의해 감쇠 했다. Ethidium 평범한 사람 이해 분석 결과 기능 P2X7 수용 체 C-말단17 보여줍니다 이며 전체 길이 P2X7 수용 체 식에 대 한 좋은 증거. ATP 농도 응답 분석 (그림 3B) 시간별 ethidium 평범한 사람 형광의 변화를 사용 하 여 P2X7 기 공 형성에 주 작동 근 농도의 효과를 보여 줍니다. 특정 수용 체 억제제와 함께 주 작동 근 복용량 농도 곡선 수용 체 활성화에 대 한 강력한 증거를 제공합니다.
그림 3: 브로민 통풍 관에 의해 P2X7 막 횡단 기 공 형성 측정. 수집의 시작 전에 ethidium 평범한 사람 순간의 추가 P2X7 막 횡단 숨 구멍의 대형을 측정 하는 데 사용 됩니다. (A) P2X7 수용 체에 ATP와 BzATP 결과의 높은 농도 형성, ethidium 평범한 사람 셀을 입력 하려면 수 기 공. P2X7 억제 물 AZ10606120이이 현상 약화 하 고 기능 P2X7 수용 체에 대 한 증거를 제공 한다. (B) ATP 농도 응답 분석 500 μ M와 1mm만 더 낮은 농도에 중요 한 기 공 형성을 설명 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
라이브 셀 cytometry에 의해 식 균 작용
우리의 그룹 이전 extracellular ATP P2X7 C-말단에는 골격에서 해리 하 여 P2X7 중재 먹어서 억제 보여주었다 특히 nonmuscle myosin IIA18,19. 이 방법은 hippocampal 의해 식 균 작용의 P2X7 수용 체 참여를 설명 하기 위해 이러한 결과에 확장 하 고 SVZ 신경 조상 세포 실시간 (그림 4, hippocampal 먹어서의 예). 1 µ m YG 라텍스 구슬의 노골적인된 먹어서 (제어) 수준 긍정적인 통제로 설립 되었다. ATP 5% 혈 청 폐지 모두 타고 난 먹어서20동안 일반적인 억제제, 즉 PFA 고정과 말라 중 합 억제제 cytochalasin D로 동일한 정도로 YG 구슬의 식 균 작용을 저해.
그림 4: P2X7 수용 체를 통해 신경 창시자의 phagocytic 용량을 보여주는 YG 구슬 통풍 관. 신경 조상 세포로 YG 구슬 통풍 관은 관찰 라이브 셀을 사용 하 여 실시간으로 cytometry 흐름. 식 균 작용의 제어 수준은 처음 설립 되며 셀 수 허용 하는 경우 실행의 끝에 재확인. P2X7 수용 체의 참여로이 해리는 C-말단 막 골격에서 P2X7이 중재 cytoskeletal 재배열을 방지 한다 ATP의 식 균 작용의 억제에 의해 표시 됩니다. ATP의 응용 프로그램 차단 먹어서, paraformaldehyde (PFA), cytochalasin D (CytD) 등의 일반적인 억제제의 사용으로 동일한 정도로 먹어서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 종이 성인 neurogenic 틈새에서 파생 된 신경 조상 세포 배양에 P2X7 수용 체 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 성인 신경 조상에 대 한 잠재적인 응용 프로그램 세포 치료 목적, 연구에서 범위와 그래서 문화 방법 강력 하 고 재현 되어야 합니다. 이 프로토콜 끝점 문화의 품질에 영향을 줄 수 있는 주요 측면의 여러 가지가 있습니다. 두개골에서 제거 되 면 뇌 수 없다는 건조 하 고 해 부를 최대한 빨리 수행 해야 합니다. 해 마와 특히 더 신경 혈관 또는 막 조직을 제거 하 게 뛰어난 조상 세포 수익률 발생 합니다. 분리 및 분쇄 과정 수 무 겁 게 문화;에 분야의 수에 영향을 조직을 트립 신-EDTA와 인큐베이션 기간 동안 교 반 하는 것은 더 균질 해결책 귀 착될 것 이다. 화재 광택 유리를 사용 하 여 플라스틱 피 펫 팁이 세포 죽음을 절감 하 고 결과 문화 향상 좋습니다 P1000 이상 피 펫 목장. Overtriturating 하지 마십시오. 이러한 조치에도 불구 하 고 절차 P0 문화에 파편을 많이 만들 수 있습니다 그리고 조상 세포를 잃고, 세척 또는 문화 먹이 피하기 위해 피해 야 한다 구체 형성 때까지.
다양 한 차이 hippocampal SVZ 문화 P0에 명백한 될 것입니다. Hippocampal 문화가 수익률 적은 분야, 그리고 이러한 일반적으로 준수. 피 펫 팁을 사용 하 여 초기 통행을 위한 분야 떨어져 부드럽게 리프트. 부착 분야 하지 다음 구절에서 관찰 되었다. 조직 배양 플라스 크의 다른 브랜드는 분야를 일으킬 수 있습니다 준수 하는 접시의 하단에 식민지로 성장 특히 hippocampal 분야. 이 변경 하는이 프로토콜에 대 한 모든 다운스트림 결과를 찾을 수 없습니다 하지만, 모니터링 해야 하 고 가능한 일관성을 유지 해야 합니다.
P2X7 수용 체 기능, 칼슘 유입을 기록 클램핑 패치 등을 측정 하는 데 사용 하는 이전 방법 어렵고 힘 드는 되며 단일 셀에 정보를 제공할 수도 있습니다. 이 프로토콜 분석 한 컴퓨터를 사용 하 여 P2X7 수용 체의 모든 세 가지 주요 기능을 신속 하 고 재현할 수 메서드를 제공 합니다. 시간 해결 라이브 셀 cytometry 전체 인구 분석에 대 한 허용 하 고 연구원의 칼슘 유입, 기 공 형성, phagocytic 기능 활동에 관한 정보를 제공 한다. 이것 이외에, cytometry 마커 식 패턴 및 셀 크기 또는 단백질 표정 수준에 따라 인구 분석을 평가 하기 위한 방법으로 쉽게 사용할 수 있습니다.
이러한 실험을 실시 때 최대한 칼슘 유입, 브로민 통풍 관, 또는 먹어서 속도 차이 반복 사이 관찰 될 수 있습니다. 이 영역 크기를 최소화 하기 위해 문화 조건과 정권 먹이 일관적 이어야 셀의 건강 결과에 상당한 영향을 미칠 것으로 한다. 얼음에 시간 또한 영향을 미칠 수 데이터, 그래서 얼음에 시간 최소화 되도록 모든 것은 미리 준비 보장. 로딩 시간 칼슘 표시기 염료 일관성이 있는지 확인 합니다. 최대한 칼슘 녹음에 큰 불일치가 발생할 수 있습니다 또 다른 요인은 ATP 배치 사이 변화 이다. ATP 주식의 준비는 중요 한, 그리고 같은 실험에 대 한 다른 일괄 처리의 사용을 피해 야 한다. ATP는 일관성을 보장 하기 위해 오래 되 고 새로운 일괄 처리를 비교 하는 것이 좋습니다 또한. P2X7 길 항 근의 효과 세포 선 및 일괄 종속, 있을 수 있습니다 부 화 시간과 농도의 최적화가 필요할 수 있습니다.
그 칼슘 유입/경과 가장 근본적이 고 복잡 한 세포 기능 중 하나 이며 많은 수용 체에 의해 중재 될 수 있습니다 지적 가치가 있다. ATP 유도 칼슘 유입, P2X7 채널/기 공 함수에 대 한 고전적인 측정 P2X7 수용 체의 진정한 기능을 정확 하 게 반영 하지 않을 수 있습니다 ATP로 또한 활성화 있습니다 P2Y 수용 체 세포내 칼슘을 출시. 이 경우에, 바 륨의 유입은 단방향16칼슘 대신 사용 하 여 더 나은 양이온을 있을 수 있습니다. 칼슘 유입에 P2Y 수용 체에서 기여를 차별화 하는 조건 1 mM EDTA 또는 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, n, n ′-tetraacetic 산 (EGTA) ′ CaCl2 대신 K+ 매체에 추가 됩니다이 사용 될 수 있습니다. 분석 결과입니다.
이 프로토콜도 쉽게 다른 셀 형식에 맞게 적응 수 있습니다 고 대체 이온 채널 수용 체 식 균 작용에 참여 하는 수용 체의 기능을 조사 하는 데 유용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 시간 모듈 없이 흐름 cytometry 기계에 적응 수 있습니다. 예를 들어, 식 균 작용 분석 어디 YG 구슬 분석 전에 7-8 분에 추가 기존의 cytometry 수행 수 있습니다. 37 ° C에서 세포를 유지 하 고 지속적으로 그들을 소용돌이. 이 실시간 정보를 제공 하지 않습니다 하지만 평균 최종 형광에 차이가 여전히 P2X7 수용 체의 기능에 관한 연구를 알릴 것 이다.
P2X7 수용 체에 대 한 관심 약 대상21,22 또는24 , 급속 하 게 성장 하 고 마약 배달 경로23,로 그래서이 수수께끼의 수용 체를 공부 하는 방법을 지속적으로 해야 적응 및 향상 된 시를 이러한 연구를 촉진 한다. 이 프로토콜 성숙한 신경 조상 세포에서 P2X7 함수를 탐구 하는 데 사용할 수 있습니다 방법론을 설명 하 고 그것은 기대는 뇌졸중의 치료에 있는 전진으로 이어질 수 있습니다 neurogenic 틈새에 P2X7 수용 체의 큰 이해를 달성 하 고 기타 허 혈 성 부상입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 마리아 Kasherman과 티베트 황이이 연구에 그들의 공헌에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에서 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC) 호주 (571100 및 1048082) 및 터 자선 재단 (M.W., T.C.L., 및 메이저 리그, 그리고 T.C.L.를 레 베 카 L. 쿠퍼 의학 연구 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 시드니, 호주)입니다. B.G. 오스트레일리아 연구 위원회 (아크) 미래 친교 (FT120100581), NHMRC 프로젝트 보조금 (1048082, 1061419, 및 1120095) 및 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 그랜트 Florey 연구소에 의해 지원 되었다. 메이저 리그는 찰스 D. 산장, 메릴랜드 박사 수상 (2010) 국제 망막 연구 재단 (미국)에서 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
References
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