Summary
Gir encellede følsomhet, er sanntid flowcytometri unikt tilpasset å kvantifisere flere reseptor funksjoner av levende kulturer. Bruker voksen nevrale stamceller, ble funksjonen P2X7 reseptor vurdert via kalsium tilstrømningen oppdaget av kalsium indikator dye, transmembrane pore dannelsen av ethidium bromide opptak og fagocytose bruker fluorescerende latex perler.
Abstract
Live-celle flowcytometri er vanligere blant celle biologer for å kvantifisere biologiske prosesser i en levende celle kultur. Denne protokollen beskriver en metode der live-celle flowcytometri utvides ved for å analysere flere funksjoner P2X7 reseptor aktivisering i sanntid. Bruker en tid-modul installert på en flyt cytometer, kan live-celle funksjonalitet vurderes og tegnes over en gitt tidsperiode å utforske the kinetics av kalsium tilstrømningen, transmembrane pore dannelse og fagocytose. Denne enkle metoden er fordelaktig som alle tre kanoniske funksjonene til P2X7 reseptoren kan vurderes ved hjelp av en maskin, og samlet data tegnes over tid gir informasjon om hele live-celle befolkningen i stedet for én celle opptak ofte får teknisk utfordrende patch-klemme metoder. Kalsium tilstrømningen eksperimenter bruk en kalsium indikator fargestoff, mens P2X7 pore formasjon analyser stole på ethidium bromide lov til å passere gjennom den transmembrane pore dannet på høy Agonistiske konsentrasjoner. Gul-grønn (YG) latex perler benyttes for å måle fagocytose. Bestemt agonister og antagonister brukes for å undersøke effekten av P2X7 receptor aktivitet. Individuelt, kan disse metodene endres for å gi kvantitative data på en rekke kalsium kanaler og purinergic og åtseldyr reseptorer. Sammen markere de hvor bruken av sanntids live-celle flowcytometri er en rask, kostnadseffektiv, reproduserbare og kvantifiserbare metode for å undersøke P2X7 reseptor-funksjonen.
Introduction
Studiet av purinergic signalering er bred og mangesidig, som involverer mobilnettet fysiologi, biokjemi og farmakologi. Purinergic signalering er involvert i en uendelig rekke av mobilnettet og molekylære prosesser, fra kreft og celle syklus regulering til celle-celle communications og stamcelleforskningen biologi; som sådan, finnes det ofte et potensial til å modulere purinergic Signaliser for en terapeutisk fordel. Av purinergic reseptorer, har P2X7 reseptor fått betydelig oppmerksomhet de siste årene på grunn av dens potensial som et terapeutisk mål for mange inflammatoriske tilstander1. Metoder for å studere reseptoren har utviklet og tilrettelagt gjennom årene for å lette denne forskning2,3,4,5. Her beskriver vi en live-celle flyt cytometri metode for å undersøke flere funksjoner P2X7 reseptorer i voksen nevrale stamceller fra de subventricular sonen (SVZ) og den hippocampus dentate gyrus.
P2X7 reseptoren ble først beskrevet som P2Z reseptoren eller 'celledød' reseptoren, som dens aktivisering med høye konsentrasjoner av adenosin trifosfat (ATP) resultater i dannelsen av en stor transmembrane pore permeable til molekyler opptil 900 Da6. Dette fører til cellen cytoskjelett omorganisering, transmembrane pore dannelse, og mulig apoptose og/eller nekrose7. Tradisjonelt, er denne funksjonen av P2X7 kvantifisert av opptaket av store molekylvekt fargestoffer som YO-PRO-1 eller ethidium bromide, som fluoresce når under sommer med DNA3,8. Plate leser metoder, som er rask og tillate oppskalering, vanligvis tillater ikke for observasjon av kinetics. Metoden beskrevet her er basert på ethidium opptaket og lar fluorescens økningen følges over tid, gir en større dybde av informasjon med hensyn til hastigheten pore-formasjonen. P2X7 reseptorer har siden blitt vist å forenkle mange nonimmune funksjoner, med forskjellige svar avhengig av eksponering tid og Agonistiske konsentrasjon9,10. Kort aktivering ved lave konsentrasjoner ATP resulterer i kation tilstrømningen i forbindelse med nevrotransmitter og signal signaltransduksjon11. Bruker flowcytometri til å måle kalsium tilstrømningen overvinner problemene knyttet til tungvint og teknisk utfordrende-spesielt oppdatering clamping for å måle innover strømninger som gi uvurderlig informasjon om endringen i potensial over en celle membran, men tillater ikke for befolkningen analyse2. Den tredje funksjonen av P2X7 reseptorer oppstår i fravær av ATP, der P2X7 reseptorer har vist seg for å lette fagocytose både immunsystemet og nervesystemet9,12,13. Fremskritt i mikroskopi teknikker har tillatt visualisering av cellen cytoskjelett rearrangements under opptak prosessen, selv om kvantifisering og befolkningen kanne fremdeles gave en utfordring.
Live-celle flyt cytometri metoden finnesher gjør etterforskningen av alle tre hovedfunksjoner av P2X7 reseptorer i sanntid. Inkludering av en gang modul enhet på flyt cytometer tillater temperaturkontroll og kontinuerlig omrøring celler i suspensjon. Agonistiske og antagonist stimuli kan leveres innen andre, slik at nær uavbrutt måling av cellulær respons. Dette gir en rask og enkel metode for å kvantifisere reproduserbar funksjonen og unngå bruk av flere analysen systemer. Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan lett tilpasses en celle type og kan brukes til å undersøke andre reseptor subtyper gitt inkludering av bestemte agonister eller hemmere, avhengig av deres egenskaper.
Protocol
Dyrene ble behandlet i samsvar med australske anbefalingen og bruk av dyr for vitenskaplige formål og godkjent for bruk av Griffith University dyreetikk.
1. Neurosphere kultur av nevrale stamceller fra voksen SVZ og Hippocampus
Merk: Disseksjon protokollen presenteres her er basert på arbeid av Walker og Kempermann, og en detaljert protokoll for Disseksjon av nevrale stamceller fra voksen mus er tilgjengelig andre steder14. Oppdrettsforholdene er endret fra Babu og kolleger15. Voksne kvinnelige C57BL/6 mus alderen 8-12 uker ble brukt.
- I en biologisk sikkerhet regjering, forberede kultur medium (nevrale basale medium) med nevrale stamceller spredning supplement, 2 mM glutamin, 20 ng/mL til epidermal vekstfaktor (EGF), 10 ng/mL grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) og 2 µg/mL heparin.
- Euthanize to mus ved CO2 innånding. Alternativt, bedøve musene i henhold til institusjonelle retningslinjer og umiddelbart euthanize dem av cervical forvridning. Spray hodet med 70% etanol og halshugge dem. Overføre hvert hode til et sterilt rør som inneholder Hanks balansert salt løsning (HBSS) med 1 x penicillin/streptomycin løsning (P/S).
- Utføre disseksjoner laminær strømning hette under disseksjon mikroskop.
- Bruke tang og disseksjon saks, fjerne bløtvev og bein å avsløre hjernen og overføre den til en steril tallerken med HBSS med P/S.
- Plasser på hjernen ventral side opp og bruk en skalpell blad for å gjøre en komplett koronale snitt over optikk chiasm. Hold hjernen jevn med tang og bruke en swift, feilfri, nedadgående bevegelse. Unngå saging å minimere celledød og å opprettholde vevet struktur.
Merk: Hvis ikke sikkert, hjernen kan vippe frem under kuttet, at antall stamfar celler Hentet fra SVZ. - Isolere SVZ fra rostral halvparten av hjernen.
- Finn begge ventriklene, atskilt med septum, med corpus callosum danner en hvit bro over dem.
- Bruk tang til å fjerne septum skille to ventriklene og isolere lateral veggene i fremre lateral ventriklene. Dette gjør du ved å klippe bort over, under, til sidene og foran med fine disseksjon saks. Det blir bare en liten kopp-lignende figur.
- Forberede en ren Petriskål lokk med noen dråper HBSS i midten og overføre SVZ til væsken. Tillat ikke vevet tørke eller ta en tørr overflate. Stå på siden mens dissekere hippocampi.
- Isolere hippocampi fra caudal halvparten av hjernen.
- Gjøre en midtlinjen klippe halvkuler bryte corpus callosum. Bruk lateral ventriklene som en guide og forsiktig brette cortex å avsløre hippocampus. Når cortex er unrolled, kan hippocampus sees som en tett, hvit, buede struktur.
- Bruke fine disseksjon saks eller tang isolere hippocampus fra omkringliggende vev.
- Med pinsett, fjerne overflødig hvit substans, blodkar og noen membranous vev som dekker hippocampus.
- Forberede en ren Petriskål lokk med noen dråper HBSS og overføre hippocampus til væsken. Gjenta for den andre halvkulen.
- Når hippocampus og SVZ fra to mus er isolert og overført til deres respektive Petriskål lokk, mekanisk terninger vev ved hjelp av en skalpell blad. Hogge vevet i en Petriskål lokk for ca 1 min, roterer hver 10 s til vevet vises glatt og bare fine stykker forblir. Ta en ren skalpell blad og gjenta for andre fatet, dicing vev for 1 min.
- Bruker en 1 mL pipette, overføre alle vev fra Petriskål lokket skille rør som inneholder 1 mL av 0,25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA). Bruke en tube til SVZ og en tube for hippocampus.
- Gjøre dette ved første pipettering omtrent halvparten av trypsin-EDTA til vev i retten å minimere luftbobler og å hindre vevet kommer i kontakt med tørr pipette spissen som overføres til røret. Skyll fatet og skalpell bladet med resten av trypsin-EDTA samle vev så mye som mulig og legge den til røret.
- Inkuber vevet med trypsin i et vannbad 37 ° C i 30 min, agitating røret hvert 10 min å riktig dissociate vevet.
- Triturate vev ved hjelp av en brann-polert glass Pasteur pipette opprette en enkeltcelle suspensjon. Ta vare ikke for å overtriturate som dette vil føre til overdreven celle lysis. Dette er et kritisk punkt for optimal vev dissosiasjon.
- Observere innhold under føden prosessen og stoppe tidligste tegn at flertallet av vev klumper er fjernet. Trypsin løsningen bør bli litt skyet når cellene har gått inn i én celle suspensjon, selv om noen klumper kan forbli.
Merk: Som en indikasjon er passerer suspensjon opp og ned 10 x-15 x tilstrekkelig. - Legge til kultur medium opptil 5 mL til å nøytralisere trypsin og spinne på 300 x g 3 min. vaskes ytterligere 2 x HBSS og pass mediet gjennom en 70 µm celle sil for å fjerne alle typer vev grupperer.
- Overføre alle cellene i 15 mL av medium til en MT75 celle kultur kolbe.
Merk: Kuler bør danne i gangen null (P0) SVZ kultur etter 7-10 dager og etter 15-20 dager i hippocampus kultur. Avstå fra å vaske eller fôring cellene samtidig maksimere antall nevrale stamceller i kultur. Hvis flere progenitors kreves, eller du kan redusere P0 inkubasjon tiden, er det mulig å øke antall mus ofret. - Opprettholde kulturer på 37 ° C med 5% CO2 og, etter kultur startfasen P0, passasje hver 7 – 10 dager etter behov, ved hjelp en biologiske sikkerhetskabinett skap og standard vev kultur praksis.
Merk: P0 hippocampus kultur skal generere nok kuler til passering i en T25 kolbe; den SVZ kulturen vil generere mange flere kuler og kan bli passaged i en MT75. Hvis P0 hippocampus kulene har overholdt, bruke en 200 µL pipette til løft sfæren. - Passasje kulene når de når 150 til 200 µm i diameter. Samle kuler og medium i en 15 mL tube og la kulene å takke av tyngdekraften med ca 5 min. Alternativt, spin med lav hastighet (100 x g) i 2 minutter.
- Fjern mediet og dissociate cellene med dissosiasjon reagens for 7-10 minutter, avhengig av kulene.
Merk: Dissosiasjon reagensen brukes vil har signifikant effekt på utfallet av kultur, så kan du se Tabellen for materiale for detaljer. - Vask cellene ved å legge til 5 mL av HBSS celle løsningen og sentrifuge 300 x g for 3 min. fjerne nedbryting, resuspend cellene i kultur medium og frø på ca 150 000 celler i 5 mL av medium i en T25 celle kultur kolbe eller tilsvarende. Opprettholde kulturer på 37 ° C og 5% CO2.
- Bekreft nevrale celle status ved å identifisere uttrykk for stamcelleforskningen markører som Sox2 og ASCL1 før du fortsetter til alle nedstrøms protokollen9.
Merk: Dette kan gjøres ved forskerens foretrukne metoden (f.eks immunochemistry mikroskopi, flowcytometri eller western blot, eller ved hjelp av kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR)).
2. forberedelse av en enkeltcelle suspensjon for analyse av flowcytometri
-
Klargjør de nødvendige mediene. Dette omfatter følgende:
- Forberede Na+ medium med 145 mM NaCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukose, 0,1% bovin serum albumin (BSA) og 0,1 mM CaCl2. Dette mediet brukes også i en kalsium-fri form, med 0,1 mM CaCl2 utelatt.
- Forberede K+ medium med 145 mM KCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukose og 0,1% BSA.
Merk: Disse var mye optimalisert og er beskrevet i tidligere publikasjoner4,5. - Klargjør Lager ATP ved veiing nok ATP pulver for rundt 20 mL av en 100 mM aksje. Oppløse pulveret i 17 mL KCl buffer (145 mM KCl, 5 mM KOH og 10 mM HEPES, pH 7.5) og sakte, mens du rører, Legg 2 mL 18% (w/v) tetramethylammonium hydroksid (TMA) løsningen å bringe pH til 6,8-7.0.
- Juster det endelige volumet til 20 mL. Ikke overshoot pH forbi 7.0. Lagre aksjen på-80 ° C; Merk at ATP dele er stabil i minst 6 måneder.
Merk: Den gratis Molekylvekten vannfri ATP er 551.14 g/mol, og dette inkluderer ikke molekylvekt av vann og disodium molekyler, som kan variere fra parti til parti og bør tas i betraktning for beregningene. TMA er giftige, og må være forsiktig når du håndterer. Les sikkerhetsdata ark og forberede aksjer i røyk regjering. - Klargjør lager BzATP ved å løse opp BzATP i ultrapure H2O til en endelig lager konsentrasjon av 10 mM.
- Opprett en enkeltcelle suspensjon som beskrevet i trinn 1,16 og 1.17. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller automatisk celle teller. Resuspend celler i nødvendige medium (f.eks Na+ medium, kultur medium) for eksperimentet gjennomført (som beskrevet nedenfor) og plasserer cellene på is i mellomtiden.
- Kontroller det er nok prøve å inkludere kontroller for fremover og side scatter og kalibrering av spenning og kompensasjon for hver eksperimentet. Merk, som en indikasjon at kuler vokst i en MT75 bolle vanligvis gi rundt 8 x 106 celler per kolbe.
-
Angi flyten cytometer kontroll utvalg.
- Bruk frem og side scatter selektivt gate levende celler.
Merk: Fremover scatter gir informasjon om Cellestørrelse basert på lys Diffraksjon, mens siden scatter gir et mål på interne kompleksitet eller detaljnivå. Flyt hendelser med lite fremover og siden scatter kan anses som døde celler. - Justere spenningen og få av flyt cytometer i henhold til produsentens instruksjoner. Kjøre en gratisperioden prøven for å sikre erobringen av data med maksimal fluorescens intensiteten. Ingen kompensasjon er nødvendig for enkeltkanals oppkjøp.
- Bruk frem og side scatter selektivt gate levende celler.
3. måle kalsium tilstrømningen av Live-celle flyt cytometri
- Utarbeidelse av en enkeltcelle suspensjon, resuspend cellene i 1 mL av kalsium-fri Na+ medium og laste dem med 2 ng/mL kalsium indikator fargestoff i henhold til produsentens protokollen (se Tabell for materiale) med 10 µL 5% pluronic syre. Inkuber celler for 30 min på 37 ° C.
- Vask cellene ved å legge 3 – 5 mL av kalsium-fri Na+ medium og sentrifugering forsiktig (200 x g for 4 min). Fjern nedbryting og resuspend cellene i kalsium-fri Na+ medium, vask en gang.
- Resuspend cellene i 1 mL av kalsium-fri Na+ medium, plasseres på is, og tillate dem å de forestre i 30 min.
- Vask 1 x mer ved å legge 3 – 5 mL K+ medium og sentrifugering (200 x g for 4 min); deretter resuspend cellene i K+ medium og aliquot dem til fluorescens assistert celle sortering (FACS) rør i en konsentrasjon av 1 x 106 celler per 500 µL per FACS rør.
Merk: Antall FACS rør per prøve avhenger av antallet behandlinger og gjentar inkludert. - Plasser FACS rørene på is til cellene er klar til å bli analysert. Ikke la cellene på is lengre men begynner analysen så snart som mulig.
- For eksempler, preincubate cellene med P2X7 reseptor-spesifikke hemmer AZ10606120 (1 µM i 10-15 minutter) eller A438079 (10 µM i 30 min) på 37 ° C før analysen.
- Noen minutter før du kjører det første eksemplet, legge CaCl2 (til en siste konsentrasjon av 1 mM i FACS tube) og sett røret i et 37 ° C vannbad gjenopprette.
- Slipp en ren, liten magnetisk rørestang i FACS rør og posisjon røret i modulen tid knyttet til en sirkulerende 37 ° C vannbad kontroll prøven temperaturen. Velg en lav omrøring hastigheten slik bevegelse av prøven uten innføre en vortex effekt. Plasser vann jakke tube kortet på prøven plattformen og Lukk spaken armen av FACS maskinen.
- Starte prøven oppkjøp og kjøre utvalget for 3 min på rundt 1000 arrangementer per sekund.
- På 40 s merket, raskt fjerne røret og legge til P2X7-Agonistiske 1 mM ATP eller 300 µM BzATP, og erstatte røret for å fortsette kjøpet.
- Mens det første eksemplet er inn, forberede det andre eksemplet med CaCl2 og plasserer den i 37 ° C gir tilstrekkelig tid for cellene å varme opp før analyse. Når det første eksemplet er ferdig, rengjøre inntaket ved å kjøre en vann utvalget, og deretter oppkjøpet av det andre eksemplet kan begynne som beskrevet i trinn 3.8 og 3.9. Rengjør alltid inntaket mellom eksempler.
4. måle Pore dannelsen av Live-celle flowcytometri
- Opprett en enkeltcelle suspensjon som beskrevet i trinn 1,16 og 1.17. Lagre noen ml av gamle medium, bruke den til å resuspend cellene i en konsentrasjon av 1 x 106 celler per 100 µL per FACS rør, og plasser det på is til klar.
- Før du kjører analysen, Legg 900 µL av K+ medium for et siste volum 1 ml og plassere rør i et vannbad 37 ° C i 10 min å gjenopprette.
- Eventuelt preincubate cellene med behandlinger, inkludert P2X7-spesifikke hemmere AZ10606120 (1 µM i 10-15 minutter) eller A438079 (10 µM i 30 min).
- Umiddelbart før du kjører analysen, legge til 25 µM ethidium bromide FACS røret; deretter legge til magnetisk rørestang, plassere den på FACS maskinen etter trinn 3.7, og begynne å kjøpet.
Merk: Ethidium bromide er giftige, og må være forsiktig når du håndterer den. Kast brukte FACS rør riktig. - For å indusere dannelsen av porene i cellemembranen, Legg 1 mM ATP eller 100 µM BzATP 40 s etter starten av oppkjøpet.
- Kjøre prøver på rundt 1000 arrangementer per sekund for 6 min.
- Mens det første eksemplet kjører, ta det andre eksemplet fra isen og plassere den i vannbad 37 ° C gir tilstrekkelig tid for cellene å gjenopprette før analysen. Når det første eksemplet er ferdig med oppkjøpet, ren inntaket ved å kjøre en vannprøve; det andre eksemplet kan deretter plasseres på maskinen begynne innspillingen som beskrevet i trinn 3.8 og 3.9.
5. måle fagocytose av Live-celle flowcytometri
- Opprett en enkeltcelle suspensjon som beskrevet i trinn 1,16 og 1.17. Resuspend cellene i betinget medium og aliquot dem til FACS rør i en konsentrasjon av minst 1 x 106 celler per 100 µL per FACS rør. Fortynne cellene til en siste konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL med Na+ medium (f.eks legge til 900 µL av Na+ medium) og plasserer cellene på is før analysen utføres.
- Bruk 1 µm av YG latex perler (mikrosfærer) som phagocytic mål for sanntids fagocytose analyser.
Merk: Andre farger kan også erstattes, men forskjellig størrelse perler ble funnet for å være utilstrekkelig mål fagocytose4. - Før du kjører det første eksemplet, overføre cellene til en 37 ° C vannbad og ruge dem for ca 7-10 minutter til at cellene å gjenopprette.
-
Legg noen behandlinger som krever preincubation til sine respektive rør, inkludert 1 mM ATP i 15 min, 300 µM oksidert ATP (oxATP) i 40 minutter, 20 µM cytochalasin D for 20 min og 4% paraformaldehyde (PFA) for 20 min.
- Ingen preincubation er nødvendig for 5% humant serum. Hvis behandlinger legges på samme tid, kan prøver kjøres i omvendt rekkefølge mens andre fortsetter å ruge. For eksempel Kjør kontrollene og serum først, deretter ATP-behandlet prøven, etterfulgt av cytochalasin D og PFA og oxATP siste.
- Plasser prøven på cytometer med magnetisk rørestang som beskrevet i trinn 3.8 og 3.9, og deretter starte prøven oppkjøp.
- Fjerne prøven røret fra maskinen 15-20 s etter starten av oppkjøpet, og legge 5 µL av ufortynnet YG perler. Hjem eksempel FACS røret fortsette oppkjøpet. Kjøre prøvene for 7 – 8 minutter på rundt 1000 hendelser/s.
- Mens det første eksemplet kjører, ta det andre eksemplet fra isen og plassere den i et 37 ° C vannbad å gi nok tid for cellene å gjenopprette før analyse. Når det første eksemplet er ferdig, rengjør inntaket ved å kjøre en vann utvalget, og deretter begynne oppkjøp på det andre eksemplet som beskrevet i trinn 3.8 og 3.9.
6. dataanalyse
- Eksportere data til et regneark. Dataanalyse avhenger av eksperimentelle spørsmålet.
Merk: Vær oppmerksom på at ulike kjører kan ha ulike planlagte intensitet, så det er viktig å kjøre analysen for en angitt periode ved starten (rundt 40 s) før du legger noen agonister og normaliserer dataene ved å beregne endringen i fluorescens (fluorescensen på et gitt tidspunkt [F] delt av fluorescens på tidspunkt null [F0] eller F/F0). - For å kvantifisere satsen eller kinetics av funksjonen P2X7 i spørsmålet, beregne området under kurven eller summen av trapezoids opprettet under kurven for hver 10 s tid periode16.
- Å bestemme effekten av behandlinger, de siste 10-20 s opptak i gjennomsnitt fluorescens intensiteten og sammenligne behandlinger. Fastslå betydningen av t-test eller analyse av varians.
Representative Results
Nevrale cellekulturer
Nevrale sfære kulturer avledet benytter denne metoden bør være fase lyse og har en jevn rund kant (figur 1AB). I sunn kulturer, kan små microspikes observeres på kantene (figur 1 c). På slutten passasjer, eller hvis matet mangelfullt, kuler kan danne en hul kopp form (figur 1 d) eller store avlang figurene (figur 1E, angitt med pil). Disse kulturene bør ikke brukes for flowcytometri eller andre programmer som nedstrøms, som disse funksjonene kan det være indikativ av differensiering. For å bekrefte statusen nevrale, cellene var belagt på glass coverslips belagt med poly-L-ornithine og laminin for immunocytochemistry (figur 1F og høyere confluency, figur 1G). Cellene ble farget for GFAP, nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 og DCX å identifisere celler som Type 2 progenitor celler (hippocampus) eller Type C stamfar celler (SVZ)9. Celler bør ha en veldefinert kjerne og utvidet prosesser.
Figur 1: representant hippocampus nevrale cellekultur. (A) hippocampus nevrale stamceller isolert fra voksen mus og kultivert som neurospheres til ca 100-150 µm i diameter. (B) Neurospheres bør ha en jevn periferi, (C) og små microspikes kan være observert på overflaten deres. Når kuler er for lang i kultur, kan de danne (D) kopp eller (E) avlang figurer. Disse kulturene bør ikke brukes for eksperimenter. For å bekrefte statusen nevrale cellene, frø dem som en enkeltcelle suspensjon på poly-L-ornithine (PLO) og laminin-belagt glass coverslips for immunochemistry. Celler bør ha en liten soma og forgrening prosesser, (F) på lave confluency og (G) klar for immunochemistry. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Kalsium tilstrømningen av live-celle flowcytometri
Denne protokollen gir analyse av P2X7 reseptor-funksjonen som en kalsium kanal i sanntid. The kinetics av reseptor-funksjonen og effekten av ulike agonister og antagonister, kan også vurderes. Når tegnes tid, kalsium tilstrømning av hippocampus og SVZ nevrale stamceller var generelt (figur 2A og 2B figur, henholdsvis). Agonister (ATP eller BzATP) ble lagt på 40 s merke, som angitt av den røde pilen. Et kort øyeblikk, er røret fjernet fra opptak punktet til Agonistiske, resulterer i datapunktene i null. Dette vil tillate identifikasjon av tiden når Agonistiske ble lagt. BzATP aktiverer raskt P2X7 reseptorer, åpne ion kanalen og slik at kalsium pågangen, som binder seg til Fluo-8 og fluoresces. ATP programmet vanligvis resulterer i en mer gradvis kalsium tilstrømning. Den har en lavere affinitet til P2X7 sammenlignet med BzATP vil også resultere i G-protein-kombinert reseptor aktivisering, en tregere signalveien som frigjør kalsium fra det endoplasmatiske retikulum. Inkludering av P2X7 antagonister A438079 og AZ10606120 (data ikke vist) redusert kalsium tilstrømningen svar Agonistiske program.
Figur 2: Live-celle kalsium tilstrømning av nevrale stamceller fra hippocampus og SVZ. P2X7 reseptor kalsium kanal funksjon ble demonstrert i (A) hippocampus og (B) SVZ-avledet progenitor celler av endringer i Fluo-8 fluorescens. Anvendelse av den generelle P2X Agonistiske ATP og P2X7 Agonistiske BzATP resultatet i P2X7 ionekanaler åpning, slik at kalsium tilstrømningen. Tilstrømningen ble blokkert med P2X7-spesifikke hemmere A438079 eller AZ10606120 (data ikke vist). F = fluorescens; F0 = fluorescens ved tidspunkt null. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Pore dannelsen av live-celle flowcytometri
Transmembrane pore formasjon er kanoniske kjennetegner P2X7 reseptorer, resulterer i Makromolekyl utveksling, og kan føre til celledød. Ethidium+ er et stort molekyl (314 Da) ekskludert fra friske celler. den opptak og etterfølgende innskudd med DNA resulterer i fluorescerende utslipp og kan brukes til å vurdere muligheten for P2X7 reseptorer å danne transmembrane porene. Følgende program agonister ATP (1 mM ATP) og BzATP (100 μM) på 40 s (angitt med pilen), tid-løst flowcytometri fanger ethidium bromide inn cellene i sanntid (figur 3A). Denne effekten ble svekket av den P2X7-spesifikke inhibitor AZ10606120. Ethidium bromide opptaksanalyse viser en funksjonell P2X7 reseptor C-terminus17 og er god dokumentasjon for full lengde P2X7 reseptor uttrykk. ATP konsentrasjon svar analyser illustrere effekten av Agonistiske konsentrasjon på P2X7 pore formasjon, bruker endre i ethidium bromide fluorescens over tid (figur 3B). Agonistiske dose konsentrasjon kurver med reseptor-spesifikke hemmere gir sterke bevis for reseptor aktivisering.
Figur 3: P2X7 transmembrane pore formasjon målt ved ethidium opptak. Tillegg av ethidium bromide øyeblikk før oppkjøpet brukes til å måle dannelsen av P2X7 transmembrane porene. Høye konsentrasjoner av ATP og BzATP resultere i (A) P2X7 reseptor pore formasjon, slik ethidium bromide inn i cellen. P2X7 hemmer AZ10606120 demper dette fenomenet og gir bevis for funksjonell P2X7 reseptorer. (B) ATP konsentrasjon svar analyser har vist betydelig pore formasjon på 500 μM og 1 mM, men ikke i lave konsentrasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fagocytose av live-celle flowcytometri
Vår gruppe har tidligere vist at ekstracellulære ATP hemmer P2X7-mediert fagocytose ved dissociating P2X7 C-terminus fra cytoskjelett, spesielt nonmuscle myosin IIA18,19. Denne metoden utvider på disse funnene å demonstrere P2X7 reseptor engasjement i fagocytose av hippocampus og SVZ nevrale celler i sanntid (Figur 4, et eksempel på hippocampus fagocytose). Uhemmet fagocytose (kontroll) nivåer av 1 µm YG latex perler ble etablert som positive kontroll. ATP hemmet fagocytose av YG perler i samme grad som spesifikke hemmere, nemlig PFA fiksering og utgangen polymerisasjon hemmer cytochalasin D, mens 5% serum avskaffet alle medfødt fagocytose20.
Figur 4: YG perle opptak demonstrere phagocytic kapasitet nevrale progenitors via P2X7 reseptorer. YG perle opptak av nevrale stamceller er bruker live-celle flow cytometri i sanntid. Kontroll nivåer av fagocytose er etablert først, og hvis antall celler tillater, bekreftet i slutten av kjøringen. Involvering av P2X7 reseptorer angis av hemming av fagocytose i nærvær av ATP, som dette dissociates C-terminus fra membranen cytoskjelett, hindrer P2X7-mediert cellen cytoskjelett rearrangements. Anvendelsen av ATP blokkert fagocytose i samme grad som bruk av spesifikke hemmere av fagocytose, inkludert paraformaldehyde (PFA) og cytochalasin D (CytD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for analyse av P2X7 reseptor funksjon i nevrale cellekulturer fra voksen neurogenic nisjene. De potensielle programmene for voksen nevrale celler varierer fra forskning til terapeutiske formål, og så metoden kultur må være robust og reproduserbar. Det finnes en rekke viktige aspekter til denne protokollen som kan påvirke kvaliteten på sluttpunktet kulturen. Når fjernet fra skallen, hjernen bør ikke få lov til å tørke og dissection skal utføres så raskt som mulig. Spesielt med hippocampus medfører ekstra forsiktighet tatt å fjerne blod fartøy eller membranous vev overlegen stamfar celle avkastning. Dissosiasjon og føden prosessen kan påvirke antall kuler innhentet i en kultur; agitating vev under incubation med trypsin-EDTA vil resultere i en mer homogen løsning. Bruk av en brann-polert glass beiter pipette over en P1000 plastikk pipe tips anbefales å redusere celledød og forbedre den resulterende kulturen. Unngå overtriturating. Til tross for disse forholdsreglene, prosedyren kan opprette en masse rusk i P0 kultur, og for å unngå å miste progenitor celler, vask eller fôring kulturen bør unngås til kuler har dannet.
En rekke forskjeller mellom den hippocampus og SVZ kulturer vil bli veldig tydelig på P0. Hippocampus kulturer gir færre kuler, og dette vanligvis følge. Bruke en pipette tips til løft av kulene for første passering. Tilhenger kuler var ikke observert i etterfølgende avsnitt. Forskjellige merker av vev kultur kolber kan forårsake Sfærene, spesielt hippocampus sfærer, følge og vokse som kolonier på bunnen av parabolen. Dette finner ikke for å endre noen nedstrøms resultater for denne protokollen, men bør overvåkes og konsistens bør opprettholdes der det er mulig.
Metodene som brukes til å måle P2X7 reseptor-funksjon, som oppdateringen clamping for å registrere kalsium pågangen, er tidkrevende og arbeidskrevende og kan bare gi informasjon om en enkelt celle. Denne protokollen gir en rask og reproduserbar metode for å analysere alle tre hovedfunksjoner av P2X7 reseptorer ved hjelp av en maskin. Tid-løst live-celle-flowcytometri gir hele befolkningen analyse og gir forskeren informasjon om kinetics av kalsium tilstrømningen, pore formasjon eller phagocytic funksjon. I tillegg kan flowcytometri lett brukes for å vurdere markør uttrykk mønstre og befolkningen analyse basert på celle størrelsen eller protein uttrykk.
Når du utfører disse eksperimentene, observeres forskjeller i maksimal kalsium tilstrømningen, ethidium opptak eller fagocytose priser mellom gjentakelser. For å minimere dette kule størrelsen, må oppdrettsforholdene og fôring regimet være konsekvent som helse cellene vil ha en betydelig innvirkning på resultatene. Tiden på isen kan også påvirke dataene, så sikre alt er forberedt på forhånd slik at tiden på isen er minimal. Kontroller at kalsium indikator fargestoff lastetiden er konsekvent. En annen faktor som kan føre til store inkonsekvenser i maksimal kalsium opptakene er variasjon mellom ATP bunker. Utarbeidelse av ATP aksjer er avgjørende, og bruk av forskjellige bunker for samme eksperimenter bør unngås. Sammenligne gamle og nye grupper for å sikre ATP er konsekvent anbefales også. Effektiviteten av P2X7 antagonister kan også være cellen linje - og batch-avhengige, slik optimalisering av inkubasjon ganger og konsentrasjoner kan være nødvendig.
Det er verdt å merke seg at kalsium tilstrømningen/middelklasseinnbyggere er en av de mest grunnleggende og komplekse cellulære funksjonene og kan være formidlet av mange reseptorer. ATP-indusert kalsium tilstrømningen, som et klassisk mål for P2X7 kanal/pore-funksjonen, ikke kanskje nøyaktig gjenspeiler den sanne funksjonen P2X7 reseptorer, som ATP kan også aktivere P2Y reseptorer å løslate intracellulær kalsium. I dette tilfellet kan barium være en bedre kasjon skal brukes i stedet for kalsium som sin tilstrømningen enveis16. For å skille bidraget fra P2Y reseptorer i kalsium tilstrømningen, kan betingelser der 1 mM EDTA eller ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic syre (EGTA) legges til K+ mediet i stedet for CaCl2 brukes i dette analysen.
Denne protokollen kan også lett tilpasses andre celletyper, og kan være nyttig for å undersøke funksjonaliteten til alternative ion kanal reseptorer eller reseptorer som deltar i fagocytose. Denne metoden kan også tilpasses en flyt cytometri maskin uten en gang modul. Som et eksempel, kan fagocytose analyser utføres der YG perler legges 7 – 8 minutter før analysen av konvensjonelle flowcytometri. Holde cellene på 37 ° C og kontinuerlig virvel dem. Dette gir sanntidsinformasjon men forskjeller i de mener siste fluorescensen fortsatt informere forskeren om funksjonaliteten til P2X7 reseptorer.
Interesse P2X7 reseptorer som et legemiddel mot21,22 eller som en narkotika-leveranser rute23,24 vokser raskt, og så å studere denne gåtefulle reseptoren må være kontinuerlig tilpasset og forbedres til forenkle disse studiene. Denne protokollen skisserer metoder som kan brukes til å utforske P2X7-funksjonen i voksen nevrale stamceller, og håpet er at oppnå en større forståelse av P2X7 reseptorer i neurogenic nisjene kan føre til fremskritt i behandling av hjerneslag og andre iskemiske skader.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Maria Kasherman og Xin Huang for deres bidrag til denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra forskningsstiftelse for Rebecca L. Cooper M.W., T.C.L. og M.L. og T.C.L. fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (571100 og 1048082) og Baxter Charitable Foundation ( Sydney, Australia). BG ble støttet av australske Research Council (ARC) fremtid fellesskap (FT120100581) NHMRC prosjekt stipend (1048082, 1061419 og 1120095) og den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtte Grant til Florey Institute. M.L. ble støttet av en Charles D. Kelman, MD postdoktor Award (2010) fra International Retinal Research Foundation (USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
References
- Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
- Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
- Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
- Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
- Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
- Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
- Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
- Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
- Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
- Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
- Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
- Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
- Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
- Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
- Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
- Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
- Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
- Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
- Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).
