Summary
Proporcionar sensibilidad unicelular, citometría de flujo en tiempo real está especialmente preparado para cuantificar las funciones de receptor multimodal de cultivos vivos. Con células progenitoras neurales adultas, la función del receptor P2X7 se evaluó mediante la afluencia de calcio detectado por colorante indicador de calcio, formación de poros transmembrana por absorción de bromuro de etidio y fagocitosis usando gotas de látex fluorescentes.
Abstract
Citometría de flujo de células vivas se utiliza cada vez más biólogos de célula para cuantificar procesos biológicos en la vida de una cultura de la célula. Este protocolo describe un método por el citómetro de flujo de células vivas se extiende a analizar las múltiples funciones de la activación del receptor P2X7 en tiempo real. Mediante un módulo de tiempo instalado en un citómetro de flujo, funcionalidad de células vivas puede ser evaluado y trazado sobre un determinado período de tiempo para explorar la cinética de la afluencia del calcio, formación de poros transmembrana y fagocitosis. Este sencillo método es ventajoso como tres funciones canónicas del receptor P2X7 pueden evaluarse utilizando una máquina y los datos obtenidos graficados en el tiempo proporcionan información sobre la población de células vivas en lugar de grabaciones de unicelulares a menudo obtenidos mediante métodos técnicamente desafiantes de patch-clamp. Experimentos de influjo de calcio uso un colorante indicador de calcio, mientras que ensayos de formación de poro P2X7 dependen de bromuro de etidio se le permitiera pasar a través de la transmembrana del poro formados en concentraciones altas del agonista. Gotas de látex de color amarillo-verde (YG) se utilizan para medir fagocitosis. Antagonistas y agonistas específicos se aplican para investigar los efectos de la actividad de receptor P2X7. Individualmente, estos métodos pueden ser modificados para proporcionar datos cuantitativos sobre cualquier número de canales de calcio y los receptores purinérgicos y carroñero. Tomados en conjunto, ponen de manifiesto cómo el uso de citometría de flujo en tiempo real de células vivas es un método rápido, económico, reproducible y cuantificable para investigar la función del receptor P2X7.
Introduction
El estudio de la señalización purinérgica es amplia y multifacética, que implican la farmacología, la bioquímica y la fisiología celular. Señalización purinérgica está implicado en un número infinito de procesos celulares y moleculares del cáncer y la regulación del ciclo celular para comunicaciones de la célula y biología de la célula de vástago; como tal, hay a menudo existe un potencial para modular purinérgicos para un beneficio terapéutico. De los receptores purinérgicos, receptor P2X7 ha recibido considerable atención en los últimos años debido a su potencial como una diana terapéutica para numerosas afecciones inflamatorias1. Métodos para estudiar el receptor han evolucionado y se han adaptado durante los años para facilitar esta investigación2,3,4,5. Aquí, describimos un método de citometría de flujo de células vivas para investigar las múltiples funciones de los receptores P2X7 en células progenitoras neurales adultas derivadas de la zona subventricular (SVZ) y la convolución del cerebro dentada hippocampal.
El receptor P2X7 primero fue descrito como el receptor P2Z, o los receptores de «muerte celular», como su activación con altas concentraciones de adenosina trifosfato (ATP) resultados en la formación de un gran poro transmembrana permeable a las moléculas hasta 900 Da6. Esto conduce al reordenamiento del citoesqueleto, formación de poros transmembrana y, potencialmente, apoptosis o necrosis7. Tradicionalmente, esta función de P2X7 está cuantificada por la absorción de tintes de gran peso molecular tales como YO-PRO-1 o etidio bromuro, que es fluorescente cuando se intercalan con el ADN3,8. Placa lector métodos son rápidos y permitan la ampliación de la escala, generalmente no permiten la observación de la cinética. El método aquí descrito se basa en la aceptación de etidio y permite el aumento de fluorescencia observar con el tiempo, proporcionando una mayor profundidad de la información con respecto a la velocidad de formación de poros. Desde entonces han demostrado los receptores P2X7 facilitar un número de funciones no inmunitaria, con respuestas distintas dependiendo de la exposición tiempo y agonista concentración9,10. Breve activación por concentraciones más bajas de ATP resulta en afluencia de cationes para los efectos del neurotransmisor y la señal de transducción de señales11. Mediante citometría de flujo para medir la afluencia de calcio supera los problemas asociados con los métodos engorrosos y técnicamente desafiantes, particularmente, parche de sujeción para medir las corrientes hacia adentro, que proporcionan información inestimable sobre el cambio de potencial a través de una membrana de la célula pero no permiten análisis de población2. La tercera función de los receptores P2X7 ocurre en ausencia de ATP, donde los receptores P2X7 se han demostrado para facilitar la fagocitosis en el sistema inmune y el sistema nervioso9,12,13. Los avances en técnicas de microscopía han permitido la visualización de los cambios citoesqueléticos durante el proceso de absorción, aunque análisis de cuantificación y de la población aún puede presentar un desafío.
El método de citometría de flujo de células vivas detallado aquí permite la investigación de las tres funciones principales de los receptores P2X7 en tiempo real. La inclusión de un dispositivo de módulo de tiempo en el citómetro de flujo permite el control de temperatura y agitación continua de células en suspensión. Agonista y antagonista de los estímulos pueden ser entregados dentro de un segundo, lo que permite la medición sin interrupciones cerca de la respuesta celular. Esto presenta un método rápido y simple para cuantificar reproducible función evitando el uso de múltiples sistemas de ensayo. Es importante señalar que este protocolo puede adaptarse fácilmente a cualquier tipo de célula y podría ser utilizado para examinar otros subtipos de receptores dadas la inserción de los agonistas específicos o inhibidores, dependiendo de sus propiedades.
Protocol
Los animales fueron tratados de acuerdo con el código australiano de prácticas para el cuidado y uso de animales para fines científicos y aprobados para su uso por el Comité de ética de Animal de la Universidad de Griffith.
1. desarrolló la cultura de células progenitoras neurales de la SVZ adultos e hipocampo
Nota: El protocolo de disección presentado aquí se basa en el trabajo de Walker y Kempermann y un protocolo detallado para la disección de las células progenitoras neurales de ratones adultos está disponible en otra parte14. Condiciones de cultivo se han modificado de Babu y colegas15. Se utilizaron ratones C57BL/6 hembra adultos de 8-12 semanas de edad.
- En un gabinete de seguridad biológica, preparar el medio de cultivo (medio basal neuronal) con suplemento de proliferación de células madre neuronales, 2 mM glutamina, ng/mL 20 factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) de 10 ng/mL y 2 μg/mL heparina.
- Eutanasia a dos ratones por la inhalación de CO2 . También puede anestesiar los ratones según las directrices e inmediatamente los eutanasia por dislocación cervical. Rociar la cabeza con etanol al 70% y decapita a los. Transferir cada cabeza a un tubo estéril que contiene una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con solución de penicilina/estreptomicina x 1 (P/S).
- Realizar disecciones en campana de flujo laminar en un microscopio de disección.
- Con tijeras de disección y pinzas, remover tejido y hueso para exponer el cerebro y transferir a un recipiente estéril que contiene HBSS con P/S.
- Coloque el lado ventral del cerebro arriba y use una hoja de bisturí hacer una incisión coronal completa a través del quiasma óptico. Mantenga el cerebro constante con las pinzas y utilizar uno swift, limpio, movimiento hacia abajo. Evitar el corte para minimizar la muerte de la célula y para ayudar a mantener la estructura del tejido.
Nota: Si no se hace bien, el cerebro puede inclinar hacia adelante durante el corte, comprometer el número de células progenitoras obtenidas de la SVZ. - Aislar la SVZ de la mitad rostral del cerebro.
- Ubicar ambos ventrículos, separados por el tabique, con el cuerpo calloso formando un puente blanco por encima de ellos.
- Utilizar pinzas para quitar el tabique que separa los dos ventrículos y aislar las paredes laterales de los ventrículos laterales anteriores. Para ello, cortando por encima de, abajo, a los lados y en la parte delantera con unas tijeras finas de disección. Seguirá siendo sólo una pequeño taza-como forma.
- Preparar una tapa de caja de Petri limpia con unas gotas de HBSS en el medio y la transferencia de la SVZ al líquido. No permita que el tejido se seque o tocar una superficie seca. Soporte para el lado mientras los hipocampos de disección.
- Aislar los hipocampos de la mitad caudal del cerebro.
- Haga una línea media entre los hemisferios para cortar el cuerpo calloso. Guíese por los ventrículos laterales y despliegue suavemente la corteza para dejar al descubierto el hipocampo. Una vez desenrollada la corteza, el hipocampo puede verse como una estructura densa, blanca, curvada.
- Use tijeras de disección fina o fórceps para aislar el hipocampo de los tejidos vecinos.
- Con unas pinzas, quitar exceso de la materia blanca, vasos sanguíneos y cualquier tejido membranoso que cubre el hipocampo.
- Preparar una tapa de caja de Petri limpia preparada con unas gotas de HBSS y transferir el hipocampo al líquido. Repita para el otro hemisferio.
- Una vez que el hipocampo y la SVZ de dos ratones han sido aislados y transferido a sus tapas respectivas de Petri, dados mecánicamente el tejido utilizando una hoja de bisturí. Cortar el tejido en una tapa de caja de Petri durante aproximadamente 1 minuto, siguen rotando cada 10 s hasta que el tejido aparece liso y sólo piezas finas. Tomar una hoja de bisturí limpio y repita para el otro plato, cortar en cubitos el tejido durante 1 minuto.
- Con una pipeta de 1 mL, transferir todo el tejido de cada tapa de la caja de Petri para separar los tubos que contienen 1 mL de ácido de 0.25% tripsina-etilendiaminotetracético (EDTA). Utilice un tubo de la SVZ y un tubo para el hipocampo.
- Para ello transfiriendo primero sobre la mitad del tripsina-EDTA a los tejidos en el plato para minimizar las burbujas de aire y para evitar que el tejido entren en contacto con la punta seca, se transfiere al tubo. Enjuagar el plato y la hoja de bisturí con el resto del tripsina-EDTA a recoger tanto tejido como sea posible y añadir al tubo.
- Incubar el tejido con la tripsina en un baño de agua de 37 ° C por 30 min, agitar el tubo cada 10 min a disociar correctamente los tejidos.
- Triturate el tejido usando un fuego pulido de vidrio pipeta Pasteur para crear una suspensión unicelular. Tenga cuidado de no overtriturate como esto puede causar lisis celular excesiva. Este es un paso crítico para la disociación del tejido óptimo.
- Observar el contenido del tubo durante el proceso de trituración y parar en las muestras más tempranas que se han quitado la mayoría de los grupos de tejido. La solución de tripsina debe quedar ligeramente turbia cuando las células se encuentran en suspensión unicelular, aunque pueden quedar algunos grumos.
Nota: Como indicación, pasando la suspensión hacia arriba y abajo 10 x x-15 es adecuada. - Agregar medio de cultivo hasta 5 mL para neutralizar la tripsina y vuelta a 300 x g durante 3 minutos lavado más 2 x con HBSS y pase el medio a través de un colador de celular de 70 μm para remover cualquier tejido produce.
- Transferencia de todas las células en 15 mL de medio a un matraz de cultivo celular T75.
Nota: Esferas deben formar en el paso cero (P0) cultura SVZ después de 7-10 días y después de 15-20 días en la cultura hippocampal. Abstenerse de lavar o las células de alimentación durante este tiempo para maximizar el número de células progenitoras neurales en la cultura. Si los progenitores más se necesitan, o para disminuir el tiempo de incubación de P0, es posible aumentar el número de ratones sacrificados. - Mantener los cultivos a 37 ° C con 5% CO2 y, después de la fase inicial de la cultura de P0, paso cada 7-10 días según sea necesario, con una prácticas de cultivo de tejidos estándar y gabinete de seguridad biológica.
Nota: La cultura hippocampal P0 debe generar suficientes esferas al paso en un matraz de T25; la cultura de la SVZ generará muchas esferas más y puede ser pasada en una T75. Si se han adherido las esferas hippocampal P0, utilice una pipeta de 200 μL para levantar ligeramente la esfera. - Paso las esferas cuando llegan a 150-200 μm de diámetro. Recoger las esferas y medio en un tubo de 15 mL y permitir que las esferas a asentarse por gravedad durante aproximadamente 5 minutos o bien, girar a baja velocidad (100 x g) durante 2 minutos.
- Quite el medio y disociar las células con el reactivo de disociación de 7 – 10 minutos, dependiendo del tamaño de las esferas.
Nota: El reactivo de disociación utilizado tendrá efectos significativos sobre el resultado de la cultura, así que por favor, consulte la Tabla de materiales específicos. - Lavar las células añadiendo 5 mL de HBSS a la solución de la célula y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante, resuspender las células en medio de cultivo y semilla en aproximadamente 150.000 células en 5 mL de medio en un frasco de cultivo celular T25 o equivalente. Mantener los cultivos a 37 ° C y 5% CO2.
- Identificar la expresión de marcadores de células madre como Sox2 y ASCL1 antes de proceder a cualquier protocolo descendente9para confirmar estado de células progenitoras neurales.
Nota: Esto puede hacerse por el método del investigador (p. ej., biopsia por microscopía, citometría de flujo o western blot, o mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)).
2. preparación de una suspensión unicelular para análisis por citometría de flujo
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Preparar los medios necesarios. Estos incluyen los siguientes.
- Preparar el medio Na+ con 145 mM NaCl KOH de 5 mM, 10 mM HEPES, 5 mM D-glucosa, 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,1 mM CaCl2. Este medio también se utiliza en una forma libre de calcio, con 0,1 mM de CaCl2 omitido.
- Preparar el medio K+ con 145 mM KCl, KOH de 5 mM, 10 mM HEPES, 5 mM D-glucosa y 0.1% de BSA.
Nota: Estos medios fueron ampliamente optimizados y se detallan en anteriores publicaciones4,5. - Preparar Caldo ATP pesando bastante polvo de ATP para unos 20 mL de un stock de 100 mM. Disolver el polvo en 17 mL de solución de KCl (145 mM KCl, 5 mM KOH y 10 mM HEPES, pH 7,5) y poco a poco, removiendo, añadir 2 mL de hidróxido de Tetrametilamonio de 18% (w/v) (TMA) a la solución para llevar el pH a 6.8-7.0.
- Ajustar el volumen final de 20 mL. No pasa el pH más allá de 7.0. Tienda el stock a-80 ° C; Tenga en cuenta que las alícuotas de ATP son estables durante al menos 6 meses.
Nota: El peso molecular libre de ATP anhidro es 551.14 g/mol, y esto no incluye el peso molecular de las moléculas de agua y disódico, que puede variar de lote a lote y debe tenerse en cuenta para los cálculos. TMA es tóxico y debe tenerse cuidado al manejar. Lea los datos de seguridad de la hoja y preparan las acciones en un armario del humo. - Preparar caldo BzATP disolviendo el BzATP en ultrapura de H2O para una concentración final de stock de 10 mM.
- Crear una suspensión unicelular como se describe en los pasos 1.16 y 1.17. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador celular automático. Resuspender las células en el medio requiere (por ejemplo, media Na+ , medio de cultivo) para el experimento se llevó a cabo (como se describe a continuación) y coloque las células en hielo mientras tanto.
- Para cada experimento, asegúrese que hay suficiente muestra para incluir controles de dispersión hacia delante y lateral, así como para la calibración de los ajustes de tensión y compensación. Tenga en cuenta, como una indicación, que esferas cultivadas en un matraz T75 típicamente producen alrededor de 8 x 106 células cada frasco.
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Configurar el flujo citometría utilizando muestras de control.
- Utilice dispersión hacia delante y lateral para bloquear selectivamente las células vivas.
Nota: Dispersión hacia delante proporciona información sobre tamaño de la célula basada en la difracción de la luz, mientras que la dispersión lateral proporciona una medida de complejidad interna o granularidad. Eventos de flujo con pequeño avance y la dispersión de lado se pueden considerar como las células muertas. - Ajustar la tensión y ganancia del citómetro de flujo según las instrucciones del fabricante. Ejecutar un ensayo de la muestra para asegurar la captura de datos en la intensidad de fluorescencia máxima. Ninguna indemnización se requiere para la adquisición de canal único.
- Utilice dispersión hacia delante y lateral para bloquear selectivamente las células vivas.
3. medición de afluencia del calcio por flujo en vivo-celular citometría de
- Después de la preparación de una suspensión unicelular, resuspender las células en 1 mL de medio de Na+ sin calcio y cargarlos con 2 ng/mL de calcio colorante indicador según protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales) con 10 μl de ácido al 5% pluronic. Incube las células durante 30 min a 37 ° C.
- Lavar las células añadiendo 3 – 5 mL de medio de Na+ sin calcio y centrifugación suavemente (200 x g durante 4 min). Quite el sobrenadante y resuspender las células en medio Na+ sin calcio, lavar una segunda vez.
- Resuspender las células en 1 mL de medio de Na+ sin calcio, coloque en hielo y permitirles de esterificar durante 30 minutos.
- Lavar 1 x más agregando 3 a 5 mL de medio de K+ y centrifugación (200 x g durante 4 min); entonces, resuspender las células en K+ medio y alícuota les en fluorescencia células asistida clasificación (FACS) tubos a una concentración de 1 x 106 células por 500 μl por tubo de FACS.
Nota: El número de tubos por muestra de FACS dependerá el número de tratamientos y repeticiones que se incluyen. - Colocar los tubos de la FACS en el hielo hasta que las células están listas para ser analizadas. No deje las células en hielo por un período prolongado pero comenzar el ensayo tan pronto como sea posible.
- Para algunas muestras, preincubate las células con el inhibidor de específicos del receptor P2X7 AZ10606120 (1 μm por 10 – 15 min) o A438079 (10 μm por 30 min) a 37 ° C antes del análisis.
- Unos minutos antes de ejecutar la primera muestra, añadir CaCl2 (a una concentración final de 1 mM en el tubo de FACS) y coloque el tubo en un baño de agua de 37 ° C para recuperarse.
- Caída de un limpio, pequeño agitador magnético en el tubo de FACS y posición del tubo en el módulo de tiempo ligado a un baño de agua de 37 ° C circulante para controlar la temperatura de la muestra. Seleccione una velocidad de agitación baja para garantizar un movimiento de la muestra sin introducir un efecto de vórtice. Coloque el adaptador de tubo de chaqueta de agua sobre la plataforma de muestra y cierre el brazo de palanca de la máquina de FACS.
- Iniciar la adquisición de la muestra y ejecutar la muestra durante 3 min en alrededor de 1.000 eventos por segundo.
- En la marca de la s 40, rápidamente Retire el tubo y añadir el agonista P2X7, ATP de 1 mM o 300 μm BzATP y reemplazar el tubo para realizar la adquisición.
- Mientras esté grabando la primera muestra, prepare la segunda muestra con CaCl2 y coloque en 37 ° C para permitir tiempo suficiente para que las células calentar antes del análisis. Una vez terminada la primera muestra, limpiar la ingesta mediante la ejecución de una muestra de agua, y entonces puede comenzar la adquisición de la segunda muestra como se describe en los pasos 3.8 y 3.9. Limpie siempre la ingesta entre las muestras.
4. medición de formación de poro mediante citometría de flujo de células vivas
- Crear una suspensión unicelular como se describe en los pasos 1.16 y 1.17. Guardar unos pocos mililitros del medio viejo, utilizarlo para resuspender las células a una concentración de 1 x 106 células por 100 μl por tubo de FACS y coloque en hielo hasta que esté listo.
- Antes de ejecutar el ensayo, agregar 900 μl de medio K+ para un volumen final de 1 mL y coloque los tubos en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos recuperar.
- Caso, preincubate las células con los tratamientos, incluyendo los inhibidores específicos de P2X7 AZ10606120 (1 μm por 10 – 15 min) o A438079 (10 μm por 30 min).
- Inmediatamente antes de ejecutar el ensayo, añadir bromuro de etidio de 25 μm para el tubo de FACS. a continuación, añadir el agitador magnético, colocar en la máquina de FACS según paso 3.7 y comenzar la adquisición.
Nota: Bromuro de etidio es tóxico y debe tenerse cuidado al manipularlo. Deseche apropiadamente usados tubos de FACS. - Para inducir la formación de poros en la membrana celular, agregue 1 mM ATP o 100 μm BzATP 40 s después del comienzo de la adquisición.
- Ejecutar los ejemplos en alrededor de 1.000 eventos por segundo durante 6 minutos.
- En marcha la primera muestra, tomar la segunda muestra del hielo y colocarlo en el baño de agua de 37 ° C para permitir tiempo suficiente para que las células para recuperarse antes del análisis. Una vez que haya terminado con la adquisición de la primera muestra, limpiar la ingesta mediante la ejecución de una muestra de agua; Luego, la segunda muestra se puede colocar en la máquina para comenzar a grabar como se describe en los pasos 3.8 y 3.9.
5. medir fagocitosis por citometría de flujo de células vivas
- Crear una suspensión unicelular como se describe en los pasos 1.16 y 1.17. Resuspender las células en medio condicionado y alícuota en FACS tubos a una concentración de al menos 1 x 106 células por 100 μl por tubo de FACS. Diluir las células a una concentración final de 1 x 106 células/mL con medio Na+ (por ejemplo, agregar 900 μl de medio de Na+ ) y coloque las células en hielo hasta que se realiza el análisis.
- Uso de 1 μm de gotas de látex de YG (microesferas) como blancos fagocíticos para los ensayos de fagocitosis en tiempo real.
Nota: Otros colores también pueden ser sustituidos, pero se encontraron granos de diferentes tamaños objetivos inadecuados de fagocitosis4. - Antes de ejecutar la primera muestra, transferir las células a un baño de agua de 37 ° C e incubar por aproximadamente 7-10 minutos permitir que las células para recuperarse.
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Añadir cualquier tipo de tratamientos que requieren preincubación a sus tubos respectivos, incluyendo 1 mM ATP durante 15 min, 300 μm oxidado ATP (oxATP) por 40 min, 20 μm Citocalasina D 20 min y 4% paraformaldehido (PFA) durante 20 minutos.
- Preincubación no se requiere para 5% de suero humano. Si los tratamientos se añaden aproximadamente al mismo tiempo, las muestras se pueden ejecutar en orden inverso mientras los otros siguen a incubar. Por ejemplo, ejecutar los controles y el suero primero, luego la muestra tratada con ATP, seguida por Citocalasina D y PFA y oxATP última.
- Coloque la muestra en el citómetro, con agitador magnético, como se describe en los pasos 3.8 y 3.9 y luego, iniciar la adquisición de la muestra.
- Retire el tubo de muestra de la máquina de 15 – 20 s después del comienzo de la adquisición y añadir 5 μl de granos YG sin diluir. Devolver el tubo de la FACS de muestra y seguir la adquisición. Ejecutar los ejemplos 7-8 min a alrededor 1.000 eventos/s.
- En marcha la primera muestra, tomar la segunda muestra de hielo y colocarlo en un baño de agua de 37 ° C para permitir tiempo suficiente para que las células para recuperarse antes del análisis. Una vez terminada la primera muestra, limpiar la ingesta mediante la ejecución de una muestra de agua y, luego, comenzar adquisición en la segunda muestra como se describe en los pasos 3.8 y 3.9.
6. Análisis de datos
- Exportar los datos a una hoja de cálculo. El análisis de datos dependerá de la pregunta experimental.
Nota: Ten en cuenta que pruebas diferentes pueden tener intensidades de base diferentes, por lo que es importante para que funcione el ensayo por un tiempo designado al principio (alrededor de 40 s) antes de agregar cualquier agonistas y para normalizar los datos calculando el cambio en fluorescencia (la fluorescencia en un dado momento [F] dividida por la fluorescencia en el momento cero [F0] o F/F0). - Para cuantificar la velocidad o cinética de la función de P2X7 en cuestión, calcular el área bajo la curva o la suma de los trapecios bajo la curva para cada 10 s tiempo período16.
- Para determinar los efectos de tratamientos, promedio de la intensidad de fluorescencia en la final de 10-20 s de grabación y comparar los tratamientos. Determinar la importancia de t-test o análisis de varianza.
Representative Results
Cultivos de células progenitoras neurales
Progenitoras neurales esfera culturas derivadas mediante este método deben ser fase brillante y tienen un borde redondo liso (figura 1AB). En las culturas saludables, pequeño microspikes puede observarse en los bordes (figura 1). En los pasajes finales, o si alimenta inadecuadamente, esferas pueden formar formas rectangulares grandes (Figura 1E, indicada por la flecha) o una forma de taza hueco (figura 1). Estas culturas no deben ser utilizadas para citometría de flujo o cualquier otras aplicaciones posteriores, como estas características podrían ser indicativo de diferenciación. Para confirmar el estado de progenitoras neurales, fueron plateadas las células sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-ornitina y laminin para inmunocitoquímica (Figura 1F y en confluencia superior, figura 1). Las células fueron manchadas para GFAP, nestina, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 y DCX para identificar las células como células progenitoras de tipo 2 (hipocampo) o tipo C progenitor células (SVZ)9. Las células deben tener un núcleo bien definido y procesos extendidos.
Figura 1: cultivo de células progenitoras neuronales hippocampal representante. (A) las células progenitoras neuronales hipocampales son aisladas de ratones adultos y cultivadas como neuroesferas hasta aproximadamente 100 a 150 μm de diámetro. Neuroesferas (B) deben tener una periferia lisa, (C) y pequeñas microspikes pueden ser observadas en su superficie. Cuando las esferas están demasiado tiempo en la cultura, pueden formar Copa (D) o (E) formas oblongas. Estas culturas no deben usarse para experimentos. Para confirmar la condición de progenitor neural de las células, las semillas como una suspensión unicelular en poly-L-ornitina (OLP) y cubreobjetos de vidrio recubierto de laminina de inmunoquímica. Las células deben tener un pequeño soma y los procesos de ramificación, (F) en confluencia bajo y (G) listo para inmunoquímica. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Influjo de calcio mediante citometría de flujo de células vivas
Este protocolo permite el análisis de la función del receptor P2X7 como un canal de calcio en tiempo real. La cinética de la función del receptor, así como los efectos de diferentes agonistas y antagonistas, también pueden ser evaluados. Cuando se trazan sobre tiempo, afluencia del calcio en el hipocampo y las células progenitoras neurales de SVZ fue generalmente similar (figura 2A y figura 2B, respectivamente). Agonistas (ATP o BzATP) se añadieron en la marca de la s 40, según lo indicado por la flecha roja. Por un breve momento, se retira la sonda desde el punto de grabación para añadir al agonista, lo que resulta en puntos de datos de cero. Esto permitirá la identificación de la época cuando el agonista se agregó. BzATP rápidamente activa los receptores P2X7, abriendo el canal del ion y que permite la afluencia del calcio, que se une a Fluo-8 y fluoresce. Aplicación de ATP generalmente resulta en una afluencia del calcio más gradual. Tiene una afinidad baja a P2X7 en comparación con BzATP y también dará lugar a la activación de receptores g-proteína-juntados, una vía de señalización más lento que libera calcio desde el retículo endoplásmico. La inclusión de los antagonistas P2X7 A438079 y AZ10606120 (datos no mostrados) reduce la afluencia del calcio en respuesta a la aplicación del agonista.
Figura 2: flujo de calcio células vivas en las células progenitoras neuronales del hipocampo y SVZ. Función de canal de calcio de receptor P2X7 fue demostrada en (A) hipocampo y las células progenitoras derivadas de SVZ (B) por los cambios en la fluorescencia Fluo-8. Aplicación del agonista P2X general ATP y P2X7 agonista BzATP resultado en canales del ion P2X7 apertura, permitiendo la afluencia del calcio. La afluencia fue bloqueada con los inhibidores específicos de P2X7 A438079 o AZ10606120 (datos no mostrados). F = fluorescencia; F0 = fluorescencia en el momento cero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Formación de poros por citometría de flujo de células vivas
Formación de poros transmembrana es una característica canónica de los receptores P2X7, resultados a cambio de la macromolécula y puede conducir a la muerte celular. Etidio+ es una molécula grande (Da 314) excluida las células sanas; su absorción y posterior intercalación con el ADN resulta en emisiones fluorescentes y puede utilizarse para evaluar la capacidad de formar poros transmembranales de los receptores P2X7. Después de la aplicación de agonistas de la ATP (ATP de 1 mM) y BzATP (100 μM) en los años 40 s (indicada por la flecha), tiempo-resuelve citometría de flujo captura el bromuro de etidio entrar en las células en tiempo real (Figura 3A). Este efecto fue atenuado por el inhibidor específico P2X7 AZ10606120. El ensayo de absorción de bromuro de etidio demuestra un receptor P2X7 funcional C-terminal17 y es buena evidencia para la expresión de receptor P2X7 integral. Ensayos de respuesta a la concentración de ATP ilustran los efectos de la concentración del agonista en formación de poro P2X7, usando el cambio en la fluorescencia del bromuro de etidio en el tiempo (figura 3B). Curvas de concentración de dosis de agonista junto con inhibidores específicos de receptores proporcionan la evidencia fuerte para la activación del receptor.
Figura 3: formación de poros transmembrana P2X7 medido por absorción etidio. La adición de momentos de bromuro de etidio antes del comienzo de la adquisición se utiliza para medir la formación de poros transmembranales P2X7. Altas concentraciones de ATP y BzATP resultado del receptor P2X7 (A) poros de la formación, permitiendo que el bromuro de etidio entrar en la célula. El inhibidor de P2X7 AZ10606120 atenúa este fenómeno y proporciona la evidencia para los receptores P2X7 funcionales. (B) ATP concentración-respuesta ensayos demostraron la formación de poro significativo a 500 μM y 1 mM pero no a concentraciones menores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Fagocitosis por citometría de flujo de células vivas
Nuestro grupo ha demostrado previamente que la ATP extracelular inhibe fagocitosis mediada por P2X7 saldándose el P2X7 c-término del citoesqueleto, concretamente, UROLOGICAL miosina IIA18,19. Este método amplía estos resultados para demostrar la implicación del receptor P2X7 en la fagocitosis por el hipocampo y las células progenitoras neurales SVZ en tiempo real (figura 4, un ejemplo de la fagocitosis hipocampo). Niveles de fagocitosis desinhibida (control) de 1 YG látex μm fueron establecidos como control positivo. ATP inhibe la fagocitosis de granos de la YG en la misma medida que los inhibidores no específicos, es decir, la fijación de la PFA y la polimerización de actina inhibidor de la Citocalasina D, mientras que 5% de suero abolió todos innata fagocitosis20.
Figura 4: absorción de grano YG demostrando la capacidad fagocitaria de progenitores neuronales a través de los receptores P2X7. YG grano captación por las células progenitoras neurales es observable utilizando células vivas flujo cytometry en tiempo real. Controlar los niveles de fagocitosis establecidos inicialmente y si el número de células permite, vuelve a confirmar al final de la carrera. Participación de los receptores P2X7 está indicado por la inhibición de la fagocitosis en presencia de ATP, como esto disocia el c-término del citoesqueleto de la membrana, previniendo los cambios citoesqueléticos P2X7-mediada. La aplicación de ATP bloquea fagocitosis en la misma medida que el uso de inhibidores no específicos de la fagocitosis, como paraformaldehido (PFA) y Citocalasina D (Polk). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Se presenta un protocolo detallado para el análisis de la función del receptor P2X7 en cultivos de células progenitoras neurales derivados de los nichos neurogénicos adultos. Las aplicaciones potenciales para progenitoras neurales adultas las células van desde investigaciones para fines terapéuticos, y así el método de la cultura debe ser robusta y reproducible. Hay una serie de aspectos clave en el presente Protocolo que pueda afectar la calidad de la cultura de extremo. Una vez retirado el cráneo, el cerebro no se debe secar y la disección debe realizarse tan pronto como sea posible. Particularmente con el hipocampo, cuidado extra para eliminar los vasos sanguíneos o tejido membranoso producirá rendimientos de células progenitoras superior. El proceso de disociación y trituración puede impactar fuertemente el número de esferas en una cultura; el tejido de agitación durante la incubación con tripsina-EDTA dará como resultado una solución más homogénea. El uso de un vidrio pulido de fuego pasto pipeta sobre un P1000 pipeta plástico es muy recomendable para reducir la muerte celular y mejorar la cultura resultante. Evite overtriturating. A pesar de estas precauciones, el procedimiento puede crear muchos escombros en la cultura de P0, y evitar la pérdida de las células progenitoras, lavado o la cultura de la alimentación debe evitarse hasta que las esferas se han formado.
Un número de diferencias entre el hipocampo y las culturas de la SVZ será evidentes en P0. Las culturas hippocampal rendimiento esferas menos, y estos generalmente se adhieren. Utilizar una pipeta para levantar suavemente las esferas para el paso inicial. No se observaron esferas adherentes en pasajes posteriores. Diferentes marcas de frascos de cultivo de tejidos pueden causar las esferas, esferas especialmente hipocampales, se adhieren y crecen como colonias en la parte inferior del plato. Esto no se ha encontrado para alterar cualquier resultados aguas abajo de este protocolo pero debe ser vigilado, y consistencia debe mantenerse siempre que sea posible.
Anteriores métodos utilizados para medir la función del receptor P2X7, como parche de sujeción para registrar afluencia de calcio, son lentos y laboriosos y sólo pueden proporcionar la información en una sola celda. Este protocolo presenta un método rápido y reproducible para analizar las tres funciones principales de los receptores P2X7 utilizando una máquina. Citometría de flujo de células vivas de tiempo resuelto permite el análisis de toda la población y proporciona al investigador con información sobre la cinética de la afluencia del calcio, formación de poro y función fagocítica. Además de esto, citometría de flujo se puede utilizar fácilmente como un método para evaluar patrones de expresión de marcador y análisis de la población basado en niveles de expresión de tamaño o proteína de la célula.
Al realizar estos experimentos, se pueden observar diferencias en la afluencia del calcio máxima, absorción de etidio o fagocitosis tasas entre repeticiones. Para minimizar esto, el tamaño de la esfera, condiciones de cultivo y régimen de alimentación deben ser consistente como la salud de las células tendrán un impacto significativo en los resultados obtenidos. El tiempo en el hielo también puede influir en los datos, así que garantizar todo antes de tiempo para que el tiempo en el hielo es mínimo. Asegúrese de que el tinte del indicador de calcio tiempo de carga es constante. Otro factor que puede llevar a grandes inconsistencias en las grabaciones de calcio máxima es la variación entre lotes de ATP. La preparación de las reservas de ATP es crucial, y debe evitarse el uso de lotes diferentes para los mismos experimentos. También se recomienda la comparación de viejos y nuevos lotes para asegurar que el ATP sea consistente. La efectividad de los antagonistas P2X7 también puede ser línea celular dependientes y del lote, para que optimización de concentraciones y tiempos de incubación puede ser necesario.
Cabe destacar que afluencia/eflujo de calcio es una de las funciones celulares más fundamentales y complejo y puede estar mediado por muchos receptores. La afluencia del calcio inducida por el ATP, como una medida clásica para la función de canal/poro P2X7, no puede reflejar con precisión la verdadera función de los receptores P2X7 como ATP puede también activar receptores P2Y para liberar calcio intracelular. En este caso, el bario puede ser un catión mejor utilizar en lugar de calcio ya que su flujo es unidireccional16. Para diferenciar la contribución de los receptores P2Y en afluencia del calcio, pueden utilizarse condiciones donde 1 mM EDTA o glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, ácido etilendiaminotetraacético N′ (EGTA) se añade al medio en lugar de CaCl2 K+ en este ensayo.
Este protocolo también puede ser adaptado fácilmente para adaptarse a otros tipos celulares y puede ser útil para investigar la funcionalidad de receptores de canal del ion alternativo o receptores que participan en la fagocitosis. Este método también puede ser adaptado a una máquina de citometría de flujo sin un módulo de tiempo. Como ejemplo, se pueden realizar ensayos de fagocitosis donde granos de YG se agregan 7 – 8 min antes del análisis por citometría de flujo convencional. Mantener las células a 37 ° C y continuamente remolino les. Esto no proporcionará información en tiempo real, pero las diferencias en la media de la fluorescencia final todavía informará al investigador con respecto a la funcionalidad de los receptores P2X7.
Interés en los receptores P2X7 como un fármaco objetivo21,22 o incluso como una entrega de drogas23,de la ruta24 está creciendo rápidamente, y métodos para el estudio de este enigmático receptor deben ser continuamente adaptaron y mejoraron a facilitar estos estudios. Este protocolo describe métodos que pueden utilizar para explorar la función P2X7 en células progenitoras neurales adultas, y se espera que lograr una mayor comprensión de los receptores P2X7 en los nichos neurogénicos puede conducir a avances en el tratamiento del ictus y otras lesiones isquémicas.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Maria Kasherman y Xin Huang por sus contribuciones a esta investigación. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de investigación médica de Rebecca L. Cooper y M.W., T.C.L., M.L. y T.C.L. de Nacional de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) de Australia (571100 y 1048082) y la Fundación Baxter ( Sydney, Australia). B.G. fue apoyado por la beca del futuro del Consejo de investigación australiano (ARC) (FT120100581), becas de proyecto de NHMRC (1048082, 1061419 y 1120095) y operativo infraestructura apoyo beca del gobierno victoriano al Instituto Florey. M.L. fue apoyado por un Charles D. Kelman, M.D. postdoctorado Premio (2010) de la Fundación Internacional de investigación retiniana (USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
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