Summary
Att ge encelliga känslighet, är realtid flödescytometri unikt lämpade att kvantifiera multimodala receptor funktioner levande kulturer. P2X7 receptor funktionen använder vuxen neurala stamceller, och bedömdes via kalcium tillströmning upptäcks av kalcium indikator dye, transmembrana pore bildandet av etidiumbromid bromid upptag och fagocytos med fluorescerande latex pärlor.
Abstract
Live-cell flödescytometri används alltmer bland cellbiologer för att kvantifiera biologiska processer i en levande cell kultur. Det här protokollet beskriver en metod där live-cell flödescytometri förlängs vid att analysera flera funktioner P2X7 receptor activation i realtid. Använda en tid modul installerad på en flödescytometer, kan live-cell funktionalitet bedömas och ritade under en given tidsperiod att utforska kineticsen av kalcium tillströmning, transmembrana pore bildandet och fagocytos. Den här enkla metoden är fördelaktigt eftersom alla tre kanoniska funktioner av P2X7-receptorn kan bedömas med hjälp av en maskin, och insamlade data plottas över tid ger information på hela live-cell befolkningen snarare än encelliga inspelningar ofta erhållits med tekniskt utmanande patch-clamp metoder. Kalcium tillströmning experiment använder kalcium indikator färgämne, medan P2X7 pore bildandet analyser förlitar sig på etidiumbromid som tillåts passera genom det transmembrana pore bildas vid hög agonist koncentrationer. Gul-grön (YG) latex pärlor används för att mäta fagocytos. Specifika agonister och antagonister används för att undersöka effekterna av P2X7 receptor aktivitet. Dessa metoder kan individuellt, ändras för att ge kvantitativa data på valfritt antal kalciumkanaler och purinergic och scavenger-receptorer. Sammantaget belyser de hur användningen av realtid live-cell flödescytometri är en snabb, kostnadseffektiv, reproducerbar och kvantifierbar metod att undersöka P2X7 receptor funktion.
Introduction
Studien av purinergic signalering är bred och mångfacetterad, cellulär fysiologi, biokemi och farmakologi. Purinergic signalering är involverad i ett oändligt antal cellulära och molekylära processer, från cancer och cellcykelns reglering till cell-cell kommunikation och stamcellsbiologi; som sådan, finns det ofta en potential att modulera purinergic signalering för en terapeutisk fördel. Av purinergic receptorer, har P2X7-receptorn fått betydande uppmärksamhet under de senaste åren på grund av dess potential som ett terapeutiskt mål för många inflammatoriska tillstånd1. Metoder för att studera receptorn har utvecklats och anpassats under åren för att underlätta denna forskning2,3,4,5. Här beskriver vi en live-cellen flöde flödescytometri metod för att undersöka P2X7-receptorer i vuxen neurala stamceller som härrör från den subventrikulära zonen (SVZ) och Hippocampus dentate gyrus flera funktioner.
P2X7 receptorn beskrevs först som P2Z receptorn eller 'celldöd' receptorn, som dess aktivering med höga koncentrationer av adenosintrifosfat (ATP) resulterar i bildandet av en stora transmembrana por genomsläppliga för molekyler upp till 900 Da6. Detta leder till cytoskeletal ombildning, transmembrana pore bildandet, och, eventuellt, apoptos eller nekros7. Traditionellt har kvantifieras denna funktion av P2X7 i upptaget av stor molekylvikt färgämnen som YO-PRO-1 eller etidiumbromid metylbromid, som fluorescerar när interkalenderat med DNA3,8. Plate reader metoder, som är snabb och möjliggöra uppskalning, generellt tillåter inte för observationen av kinetik. Den metod som beskrivs här baseras på etidiumbromid upptag och tillåter ökningen fluorescens observeras över tiden, ger ett större djup av information när det gäller hastigheten av pore bildande. P2X7-receptorer har sedan dess visat att underlätta ett antal nonimmune funktioner, med olika svar beroende på exponering tid och agonist koncentration9,10. Kort aktivering av lägre koncentrationer av ATP resulterar i ering inflödet för tillämpningen av signalsubstansen och signal transduktion11. Med hjälp av flödescytometri för att mäta kalcium tillströmning övervinner problemen med besvärliga och tekniskt utmanande metoder — särskilt patch fastspänning för att mäta inåtgående strömmar som ger ovärderlig information om förändringen i potential över ett cellmembran men inte tillåter för befolkningen analys2. Den tredje funktionen av P2X7-receptorer uppstår i avsaknad av ATP, där P2X7-receptorer har visat sig underlätta fagocytos i både immunförsvaret och nervsystemet9,12,13. Framsteg inom mikroskopi tekniker har låtit visualisering av cytoskeletal rearrangements under processen upptag även om kvantifiering och befolkningen analys kan fortfarande innebära en utmaning.
Live-cellen flöde flödescytometri metoden beskrivs här tillåter för utredning av alla tre huvudfunktioner av P2X7-receptorer i realtid. Införandet av en tid module enhet på flödescytometer tillåter temperaturkontroll och ständig omrörning av celler i suspension. Agonist och antagonist stimuli kan levereras inom en sekund, så att nära oavbruten mätning av cellulära svaret. Detta utgör en snabb och enkel metod för att kvantifiera reproducibly funktion samtidigt som man undviker användningen av flera test system. Det är viktigt att notera att detta protokoll kan enkelt anpassas för att passa vilken celltyp och kunde användas för att undersöka andra receptor subtyper med tanke på införandet av särskilda agonister eller -hämmare, beroende på deras egenskaper.
Protocol
Djur var behandlas i enlighet med den australiska uppförandekod för vård och använda av djur för vetenskapliga ändamål och godkänt för användning av Griffith University djur etikkommittén.
1. Neurosphere kultur av neurala stamceller från vuxna SVZ och Hippocampus
Obs: Protokollet dissektion som presenteras här är baserad på arbete av Walker och Kempermann, och ett detaljerat protokoll för dissekering av neurala stamceller från vuxna möss är tillgängliga någon annanstans14. Odlingsbetingelser har ändrats från Babu och kollegor15. Vuxna kvinnliga C57BL/6 möss i åldern 8 – 12 veckor användes.
- I biologiska säkerhetsdragskåp, förbereda odlingssubstratet (neurala basala medium) kompletteras med neurala stamceller spridning tillägg, 2 mM glutamin, 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 ng/mL basic fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) och 2 µg/mL heparin.
- Avliva två möss av CO2 inandning. Alternativt, söva möss enligt institutionella riktlinjer och omedelbart avliva dem av cervikal Dislokation. Spray sina huvuden med 70% etanol och halshugga dem. Överföra varje huvud till ett sterilt rör innehållande Hanks balanserad saltlösning (HBSS) med 1 x penicillin/streptomycin lösning (P/S).
- Utföra dissektioner i en LAF i dissektion Mikroskop.
- Med pincett och dissektion sax, ta bort vävnad och ben att exponera hjärnan och överföra det till en steril maträtt som innehåller HBSS med P/S.
- Placera den hjärna ventral sidan upp och använda en skalpell blad för att göra en komplett koronalt snitt över den optiska chiasm. Håll hjärnan stadigt med tången och använda en swift, ren, nedåtgående rörelse. Undvika sågning att minimera celldöd och för att upprätthålla vävnadsstrukturen.
Obs: Om inte hållas ordentligt, hjärnan kan luta framåt under snittet, att äventyra antalet stamceller erhållits från SVZ. - Isolera SVZ från rostralt hälften av hjärnan.
- Leta upp båda ventriklar, åtskilda av septum, med corpus callosum bildar en vit bro ovanför dem.
- Använda pincett för att ta bort septum separera två ventriklarna och isolera de laterala väggarna i de främre laterala ventriklarna. Gör detta genom att skära bort ovanför, nedanför, på sidorna och på framsidan med fina dissektion sax. Det ska återstår bara en liten kopp-liknande form.
- Förbered en ren petriskål lock med några droppar HBSS i mitten och överföra SVZ till vätskan. Tillåt inte vävnaden att torka eller vidröra en torr yta. Stå till sidan medan dissekera hippocampi.
- Isolera hippocampi från den kaudala delen av hjärnan.
- Göra en mittlinjen som skär mellan hjärnhalvorna att bryta corpus callosum. Använd de laterala ventriklarna som guide och vik försiktigt upp cortex för att exponera hippocampus. När hjärnbarken har varit upprullad, kan hippocampus ses som en tät, vit, krökt struktur.
- Använd fina dissektion sax eller pincett för att isolera hippocampus från den angränsande vävnaden.
- Med pincett, ta bort överflödig vit substans, blodkärl och någon membranös vävnad som omfattar hippocampus.
- Förbered en ren petriskål lock tillagas med några droppar HBSS och överföra hippocampus till vätskan. Upprepa för den andra hjärnhalvan.
- När hippocampus och SVZ från två möss har isolerats och överföras till sina respektive petriskål lock, mekaniskt tärna vävnaden med hjälp av en skalpell blad. Hugga vävnaden i en petriskål locket för ca 1 min, roterande varje 10 s tills vävnaden ser jämn och bara fina bitar kvar. Ta en ren skalpell blad och upprepa för andra skålen, tärning vävnaden för 1 min.
- Med 1 mL pipett överföra alla vävnaden från varje petriskål locket till separata rör som innehåller 1 mL av 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA). Använd en tub för SVZ och en tub för hippocampus.
- Gör detta genom första pipettering ungefär hälften av de trypsin-EDTA till vävnaden i skålen att minimera luftbubblor och förhindra den vävnad som kommer i kontakt med torr pipettspetsen som överförs till röret. Skölj skålen och skalpell bladet med resten av den trypsin-EDTA att samla in så mycket vävnad som möjligt och lägga till den i röret.
- Inkubera vävnaden med trypsin i 37 ° C vattenbad för 30 min, agitera röret varje 10 min för att sära ordentligt på vävnaden.
- Pulverisera vävnaden med ett brand-polerat glas Pasteur-pipett för att skapa en enda cellsuspension. Se till att inte overtriturate eftersom detta kommer att orsaka överdriven cellys. Detta är ett kritiskt steg för optimal vävnad dissociation.
- Observera tube innehållet under processen för sönderdelning och stannar vid de tidigaste tecknen att majoriteten av klumpar av vävnad har avlägsnats. Trypsin lösningen bör bli något grumligt när cellerna har gått in i encelliga fjädring, även om några klumpar kvar.
Obs: Som en indikation är passerar suspensionen upp och ner 10 x-15 x tillräcklig. - Lägg till odlingsmediet upp till 5 mL att neutralisera trypsin, och snurra vid 300 x g i 3 min. tvätta ytterligare 2 x med HBSS och passera mediet genom en 70 µm cell sil att ta bort någon vävnad klumpar.
- Överföra alla celler i 15 mL medium till en T75 cell kultur kolv.
Obs: Kulorna bör bilda i passagen noll (P0) SVZ kultur efter 7 – 10 dagar och efter 15 – 20 dagar i hippocampus kultur. Avstå från tvättning eller utfodring celler under denna tid för att maximera antalet neurala stamceller i kultur. Om fler föräldraparets krävs, eller för att minska P0 inkubationstiden, är det möjligt att öka antalet möss som offras. - Upprätthålla kulturer vid 37 ° C med 5% CO2 , och efter den inledande fasen P0 kultur, passage varje 7 – 10 dagar efter behov, använda en biologisk säkerhet skåp och standard vävnadsodling praxis.
Obs: P0 Hippocampus kulturen bör generera tillräckligt sfärer till passage i en kolv med T25; SVZ kulturen kommer att generera många fler områden och kan vara passaged i en T75. Om sfärernas P0 Hippocampus har följt, använda 200 µL pipett att försiktigt lyfta området. - Passagen sfärernas när de når 150 till 200 µm i diameter. Samla klot och medium i en 15 mL tub och låt kulorna att nöja sig med självtryck cirka 5 min. Alternativt, snurra på en låg hastighet (100 x g) i 2 min.
- Ta bort mediet och separera celler med dissociation reagens för 7 – 10 min, beroende på storleken på kulorna.
Obs: Dissociation reagens används kommer att ha betydande effekter på resultatet av kulturen, så hänvisas till Tabell av material för detaljerna. - Tvätta cellerna genom att tillsätta 5 mL HBSS till cell lösning och centrifugera vid 300 x g under 3 min. avlägsna supernatanten, resuspendera cellerna i odlingsmedium och utsäde på cirka 150.000 celler i 5 mL medium i en T25 cell kultur kolv eller motsvarande. Upprätthålla kulturerna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Bekräfta neurala stamceller cell status genom att identifiera uttrycket av stamcells markörer såsom Sox2 och ASCL1 innan du fortsätter till någon efterföljande protokoll9.
Obs: Detta kan göras genom forskarens metod (t.ex. immunkemi genom mikroskopi, flödescytometri eller western blot, eller med hjälp av kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR)).
2. beredning av en Single-cell Suspension för analys av flödescytometri
-
Förbered krävs. Dessa inkluderar följande.
- Förbereda Na+ medium innehållande 145 mM NaCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukos, 0,1% bovint serumalbumin (BSA) och 0,1 mM CaCl2. Detta medium används också i en kalcium-fri form, med 0,1 mM CaCl2 utelämnas.
- Förbereda K+ medium innehållande 145 mM KCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glukos och 0,1% BSA.
Obs: Dessa medier i stor utsträckning var optimerad och beskrivs i tidigare publikationer4,5. - Förbereda Lager ATP genom vägning tillräckligt ATP pulver till ca 20 mL av en 100 mM lager. Lös upp pulvret i 17 mL KCl buffert (145 mM KCl, 5 mM KOH och 10 mM HEPES, pH 7.5) och långsamt, under omrörning, tillsätt 2 mL 18% (w/v) tetrametylammoniumhydroxid (TMA) till lösning att ta pH 6,8-7,0.
- Anpassa den slutliga volymen till 20 mL. Inte överskridande pH förbi 7.0. Lagra beståndet vid-80 ° C; Observera att de ATP alikvoter är stabila i minst 6 månader.
Obs: Vattenfri ATP gratis molekylvikt är 551.14 g/mol, och detta inkluderar inte den molekylära vikten av vatten och dinatrium molekyler, som kan variera från batch till batch och bör beaktas för beräkningarna. TMA är giftigt, och försiktighet måste iakttas vid hantering. Läs de säkerhet datablad och förbereda bestånden i ett dragskåp skåp. - Förbereda lager BzATP genom upplösning av BzATP i Ultrarena H2O för lager koncentration på 10 mM.
- Skapa en enskild cell suspension som beskrivs i steg 1.16 och 1.17. Räkna de celler som använder en hemocytometer eller automatisk cell räknare. Att resuspendera cellerna i mediet (t.ex. Na+ medium, odlingsmedium) för experimentet genomförs (som beskrivs nedan) och placera cellerna på is under tiden.
- För varje experiment, säkerställa tillräckligt prov att inkludera kontroller för framåt och side scatter, liksom för kalibrering av inställningarna för spänning och ersättning. Observera att som en indikation, att sfärer som vuxit i en T75 kolv vanligtvis ge cirka 8 x 106 celler per kolv.
-
Ställa in flödet cytometer inställningar med hjälp av kontrollprover.
- Användning fram och side scatter till selektivt gate i levande celler.
Obs: Framåt scatter ger information angående Cellstorlek baserat på ljus diffraktion, medan side scatter ger ett mått på inre komplexitet eller granularitet. Flöde händelser med små fram och side scatter kan betraktas som döda celler. - Justera spänningen och få av flödescytometer enligt tillverkarens anvisningar. Kör en rättegång prov för att säkerställa tillfångatagandet av data vid maximal fluorescensintensiteten. Ingen ersättning krävs för enda kanal förvärv.
- Användning fram och side scatter till selektivt gate i levande celler.
3. mäta kalcium tillströmning av Live-cellen flöde flödescytometri
- Efter beredning av en encellig suspension, resuspendera cellerna i 1 mL kalciumfri Na+ medium och ladda dem med 2 ng/mL av kalcium indikator färgämne enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material) med 10 µL 5% pluronic syra. Inkubera cellerna under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna genom att lägga 3 – 5 mL kalciumfri Na+ medium och centrifugering försiktigt (200 x g för 4 min). Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i kalciumfri Na+ medium, tvätta en andra gång.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL kalciumfri Na+ medium, placera dem på isen och tillåta dem att de esterify i 30 min.
- Tvätta 1 x mer genom att lägga till 3 – 5 mL K+ medium och centrifugering (200 x g för 4 min); sedan resuspendera cellerna i K+ medium och alikvotens dem till fluorescens assisterad cell sortering (FACS) rör vid en koncentration på 1 x 106 celler per 500 µL per FACS rör.
Obs: Antalet FACS rör per prov beror på antalet behandlingar och upprepas som ingår. - Placera FACS rören på is tills cellerna är redo att analyseras. Lämna inte cellerna på is under en längre period men påbörja analysen så snart som möjligt.
- För vissa prover preincubate cellerna med P2X7 receptor-specifika hämmare AZ10606120 (1 µM för 10 – 15 min) eller A438079 (10 µM för 30 min) vid 37 ° C före analys.
- Några minuter innan du kör det första provet, lägga till CaCl2 (till en slutlig koncentration på 1 mM i FACS röret) och placera röret i 37 ° C vattenbad till återvinna.
- Släppa en ren, liten magnetomrörare i FACS tube och position röret i time modulen kopplad till cirkulerande 37 ° C vattenbad till kontroll provtemperaturen. Välj en låg omrörning fart att säkerställa rörligheten för provet utan att införa en vortex effekt. Placera vatten jacka tube adaptern på prov plattformen och stäng hävarmen FACS maskinen.
- Initiera provtagning och kör prov för 3 min på cirka 1000 händelser per sekund.
- På 40 s-märket, snabbt ta bort röret och lägga till den P2X7-agonist, antingen 1 mM ATP eller 300 µM BzATP, och ersätta röret för att fortsätta förvärvet.
- Medan det första provet inspelning, förbereda det andra provet med CaCl2 och placera den i 37 ° C att ge tillräcklig tid för cellerna att värma upp före analys. När det första provet har slutförts, rengör intaget genom att köra ett vattenprov och sedan förvärvet av andra provet kan börja enligt beskrivningen i steg 3.8 och 3.9. Ren alltid intaget mellan prover.
4. mäta Pore bildandet av Live-cell flödescytometri
- Skapa en enskild cell suspension som beskrivs i steg 1.16 och 1.17. Spara några milliliter av gamla medium, använda den för att resuspendera cellerna vid en koncentration på 1 x 106 celler per 100 µL per FACS rör och placera den på is tills redo.
- Innan du kör analysen, tillsätt 900 µL av K+ medium för en slutlig volym av 1 mL och placera rören i 37 ° C vattenbad i ca 10 min att återställa.
- I tillämpliga fall, preincubate cellerna med behandlingar, inklusive de P2X7-specifika hämmare AZ10606120 (1 µM för 10 – 15 min) eller A438079 (10 µM för 30 min).
- Omedelbart innan du kör analysen, tillsätt 25 µM etidiumbromid till FACS röret; Lägg sedan magnetomröraren, placera den på FACS maskinen enligt steg 3,7, och påbörja förvärv.
Obs: Etidiumbromid är giftigt, och försiktighet måste iakttas vid hantering av den. Kassera begagnade FACS rören på rätt sätt. - För att inducera bildandet av porer i cellmembranet, Lägg till 1 mM ATP eller 100 µM BzATP 40 s efter starten av förvärvet.
- Kör exemplen på cirka 1000 händelser per sekund i 6 min.
- Medan det första provet är igång, ta andra provet från isen och placera den i 37 ° C vattenbad att ge tillräcklig tid för cellerna att återhämta sig före analysen. När det första provet har slutförts med förvärvet, ren intaget genom att köra ett vattenprov; det andra provet kan sedan placeras på maskinen för att påbörja inspelningen enligt beskrivningen i steg 3.8 och 3.9.
5. mäta fagocytos av Live-cell flödescytometri
- Skapa en enskild cell suspension som beskrivs i steg 1.16 och 1.17. Att resuspendera cellerna i konditionerat medium och alikvot dem till FACS rör vid en koncentration på minst 1 x 106 celler per 100 µL per FACS rör. Späd cellerna till en slutlig koncentration på 1 x 106 celler/mL med Na+ medium (t.ex. lägga till 900 µL av Na+ medium) och placera cellerna på is tills analysen utförs.
- Använda 1 µm av YG latex kulor (mikrosfärer) som fagocytos mål för realtid fagocytos analyser.
Obs: Andra färger kan också ersättas, men olika stora pärlor befanns vara otillräcklig mål av fagocytos4. - Innan du kör det första provet, överföra cellerna till 37 ° C vattenbad och inkubera dem under ca 7 – 10 minuter så att cellerna att återhämta.
-
Lägg till någon av de behandlingar som kräver preinkubation till deras respektive rör, inklusive 1 mM ATP för 15 min, 300 µM oxideras ATP (oxATP) för 40 min, 20 µM cytochalasin D för 20 min, och 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min.
- Inga preinkubation krävs för 5% humant serum. Om behandlingar läggs vid ungefär samma tidpunkt, kan proverna köras i omvänd ordning medan andra fortsätter att ruva. Till exempel köra kontroller och serum först, sedan ATP-behandlade provet, följt av cytochalasin D och PFA och oxATP senast.
- Placera provet på cytometer med magnetomröraren som beskrivs i steg 3.8 och 3.9 och sedan inleda prov förvärv.
- Ta prov röret från maskinen 15 – 20 s efter starten av förvärvet, och tillsätt 5 µL av outspädd YG pärlor. Returnera provet FACS röret och fortsätta förvärvet. Kör exemplen i 7 – 8 min vid cirka 1000 evenemang/s.
- Medan det första provet är igång, ta andra provet från isen och placera den i 37 ° C vattenbad att ge tillräcklig tid för cellerna att återhämta sig före analys. När det första provet är klar, ren intaget genom att köra ett vattenprov och sedan börja förvärv på andra prov som beskrivs i steg 3.8 och 3.9.
6. dataanalys
- Exportera data till ett kalkylblad. Dataanalysen beror på experimentell frågan.
Obs: Vara medveten om att olika körningar kan ha olika baslinjen stödnivåer, så det är viktigt att köra analysen för en angiven tid i början (runt 40 s) innan du lägger till någon agonister och att normalisera data genom att beräkna ändringen i fluorescens (fluorescensen vid varje given tidpunkt [F] dividerat med det fluorescence tidpunkt noll [F0], eller F/F0). - För att kvantifiera den takt eller kinetik av funktionen P2X7 i fråga, beräkna arean under kurvan eller summan av de trapezoids skapade under kurvan för varje 10 s tid period16.
- Att fastställa effekterna av behandlingar, genomsnittliga fluorescensintensiteten under de sista 10 – 20 s inspelning och jämför behandlingarna. Fastställa betydelsen av t-test eller variansanalys.
Representative Results
Neurala stamceller cellkulturer
Neurala stamceller sfär kulturer härrör denna metod bör vara fas ljusa och har en slät rund kant (figur 1AB). I friska kulturer, kan små microspikes observeras på kanterna (figur 1 c). På sena passager, eller om fed otillräckligt, sfärer kan bilda en ihålig cup (figur 1 d) eller stora avlånga former (figur 1E, indikeras av pilen). Dessa kulturer bör inte användas för flödescytometri eller andra nedströms program, som dessa funktioner kan det vara vägledande om differentiering. För att bekräfta statusen neurala stamceller, celler var klädd på glas coverslips belagd med poly-L-ornitin och laminin för immuncytokemi (figur 1F och vid högre konfluens, figur 1 g). Cellerna var färgas för Fredsgenomförande, nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 och DCX att identifiera cellerna som typ 2 stamceller (hippocampus) eller typ C progenitor celler (SVZ)9. Cellerna bör ha en väldefinierad kärna och utökade processer.
Figur 1: representativa Hippocampus neurala stamceller cellkultur. (A) Hippocampus neurala stamceller är isolerade från vuxna möss och odlade som neurospheres fram till ungefär 100 till 150 µm i diameter. (B) Neurospheres bör ha en smidig periferi, (C) och små microspikes kan observeras på ytan. När kulorna är för lång i kultur, kan de bilda (D) kopp eller (E) avlånga former. Dessa kulturer bör inte användas för experiment. För att bekräfta statusen neurala stamceller av cellerna, kärna ur dem som en encellig suspension på poly-L-ornithine (PLO) och laminin-belagda glas coverslips för immunkemi. Cellerna bör ha en liten soma och förgrenade processer, (F) låg konfluens och (G) redo för immunkemi. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kalcium tillströmning av live-cell flödescytometri
Detta protokoll möjliggör analys av P2X7 receptor funktion som en kalcium kanal i realtid. Kinetiken för receptor funktion, samt effekterna av olika agonister och antagonister, kan också bedömas. När plottas över tid, kalcium tillströmningen i de hippocampus och SVZ neurala stamceller var generellt liknande (figur 2A och figur 2B, respektive). Agonister (ATP eller BzATP) lades på 40 s-märket, som indikeras av den röda pilen. För ett kort ögonblick, tas röret bort från inspelningen punkt att lägga till den agonist, vilket resulterar i datapunkter noll. Detta möjliggör identifiering av tiden när agonist lades. BzATP aktiverar snabbt P2X7 receptorer, öppna kanalen ion och låta kalcium tillströmning, som binder till Fluo-8 och fluorescerar. ATP programmet resulterar i en mer gradvis kalcium tillströmning. Det har en lägre affinitet till P2X7 jämfört med BzATP och kommer också att resultera i G-protein-kopplade receptor aktiveringen, en långsammare signalväg som frigör kalcium från endoplasmatiska retiklet. Införandet av P2X7-antagonister A438079 och AZ10606120 (inga data anges) minskat kalcium inflödet i svar agonist ansökan.
Figur 2: Live-cell kalcium tillströmningen i neurala stamceller från hippocampus och SVZ. P2X7-receptorn kalcium kanal funktionen visades i (A) hippocampus och (B) SVZ-derived stamceller av förändringar i Fluo-8 fluorescens. Tillämpningen av den allmänna P2X-agonist ATP och P2X7 agonist BzATP resultatet i P2X7 jonkanaler öppning, vilket gör att kalcium tillströmning. Tillströmningen var blockerad med P2X7-specifika-hämmare A438079 eller AZ10606120 (inga data anges). F = fluorescens; F0 = fluorescens tidpunkt noll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Pore bildandet av live-cell flödescytometri
Transmembrana pore bildandet är en kanoniska funktion av P2X7-receptorer, resultat i makromolekyl utbyte, och kan leda till celldöd. Etidiumbromid+ är en stor molekyl (314 Da) undantagna från friska celler; dess upptag och efterföljande interkalation med DNA resulterar i fluorescerande utsläpp och kan användas för att bedöma förmågan hos P2X7 receptorer att bilda transmembrana porer. Efter applicering av agonister ATP (1 mM ATP) och BzATP (100 μM) på 40 s (indikeras av pilen), tid-löst flödescytometri fångar den etidiumbromid in cellerna i realtid (figur 3A). Denna effekt var försvagat av den P2X7-specifika hämmaren AZ10606120. Etidiumbromid bromid upptag analysen visar en funktionell P2X7-receptor C-terminus17 och är bra bevis för fullängds P2X7-receptoruttryck. ATP koncentration-respons analyser illustrerar effekterna av agonist koncentrationen på P2X7 pore bildas, med förändring i etidiumbromid bromid fluorescens över tiden (figur 3B). Agonist dos koncentration kurvor tillsammans med receptor-specifika hämmare ger starka bevis för receptor aktiveringen.
Figur 3: P2X7 transmembrana pore bildandet mätt med etidiumbromid upptag. Tillägg av etidiumbromid bromid ögonblicken innan förvärvet används för att mäta bildandet av P2X7 transmembrana porer. Höga koncentrationer av ATP och BzATP resultat i (A) P2X7 receptor por bildning, så etidiumbromid ange cellen. Den P2X7-hämmaren AZ10606120 dämpar detta fenomen och ger belägg för funktionella P2X7-receptorer. (B), ATP koncentration-respons analyser visat betydande pore formation på 500 μM och 1 mM men inte vid lägre koncentrationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fagocytos av live-cell flödescytometri
Vår grupp har tidigare visat att extracellulära ATP hämmar P2X7-medierad fagocytos av separera P2X7 C-terminus från cytoskelettet, specifikt, nonmuscle myosin IIA18,19. Denna metod expanderar på dessa fynd att Visa P2X7-receptorn inblandning i fagocytos av hippocampus och SVZ neurala stamceller celler i realtid (figur 4, ett exempel på Hippocampus fagocytos). Hämningslös fagocytos (kontroll) nivåer av 1 µm YG latex pärlor var etablerade som positiv kontroll. ATP hämmade fagocytos av YG pärlor i samma utsträckning som de ospecifik hämmare, nämligen PFA fixering och aktin polymerisation hämmare cytochalasin D, medan 5% serum avskaffat alla medfödda fagocytos20.
Figur 4: YG pärla upptag påvisa fagocytos kapacitet av neurala föräldraparets via P2X7 receptorer. YG pärla upptag av neurala stamceller är observerbar använder live-cell flödescytometri i realtid. Kontrollnivåer för fagocytos fastställs inledningsvis, och om antalet celler tillåter, bekräftade i slutet av körningen. Medverkan av P2X7 receptorer indikeras av hämning av fagocytos i närvaro av ATP, som detta dissocierar C-terminus från membran cytoskelettet, förhindra P2X7-medierad cytoskeletal omflyttningar. Tillämpningen av ATP blockerade fagocytos i samma utsträckning som användningen av ospecifik hämmare av fagocytos, inklusive paraformaldehyd (PFA) och cytochalasin D (CytD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för analys av P2X7 receptor funktion i neurala stamceller cellkulturer som härrör från de vuxna neurogena nischerna. De potentiella tillämpningarna för vuxna neurala stamceller celler sträcker sig från forskning till terapeutiska ändamål, och så metoden för kultur måste vara robust och reproducerbara. I området i närheten finns det flera viktiga aspekter i detta protokoll som kan påverka kvaliteten på den endpoint-kulturen. När bort från skallen, hjärnan bör inte tillåtas torka och dissektion bör utföras så snabbt som möjligt. Bestämt med hippocampus medför extra försiktighet vidtas för att ta bort blodkärl eller membranös vävnaden överlägsen progenitor cell avkastning. Processen dissociation och sönderdelning kan starkt påverka antalet kulor som erhållits i en kultur. agitera vävnaden under inkubationstiden med trypsin-EDTA kommer att resultera i en mer homogen lösning. Användning av en eld-polerat glas betesmark pipetten över en P1000 plast pipettspetsen rekommenderas att minska celldöd och förbättra den resulterande kulturen. Undvika overtriturating. Trots dessa försiktighetsåtgärder, förfarandet kan skapa en massa skräp i P0 kulturen, och för att undvika att förlora progenitorceller, tvätt eller utfodring kulturen bör undvikas tills kulorna har bildats.
Ett antal skillnader mellan den hippocampus och SVZ kulturer kommer att vara uppenbart på P0. Hippocampus kulturer ger färre sfärer, och dessa generellt följer. Använd en pipettspetsen att försiktigt lyfta av sfärernas för inledande passagen. Vidhäftande sfärer observerades inte i efterföljande passager. Olika märken av vävnadsodling kolvar kan orsaka sfärernas, speciellt Hippocampus sfärer, att följa och växa som kolonier på botten av skålen. Detta konstaterades för att förändra några nedströms resultat för detta protokoll inte men bör övervakas och konsekvens bör bibehållas där så är möjligt.
Tidigare metoder används för att mäta P2X7 receptor funktion, till exempel patch fastspänning för att spela in kalcium tillströmning, är tidskrävande och mödosam och kan endast ge information om en enskild cell. Detta protokoll presenterar en snabb och reproducerbar metod för att analysera alla tre huvudfunktioner av P2X7-receptorer med hjälp av en maskin. Tid-löst live-cell flödescytometri möjliggör analys av hela populationen och ger forskaren med information om kinetiken för kalcium tillströmning, pore bildandet eller fagocytisk funktion. Utöver detta kan flödescytometri enkelt användas som en metod för att bedöma markör uttrycksmönster och befolkningen analys baserat på cell storlek eller protein uttryck nivåer.
När de utför dessa experiment, kan i maximal kalcium tillströmning, etidiumbromid upptag eller fagocytos priser skillnader mellan repetitioner. För att minimera detta, sfär storlek, odlingsbetingelser och utfodring regim måste vara konsekvent som hälsan hos cellerna kommer att ha en betydande inverkan på resultaten. Tiden på is kan också påverka data, så se till att allt är beredda i förväg så att tiden på isen är minimal. Se till att kalcium indikator färgen laddningstid är konsekvent. En annan faktor som kan leda till stora inkonsekvenser i maximal kalcium inspelningar är variationen mellan ATP batchar. Beredning av ATP bestånd är avgörande, och användningen av olika satser för samma experiment bör undvikas. Det rekommenderas också att jämföra gamla och nya partier för att säkerställa ATP är konsekvent. Effektiviteten av P2X7-antagonister kan även cell-linje - och batch-beroende, så optimering av inkubationstider och koncentrationer kan krävas.
Det är värt att notera att kalcium tillströmning/efflux är en av de mest grundläggande och komplexa cellulära funktionerna och kan medlas av många receptorer. ATP-inducerad kalcium inflödet, som en klassisk mätning för P2X7 kanal/pore funktion, inte kanske exakt återger funktionen sant av P2X7-receptorer, som ATP kan också aktivera P2Y receptorer att släppa intracellulära kalcium. I det här fallet kanske barium en bättre cation att använda istället för kalcium som dess inflödet är enkelriktad16. För att särskilja bidraget från P2Y receptorer i kalcium tillströmning, kan förhållanden där 1 mM EDTA eller etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic acid (EGTA) läggs till K+ medium istället för CaCl2 användas i denna assay.
Detta protokoll kan också enkelt anpassas för att passa andra celltyper och kan vara användbar för att undersöka funktionen av alternativa ion kanal receptorer eller receptorer som deltar i fagocytos. Denna metod kan också anpassas till ett flöde flödescytometri maskin utan en tid modul. Som ett exempel, kan fagocytos analyser utföras där YG pärlor läggs 7 – 8 min före analysen av konventionell flödescytometri. Hålla cellerna vid 37 ° C och snurra dem kontinuerligt. Detta kommer inte att ge information i realtid men skillnader i den genomsnittliga slutliga fluorescensen kommer fortfarande informera forskaren angående funktionaliteten i P2X7-receptorer.
Intresset för P2X7-receptorer som en drog rikta21,22 eller även som en drog leverans route23,24 växer snabbt, och metoder för att studera denna gåtfulla receptor måste vara kontinuerligt anpassas och förbättras till underlätta dessa studier. Detta protokoll beskriver metoder som kan användas för att utforska P2X7 funktion i vuxen neurala stamceller, och förhoppningen är att uppnå en större förståelse av P2X7-receptorer i neurogen nischer kan leda till framsteg inom behandling av stroke och andra ischemiska skador.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Maria Kasherman och Xin Huang för deras bidrag till denna forskning. Detta arbete stöds av bidrag från Rebecca L. Cooper medicinsk forskningsstiftelsen att M.W., T.C.L. och M.L., och T.C.L. från de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) Australien (571100 och 1048082) och på Baxter Charitable Foundation ( Sydney, Australien). B.G. stöddes av den australiska Research Council (ARC) framtid Fellowship (FT120100581), NHMRC projektbidrag (1048082, 1061419 och 1120095) och den viktorianska regeringens operativa infrastrukturen stöd bidrag till Florey Institute. M.L. stöddes av en Charles D. Kelman, M.D. postdoktorala Award (2010) från internationella Retinal Research Foundation (USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
References
- Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
- Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
- Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
- Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
- Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
- Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
- Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
- Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
- Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
- Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
- Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
- Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
- Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
- Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
- Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
- Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
- Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
- Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
- Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).
