Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Abstract

Deeltje bijhouden op een videofragment en de achterste analyse van hun trajecten is tegenwoordig een gemeenschappelijke operatie in veel biologische studies. Met behulp van de analyse van de celmembraan receptor clusters als een model, presenteren we een gedetailleerd protocol voor deze afbeelding analyse taak met behulp van Fiji (ImageJ) en Matlab routines voor: 1) definiëren gebieden van belang en ontwerpen van maskers aangepast aan deze regio's; 2) bijhouden van de deeltjes in de fluorescentie microscopie video's; 3) analyseren de kenmerken van de verspreiding en de intensiteit van geselecteerde tracks. De kwantitatieve analyse van de coëfficiënten van de verspreiding, de soorten bewegingen en een clustergrootte verkregen door fluorescentie microscopie en beeldverwerking biedt een waardevol hulpmiddel om objectief vast deeltje dynamiek en de gevolgen van het wijzigen milieu-omstandigheden. In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de analyse van deze functies. De beschreven methode hier kunt niet alleen single-molecuul tracking detectie, maar ook automatiseert de schatting van de parameters voor de laterale verspreiding op het celmembraan, classificeert het type traject en het volledige analyse dus overwinnen stelt de problemen in het kwantificeren van de grootte van de plek over zijn gehele traject op de celmembraan.

Introduction

Membraaneiwitten ingebed in de lipide dubbelgelaagde zijn in continue beweging als gevolg van thermische diffusie. Hun dynamiek zijn essentieel voor het reguleren van de antwoorden van de cel, zoals Intermoleculaire interacties toestaan vorming van complexen die variëren in grootte van monomeren tot oligomeren en invloed hebben op de stabiliteit van complexen signalering. Het ophelderen van de mechanismen beheersen eiwit dynamiek is dus een nieuwe uitdaging in de celbiologie, vereist voor het begrijpen van signaaltransductie trajecten en omgaan met onverwachte cel.

Sommige optische methodes ontwikkeld om te studeren van deze interacties in levende cellen1. Daaronder staat de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, ontwikkeld in de vroege jaren 1980, de studie van moleculaire interacties op of vlakbij de celmembraan2. Studeren dynamische parameters membraan eiwit gevaar opleverende verkregen TIRF gegevens in levende cellen, is een enkel deeltje tracking methode (SPT) vereist. Hoewel verschillende algoritmen beschikbaar voor dit zijn, wij gebruiken momenteel die zijn gepubliceerd door Jaqaman et al.3 , die betrekking hebben op particle beweging heterogeniteit in een dichte deeltje veld door deeltjes tussen opeenvolgende frames om verbinding te maken met de resulterende track te koppelen segmenten in volledige trajecten (tijdelijke deeltje verdwijnen). De software vangt het deeltje samenvoegen en splitsen van dat resultaat van aggregatie en dissociatie gebeurtenissen3. Één van de uitvoergegevens van deze software is de detectie van de deeltjes langs het hele traject door hun X- en Y-posities in elk frame te definiëren.

Zodra de deeltjes worden geconstateerd, passen we verschillende algoritmen om te bepalen van de korte tijdsverschil diffusie coëfficiënt (D1-4)4,5. Door het Moment schalen Spectrum (MSS)6,7,8 analyse toe te passen of door het aanbrengen van de 'alpha'-waarde door aanpassing van de verplaatsing (MSD) van de gemiddelde plein aan de kromme9, indelen we ook de deeltjes volgens het type traject.

Analyse van plek intensiteit in fluorescentie beelden is een gedeelde doelstelling voor wetenschappers in het veld10,11. De meest voorkomende algoritme is het zogenaamde aantal en helderheid. Deze methode toch staat geen detectie van de juiste frame-voor-frame intensiteit in deeltjes in de mobiele Fractie. We hebben dus een nieuw algoritme te evalueren deze deeltje intensiteiten frame-voor-frame en te bepalen wat de status van hun aggregatie gegenereerd. Zodra de coördinaten van elk deeltje worden gedetecteerd met behulp van U-Track2 software3, definiëren we de intensiteit in elk frame over het volledige traject, ook rekening houdend met de celachtergrond in elk frame. Deze software biedt verschillende mogelijkheden om te bepalen van de intensiteit van de plek en de achtergrond van de cel en berekent op basis van bekende monomeer en dimeric eiwitten als verwijzingen, het geschatte aantal eiwitten in het deeltje ontdekt (clustergrootte).

In dit artikel beschrijven we een zorgvuldige gids voor het uitvoeren van deze drie stappen: 1) opsporen en volgen enkele deeltjes langs een video van fluorescentie microscopie met behulp van U-track; 2) analyseren de momentane diffusie coëfficiënt (D1-4) van die deeltjes en het soort verkeer (beperkt, vrije of gerichte) van deeltjes met lange trajecten door MSS begint; 3) het meten van de plek intensiteit langs de video gecorrigeerd door de fluorescentie van de geschatte achtergrond voor elke vlek. Hierdoor cluster grootte schatting en identificatie van de photobleaching stappen.

Het gebruik van dit protocol niet vereist gespecialiseerde vaardigheden en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met celcultuur, stroom cytometry en microscopie faciliteiten. Het protocol gebruikt ImageJ of Fiji (een verdeling van ImageJ12), U-track3en enkele ad hoc gemaakt routines (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track en ad hoc routines overreden Matlab die kan worden geïnstalleerd in elke compatibele computer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van biologische monsters

  1. Groeien Jurkat cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS, NaPyr en L-glutamine (volledige RPMI). Electroporate Jurkat cellen (20 x 106 cellen/400 µL van RPMI 1640 met 10% FCS) met een monomeer GFP-gelabelde chemokine receptor vector (CXCR4-AcGFP, 20 μg) dat de detectie met behulp van fluorescentie microscopie.
    Opmerking: Het is mogelijk om te gebruiken andere monomeer fluorescerende eiwitten zoals mCherry, mScarlet, enz.
  2. 24 uur na de transfectie analyseren cellen in een stroom cytometer om zowel de levensvatbaarheid van de cellen en de CXCR4-AcGFP expressie.
  3. Selecteer de cellen uiten van lage CXCR4-AcGFP door de cel sorteren van GFPlage positieve cellen (Figuur 1), zoals lage expressie van transfected receptor is vereist in TIRFM experimenten met het oog op één deeltje volgen voor tracering individuele trajecten9.
  4. Het aantal receptoren in het celoppervlak te kwantificeren.
    Opmerking: Als een voorbeeld13, ~ 8500-22.000 AcGFP-geëtiketteerden receptoren/cel, komen overeen met ~ 2-4.5 deeltjes/μm2.
  5. Resuspendeer gesorteerd op cellen in volledige RPMI en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Centrifugeer cellen (300 x g, 5 min), en resuspended hen in TIRF buffer (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7.3).
    1. De plaat op 35 mm glassbottom microwell gerechten (2-3 x 105 cel/schotel) bekleed met fibronectine (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) in de aanwezigheid of afwezigheid van passende ligand (dat wil zeggen, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incubeer de cellen (20 min bij 37 ° C, 5% CO2) vóór Beeldacquisitie.
  6. Uitvoeren van experimenten met behulp van een Microscoop TIRF, uitgerust met een EM-CCD-camera, een 100 x olie-immersie doelstelling (HCX PL APO 100 x / 1,46 nb) en een 488 nm diodelaser. De microscoop kan temperatuurregeling en incubatie met CO2. Zoek en focus van de cellen met de grove en fijne focus knoppen, met heldere veld te minimaliseren photobleaching effecten. Voor fijne focus aanpassing in TIRF modus gebruiken een laser lage intensiteit, onvoldoende voor single-deeltje detectie of ertoe photobleaching effecten (5% laser macht, 28 μW).
  7. Verwerven van films (beeldsequenties) van ongeveer 50 s minimaliseren van het tijdsinterval tussen de frames. Penetratie van het vluchtig veld moet 70-90 nm van diepte. Sla de verworven films voor elke experimentele voorwaarde als ".lif" (video.lif).
    Opmerking: Films in de beschreven voorbeeld werden verworven op 49% op laser kracht (2 mW) met een belichtingstijd van 90 ms en een tijdsinterval van 98 ms, voor 49 s (500 frames). Penetratie van de geselecteerde vluchtig Golf was 90 nm.

2. selectie van beelden en creëren van maskers

  1. Voor elke experimentele voorwaarde (video.lif), maak een nieuwe map (VideoName) die verschillende mappen voor elke reeks moet bevatten. Elke map bevat een "videoSeq"-map voor de videobeelden en een "resultaten" map voor de resultaten van de analyse. Zorg ervoor dat de bestandsstructuur op dit moment de volgende is:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/videoSeq
    VideoName/Series1/resultaten
    Opmerking: Van de Microscoop worden bestanden van de verschillende .lif verkregen met verschillende video's voor elke behandeling aandoening (d.w.z. FN, FN + SDF). "video.lif" komt overeen met het videobestand input.lif met alle TIRF films acquisities (serie) uitgevoerd met de Microscoop. "videoSeq" map bevat de 500 frames van de film dat we analyseren. De "resultaten"-map bevat alle bestanden die voortvloeien uit de analyse uitgevoerd. Nauwkeurige nomenclatuur en lokalisatie van de verschillende mappen zijn essentieel voor het correct functioneren van de algoritmen. Namen in het vet in de bovenstaande lijst worden opgelost (dat wil zeggen, ze moeten op deze manier worden genoemd, omdat deze de namen gezocht door de scripts). Namen niet in vet kunnen aangepast aan het experiment uitgevoerd.
  2. Open de video van de TIRFM (.lif-bestand) met Fiji of ImageJ door slepen en neerzetten het bestand op de menubalk van Fiji en klik op OK om de lif-bestand met behulp van BioFormats (aanvullende figuur 1) te importeren.
  3. Selecteer de reeks wilt verwerken en klik op OK (aanvullende figuur 2A). Als u een masker voor de analyse van deze video, importeren ook een multikanaalafbeelding met de verschillende chromophores (in het voorbeeld wordt reeks 1 is de multikanaalafbeelding en Series 2 de bijbehorende video). De video (en de multikanaalafbeelding) moeten openen als een stapel ImageJ. In het voorbeeld (aanvullende figuur 2B), het beeld is aan de linkerkant en de video is aan de rechterkant.
    Opmerking: Als de oprichting van een masker voor de video is niet nodig, gaat u naar stap 2.5.
  4. Een masker maken. Maak een enkele afbeelding met de kanalen nuttig voor het ontwerp van het masker. In dit geval zijn de interessante kanalen de rode, groene en grijze.
    1. De kanalen van de multikanaalafbeelding (aanvullende figuur 3A) splitsen: Selecteer afbeelding in de bar menu en klik kleur | Kanalen splitsen. De verschillende kanalen weergegeven als afzonderlijke afbeeldingen (aanvullende figuur 3B).
    2. Samenvoegen nogmaals de drie kanalen in een enkel beeld (aanvullende figuur 4A): Selecteer afbeelding in de bar menu en selecteer kleur | Kanalen samenvoegen. Selecteer de daartoe geëigende kanalen en druk op OK (aanvullende figuur 4B). Een nieuwe niet-gestapeld beeld zal worden gegenereerd (aanvullende figuur 4C).
    3. De twee vensters synchroniseren met behulp van het hulpprogramma Windows synchroniseren (aanvullende figuur 5A): Selecteer analyseren in de bar menu | Tools | Synchroniseren van Windows. Een nieuw venster met de synchroniseren afbeelding mogelijkheden getoond (aanvullende figuur 5B).
    4. Met de twee vensters gesynchroniseerd (alleen de video als er geen bijbehorende multikanaalafbeelding), kan dezelfde regio in beide vensters worden bijgesneden. De regio van belang met het rechthoekig gereedschap voor ImageJ zwevende menu tekenen. Selecteer de afbeelding in de bar menu en selecteer gewas (aanvullende figuur 6A). De twee bijgesneden beelden zullen tonen individueel (aanvullende figuur 6B).
    5. Unsynchronize beide vensters (aanvullende figuur 6B) door te drukken op de knop Unsynchronize alles in Sync Windows manager.
  5. Als een masker niet in stap 2.4 aangemaakt, tekent u de regio van belang met het rechthoekig gereedschap voor ImageJ zwevende menu.
  6. De video opslaan als een reeks afbeeldingen in de map videoSeq onder de bijbehorende video directory (aanvullende figuur 7A): Selecteer bestand in de balk menu en klik Opslaan als | Image volgorde... hernoemen van de labels voor het videofragment als video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (aanvullende figuur 7B): hernoemen als video in het vak naam en klik op OK. De volgorde moet zijn alleen in de directory worden met succes gebruikt door U-track.
    Opmerking: Als niet het ontwerpen van een masker voor de video, gaat u naar stap 2.8.
  7. Het ontwerp van een masker. Selecteer de multikanaalafbeelding en open de segmentatie redacteur plugin (aanvullende figuur 8A): Plugins in de bar Selecteer menu en selecteer segmentatie | De redacteur van de segmentatie. Toevoegen en de naam van de etiketten van de segmentatie desgewenst wijzigen door rechts te klikken op de etiketten van de segmentatie editor (aanvullende figuur 8B, C).
    1. Kies het juiste gereedschap in ImageJ zwevende menu (hier, gebruik freehand), selecteer een label (groen) en ontwerpen eerst de ultraperifere masker (aanvullende figuur 9A). Zodra ontworpen, wordt druk de + in de optie van de selectie van samengestelde venster, en de geselecteerde masker getoond op de kijker (aanvullende figuur 9A). Herhaal deze stap met volgende etiketten (interieur, in het rood) (aanvullende figuur 9B).
      Opmerking: Na het ontwerpen van het masker voor de labels groen en interieur, zal het exterieur masker bezetten de rest van de afbeelding.
    2. Maskers zijn gecodeerd in de afbeelding als regio's 0, 1, 2... de volgorde van de labels in het RGB-etiketten-venster. Wanneer alle maskers voor de verschillende labels zijn ontworpen, sla het masker met dezelfde naam als de video, met de naam mask.tif (aanvullende figuur 9C): Selecteer bestand in de balk menu en selecteer Opslaan als | TIFF....
      Opmerking: De geselecteerde maskers zal worden gebruikt in de berekening van de coëfficiënten van de verspreiding en de indeling van de trajecten (zie stap 4.2).
  8. Controleer dat de bestandsstructuur op dit moment de volgende is:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/resultaten
    Opmerking: De mask.tif is een beeld met het masker als ontworpen in stappen 2.4 en 2.7. De video*.tiff is de video, zoals opgeslagen in stap 2.6. Zoals hierboven, de namen in vet de bovenstaande lijst worden opgelost, dat wil zeggen, ze moeten op deze manier worden genoemd, omdat deze de namen gezocht door de scripts. Namen niet in vet kunnen aangepast aan het experiment uitgevoerd.

3. het bijhouden van de deeltjes

  1. Het bijhouden van alle deeltjes gezien in de geselecteerde video's met behulp van U-track.
  2. Matlab open en U-track directory toevoegen aan het pad met behulp van ingesteld pad | Voeg toe met submappen optie in het menu. Het pad zodanig opslaan dat in de toekomst de executies van Matlab U-track is in het pad. De padinstelling van dit moet worden gedaan slechts eenmaal.
  3. Ga het werk folder naar de map met de serie te worden geanalyseerd. Beroep doen op U-track door te typen in de console (aanvullende figuur 10) movieSelectorGUI en druk op enter. Het venster film selectie zal worden geopend (aanvullende figuur 11).
  4. Druk op de knop Nieuw film en de film editie -venster verschijnt (aanvullende figuur 11).
  5. Druk op Add kanaal om te kiezen van de map met de video (VideoName/Series1/video) en vul de film informatie parameters. Stel de output-map voor de resultaten van U-track op resultaten (videoName/Series1/resultaten).
    Opmerking: De parameters van de film informatie kunnen worden verkregen van de Microscoop en de algemene inkoopvoorwaarden.
  6. Druk op de Geavanceerde Kanaalinstellingen en vul de parameters die betrekking hebben op de acquisitie. Kijk de waarden van de parameters in het voorbeeld (aanvullende figuur 11C).
  7. Druk op Opslaan in het venster Geavanceerde Kanaalinstellingen en Opslaan in het venster film editie . Het programma zal vragen om bevestiging van het schrijven van het bestand met de naam movieData.mat voor de map resultaten . Bevestigen.
  8. Na het maken van de film, druk op Doorgaan in het venster film selectie. U-track zal vragen over het type object te analyseren. Kies Single-deeltjes (aanvullende figuur 12). De Control panel venster zal verschijnen (aanvullende figuur 13A).
    1. Selecteer de eerste stap stap 1: detectie en drukt u op instelling. Het venster Instelling Gaussian mengsel-Model passend verschijnt (aanvullende figuur 13B). In het voorbeeld is "Alpha waarde voor vergelijking met lokale achtergrond" ingesteld op 0,001 en "Rolling-venster tijd gemiddeld" tot en met 3 (aanvullende figuur 13B).
    2. Druk op toepassen in het venster Instellingen Gaussian mengsel-Model passend en uitgevoerd in het Configuratiescherm. Met de configuratie in aanvullende figuur 13loopt alleen de detectie stap. Deze stap duurt een paar minuten van (2-5). Het resultaat controleren door op de knop van het resultaat van stap 1 (detectie, aanvullende figuur 14).
      Opmerking: Zoals hierboven vermeld, bevat de film rode cirkels op de gedetecteerde deeltjes. Als geen rode cirkel wordt weergegeven, is het vervolgens heeft dat deze stap niet correct gewerkt.
  9. De identificatie van tracks, dat wil zeggen, de deeltjes ontdekt in de vorige stap in tracks die zich uitstrekken over meerdere frames samenvoegen uit te voeren. Dit is de stap 2: Tracking van U-track waarvan de instellingen worden vastgesteld moeten zoals in Aanvullende figuur 15A-C. De stap 2 kosten functie instellingen voor frame-voor-frame koppelen en Gap sluiten, samenvoegen en splitsen in het voorbeeld worden weergegeven in aanvullende figuur 15B en C, respectievelijk.
  10. Na het instellen van de parameters voor stap 2, drukt u op uitvoeren in het Configuratiescherm en alleen stap 2 loopt (aanvullende figuur 16).
  11. Track analyses, stap 3 uit te voeren. De instellingen definiëren zoals in aanvullende figuur 17 (rechtervenster). Druk op toepassen in het deelvenster of instelling-bewegingsanalyse, uitgevoerd in de Control Panel-U-Track. Deze stap duurt een paar seconden.
  12. Controleer of met de knop van het resultaat van stap 3 dat het proces juist alle tracks heeft geïdentificeerd. Klik op Toon nummer van het venster Filmopties voor te doen, en controleren frame voor frame dat elke track is geweest correct geïdentificeerd (aanvullende figuur 18). Handmatig aantekeningen die deeltjes die niet waar deeltjes.
    Opmerking: Als deze handmatige selectie niet gebeurt, kan een zwakkere automatische selectie worden uitgevoerd later wanneer de diffusie-coëfficiënt is berekend (zie stap 4).

4. berekening van de coëfficiënten van de verspreiding en de indeling van de trajecten

  1. Zorg ervoor dat alle scripts worden aangeroepen vanuit de map van de video (in het voorbeeld, VideoName/Serie1) de analyse wordt uitgevoerd.
  2. Lees alle de trajecten to compute de coëfficiënten van de diffusie van afgifte in de Matlab console het commando: trajectories=readTrajectories(0.1), waar 0.1 de tijd in seconden tussen twee opeenvolgende frames (tijdsinterval is, weergegeven in het deelvenster film Informatie, aanvullende figuur 11).
  3. Uitsluiten trajecten overeenkomt met onjuist geïdentificeerd vlekken/trajecten. Geef een lijst van de plaatsen om uit te sluiten. Bijvoorbeeld voor het uitsluiten van vlekken 4, 5 en 28, typt: trajecten = readTrajectories (0.1, [4, 5, 28]).
  4. Bereken de momentane diffusie coëfficiënten voor elke één van de tracks van deze cel. In dit geval het berekenen van de coëfficiënt van de verspreiding voor een vertraging = 4, genaamd D1-4. Daarvoor, in de Matlab-console het commando: D = calculateDiffusion (trajecten, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha') waar trajecten zijn de trajecten verkregen in stap 3, 113.88e-3 is de pixelgrootte van de verworven beelden in micron, 0.0015 is een bovengrens voor de coëfficiënten van de diffusie van immobiel deeltjes gemeten in µm2/s, en 'alpha' is het gepaste model zoals hieronder uitgelegd.
    Opmerking: Bij het gebruik van een snellere camera en de noodzaak meer frames voor het berekenen van de diffusie-parameter verhogen, bijvoorbeeld tot 20, door D = calculateDiffusion (trajecten, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', '', 20). De parameter string vóór 20, in het voorbeeld hierboven, '', is het achtervoegsel toegevoegd aan de output bestanden. Dit achtervoegsel kan worden gebruikt om te onderscheiden van de verschillende analyses.
  5. Passen de MSD met een verschillende functie door het aanroepen van de functie van de calculateDiffusion weer met een verschillende montage-modus ('beperkt', 'gratis' of 'regie'). In dit voorbeeld 'beperkt': D = calculateDiffusion (trajecten, 113.88e-3, 0.0015, 'beperkt').
  6. De resultaten van de montage voor de gerichte model, behalen zoals in aanvullende figuur 20.
  7. Het ontleden van de trajecten in korte en lange trajecten. Gebruik van de opdracht: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) waar 50 is de minimale lengte in frames van een baan beschouwd lang (in het voorbeeld).
  8. Korte trajecten met dezelfde fitting procedure in stap 4.3 beschreven studie: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'regie', 'Korte'). Korte en afwijkende trajecten met de opdracht analyseren: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Korte').
  9. Analyseren van lange trajecten te classificeren van het type beweging door hun Moment schalen Spectrum (MSS)7. De opdracht: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'Long') toont de analyse in scherm en genereert een bestand genaamd trajectoryClassification < achtervoegsel > .txt in de map results\TrackingPackage\tracks.

5. berekening van de Cluster Ssize door de dichtheid van de deeltjes

Opmerking: Zorg ervoor dat alle scripts worden aangeroepen vanuit de map van de video (in het voorbeeld, VideoName/Serie1) de analyse wordt uitgevoerd.

  1. Het analyseren van de intensiteit van elk deeltje langs hun traject. Daarvoor, het script te starten door te typen in de console van Matlab: analyzeSpotIntensities die als neemt invoer de trajecten berekend door U-track in de eerste sectie. In zijn meest elementaire vorm, bel gewoon het script zonder een van de argumenten van de folder van de video analyse wordt uitgevoerd (in het voorbeeld, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Dit fundamentele probleem op verschillende manieren configureren door middel van argumenten aan het script als in: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, waarde1, ' Arg2´, waarde2,...). Geldige argumenten met de bijbehorende variabele waarden ('ArgN´, ValueN) worden vermeld.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Analyseren van de intensiteit van de fluorescentie met behulp van de spotRadius van 1 pixel (standaard) die correspondeert met een patch van formaat 3 x 3 gecentreerd op de plek ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Opmerking: Kies voor een patch van 5 x 5 gecentreerd op de plek, een spotRadius van 2, enz.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Als dit argument is opgegeven, de waarde 1 (waar), analyseren alleen de trajecten die in het eerste frame van de video beginnen. Dit is handig voor het analyseren van beelden van het besturingselement (standaard 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Als dit argument is ingesteld op 0 (ONWAAR), dan blijven de coördinaat van de plek in het eerste frame voor alle frames (dit is handig voor immobiel vlekken). Als het argument is ingesteld op 1 (standaard 1, true), wordt vervolgens de plek bijgehouden langs de video na de coördinaten berekend door U-track.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Omvatten het traject aantal die trajecten uitgesloten in stap 4.3 (in het voorbeeld 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Als dit argument is ingesteld op 1 (waar), vervolgens analyseren de intensiteit in de patch aan het einde van de video (zelfs als de baan eerder stopt). De coördinaat van de spot is de laatste coördinaat in het traject (als trackTrajectory true is) of de eerste coördinaat in het traject (als trackTrajectory ingesteld op false is). Dit argument is onwaar (0) standaard.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Als deze parameter is ingesteld, dan juist de ruwe fluorescentie gemeten op elke plek van de raming van de fluorescentie van de achtergrond voor die plek (zie hieronder). Dit argument is true (1), standaard.
    7. ('meanLength´, framenummer)
      Als deze parameter is ingesteld, dan is de plek van de gemiddelde intensiteit wordt gemeten aan de aangegeven lengte. 'MeanLength', 20 voor het meten van de gemiddelde plek intensiteit bij de eerste 20 frames instellen Als het argument is niet ingesteld, wordt dan de plek intensiteit berekend op het hele traject (standaard, volledige lengte).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Stel deze parameter in als 1 (standaard 0, false), kunnen worden uitgezet op het profiel van de intensiteit langs de verschillende frames, alsmede hun achtergrond.
      Opmerking: Deze percelen zijn zeer nuttig om te identificeren photobleaching zoals aangegeven in de aanvullende figuur 21. Voor elk pad analyseert de routine automatisch als het is mogelijk dat er photobleaching is geweest. Dit wordt gedaan door het vergelijken van de intensiteitswaarden met een Student t in de eerste en laatste N frames langs het pad. Standaard is N 10, maar deze waarde kan worden gewijzigd via het argument ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, waarde)
      Stel deze parameter om te bepalen van de achtergrond van elke vlek. Dit kan gebeuren op verschillende manieren, en die een te gebruiken kan worden geselecteerde veranderende de "waarde":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Gebruik deze waarde om het handmatig identificeren de achtergrond voor de hele video. Toestaan dat 8 punten in het eerste frame van de video selecteren. Een patch rond deze punten langs de hele video wordt geanalyseerd en de 95% kwantiel van alle deze intensiteiten wordt gekozen als de intensiteit van de achtergrond voor alle spots.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Gebruik deze waarde om de achtergrond voor elk frame handmatig te identificeren. Kies 8 punten voor elke plek en elk frame. Dit is een tijdrovende klus maar het veel controle geeft aan de gebruiker. De 95% kwantiel van de intensiteit in deze patches is gekozen als de intensiteit van de achtergrond voor deze plek in dit frame.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Gebruik deze waarde voor de berekening van de achtergrond van elke plek uit 8 punten zich in een cirkel rond de plek met een straal gecontroleerd door het argument geschat ' backgroundRadius´ (standaard, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Gebruik deze waarde voor de berekening van de achtergrond voor elk frame door eerst het lokaliseren van de cel in de video en vervolgens analyseren van de intensiteiten van de cel in elk frame (aanvullende figuur 22).
        Opmerking: De achtergrond is gekozen als de grijze waarde op een bepaalde kwantiel van deze verdeling (standaard 0,5 (= 50%), hoewel deze parameter kan worden gecontroleerd door middel van het argument ' backgroundPercentile´, deze waarde kan hoger worden ingesteld, bijvoorbeeld 0,9 (= 90%) Als willen allermeest naar de cel die moet worden beschouwd als achtergrond. Om te helpen bij de identificatie van de cel, geven de waarde van de maximale achtergrond verwacht langs de frames met behulp van het argument ' maxBackground´ (bijvoorbeeld, in al de geanalyseerde video's, de achtergrond-waarde normaal nooit overstijgt 6000)13. Standaard is deze optie ingesteld op 0, wat betekent dat deze hulp niet standaard wordt gebruikt. Zie die is het opsporen van de cel en het gebied geselecteerd voor de schatting van de achtergrond door het argument ' showImages´ op 1 (halte de uitvoering op elk gewenst moment door te drukken op CTRL-C).
  2. Verzamel de diffusie en intensiteit voor alle trajecten die zijn berekend in de stappen 4 en 5.1, respectievelijk, op basis van gatherDiffusion.AndIntensity (). Verzamel alleen de diffusie en intensiteit voor korte trajecten. Om te doen, gebruik de achtervoegsels gebruikt in stap 4.7 en typ: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) waar ' Short´ is het achtervoegsel gebruikt in stap 4.7.
  3. Verzamelen van de Moment Spectrum schaal en de informationby intensiteit te typen: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') waar 'Lang' het achtervoegsel in stap 4.7 gebruikt wordt. Een samenvatting van alle bestanden gegenereerd met behulp van dit protocol is afgebeeld in Figuur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gebruik van dit protocol maakt het geautomatiseerde volgen van deeltjes ontdekt in fluorescentie microscopie films en de analyse van hun dynamische kenmerken. In eerste instantie zijn cellen transfected met de fluorescently-coupled eiwit worden bijgehouden. Het passende niveau van receptoren presenteert op het celoppervlak waarmee dat SPT wordt verkregen door de cel sorteren (Figuur 1). Geselecteerde cellen worden geanalyseerd door TIRF microscopie die video's worden gegenereerd in een indeling die kan worden bestudeerd met de hulpprogramma's beschreven in dit protocol (aanvullende Video 1).

De video's gegenereerd kunnen niet rechtstreeks worden geanalyseerd, en onafhankelijke frames van elke video zijn vereist. Het gebruik van ImageJ genereert bestanden die kunnen worden geïnterpreteerd met behulp van Matlab software zoals videoframes in TIFF formaat of maskers. U-track de deeltjes in de geselecteerde video gezien worden bijgehouden en wordt de informatie opgeslagen in Matlab (.mat) bestanden (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), Zie Figuur 2.

Zoals blijkt uit Figuur 2, de berekening van de coëfficiënten van de verspreiding en de classificatie van trajecten opdrachten, genereert verschillende bestanden (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, enz). De informatie in deze bestanden worden best beheerd met behulp van Excel en prisma software. Informatie die kan worden verkregen uit deze analyse omvat:

  1. Percentage van immobiel plekken. U kunt gebruiken als referentie van immobiel deeltjes: de 95% percentiel van D1-4 verkregen waarden (1) uit één deeltjes in vaste cellen en/of (2) van gezuiverde fluorescerende eiwit gekoppeld aan de coverslips (figuur 3A).
  2. Percentage van lange trajecten (> 50 frames) (figuur 3B).
  3. Type verkeer van de lange trajecten: geregisseerd, gratis, beperkt (Figuur 3 c).
  4. Diffusie coëfficiënt (D1-4) van mobiele deeltjes in cellen behandeld met verschillende stimulans (figuur 4A).

De stap 5 van het protocol analyseert de intensiteiten van elk deeltje langs het traject. Het script analyzeSpotIntensities worden afgedrukt op het scherm alle informatie geanalyseerd. Voor elke plek en frame, het script toont de coördinaat van de plek in dat frame (x, y) in pixel eenheden, de schatting van de achtergrond fluorescentie (k0), de ruwe plek intensiteit in de patch van 3 x 3, de gecorrigeerde intensiteit (berekend als de rauwe intensiteit min haar achtergrond), de maximale waarde van intensiteit waargenomen in de patch, en het nummer van de regio binnen het masker waar deze plek ligt bij dit frame. Een voorbeeld van het soort productie is

ter plaatse = 43 frame = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Al deze informatie wordt opgeslagen in een logbestand (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) en een tabel die kan worden gelezen vanuit Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Na het analyseren van elke vlek, drukt het script de gemiddelde intensiteit langs het traject en de majoritarian regio binnen het masker

ter plaatse = 43
meanCorrectedSpotIntensity langs frames = 4762.303
majoritarian regio = 3

Deze informatie wordt opgeslagen in het logboekbestand hierboven en een tabel die kan worden gelezen uit een werkblad (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Als voorbeeld, gemiddelde plek intensiteiten (msi) voor elk deeltje langs hun traject in cellen gestimuleerd met verschillende voorwaarden is afgebeeld in figuur 4B. Nu kunnen we deze informatie gebruiken naar schatting ongeveer de grootte van het fluorescerende cluster. Als een dribbels gemiddelde gecorrigeerde intensiteit is gerelateerd aan het aantal fluorescente proteïnen aanwezig op deze plek, en de fluorescentie van een monomeer kan worden gemeten door een soortgelijk maar onafhankelijke experiment, het aantal receptoren per deeltje direct te berekenen. De frequentieverdeling van receptor nummer per deeltje met behulp van referentienummers van de intensiteit van het monomeer eiwit uitgedrukt in dezelfde cellen wordt weergegeven in figuur 4C.

De diffusie van het verzamelen en intensiteit opdracht twee bestanden maken: één genaamd diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txten een andere genaamd log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt in de directory resultaten / TrackingPackage/tracks. Beide bestanden bevatten 1) de vlek index, 2) de diffusie-coëfficiënt, 3) de intensiteit en 4) het nummer van de regio binnen het masker. Deze bestanden kunnen worden gelezen uit een werkblad.

Ook de baan verzamelen de opdracht indeling en intensiteit zal maken twee bestanden één genaamd trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt en een andere log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt in de Directory resultaten/TrackingPackage/tracks. De eerste bevat 1) de vlek index, 2) het type verkeer, 3) de spot eerste moment, 4) de intensiteit, 5) D1-4 en 6) het nummer van de regio binnen het masker. Dit bestand kan worden gelezen vanuit Excel.

Een samenvatting van alle bestanden gegenereerd met behulp van dit protocol is afgebeeld in Figuur 2. Andere analyse die kan worden uitgevoerd met behulp van dit protocol omvat een vergelijking van de dynamische parameters van kleine vs grotere vlekken, d.w.z. monomeren vs oligomeren, variaties op deze dynamische parameters geïnduceerd door liganden, remmers, membraan samenstelling, wijziging van signalering van trajecten, enz. Een volledige analyse van CXCR4 gedrag in reactie op de ligand CXCL12 onder verschillende experimentele omstandigheden werd uitgevoerd met behulp van dit protocol13.

Figure 1
Figuur 1 : Cel sorteren. Expressie van GFP in Jurkat cellen transfected met CXCR4-AcGFP voor en na de cel sorteren. Cel uiting van lage niveaus van GFP (GFPlage) zijn geselecteerd en gebruikt voor TIRF experimenten.

Figure 2
Figuur 2 : Samenvatting van de gegenereerde bestanden. De figuur toont alle bestanden die zijn gegenereerd met de Matlab-routine beschreven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Classificatie gevaar opleverende. Nummer van de verschillende soorten trajecten overeenkomt met cellen met verschillende stimuli behandeld. (A) Percentage van immobiel spots, (B) percentage van lange trajecten en (C) type verkeer van de lange trajecten.

Figure 4
Figuur 4 : Diffusie coëfficiënt, gemiddelde plek intensiteiten en aantal receptoren per deeltje. (A) distributie van de waarden van de coëfficiënten (D1-4) korte diffusie voor elke plek in reactie op verschillende stimuli (I, II, II en IV). Rode lijn geeft de gemiddelde waarde voor D1-4. (B) gemiddelde plek intensiteiten (msi)-waarden voor elke vlek langs de eerste 20 frames in reactie op verschillende stimuli (I, II, II en IV). Rode lijn geeft de intensiteitswaarde van de gemiddelde (SD). (C) Percentage van receptoren/deeltje als uitgepakte van intensiteit distributie van de individuele deeltjes, nemen als bin breedte de intensiteitswaarde monomeer eiwit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: Openen van een TIRFM bestand in Fiji of ImageJ. Opties die worden weergegeven in het venster van de Bio-formaten bij slepen en neerzetten van een video .lif. Klik hier om te downloaden van de figuur. 

Aanvullende figuur 2: Selecteer serie. Foto's presenteren in de video van de .lif. (A) venster waarmee de selectie van de serie worden analyseren, met inbegrip van meerkanaals beelden. (B) resultaat voorbeeld van serie selectie, met inbegrip van multikanaalafbeelding (links) en overeenkomstige video (rechts). Klik hier om te downloaden van de figuur. 

Aanvullende figuur 3: Kanalen splitsen. (A) venster vastleggen van de ImageJ opdrachten die nodig zijn voor het splitsen van de kanalen van een multikanaalafbeelding en (B) resultaat voorbeeld van het kanaal splitsen. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 4: Kanalen verenigen. (A) het samenvoegen van de verschillende kanalen in een enkel beeld. (B) kanaal selectie voor de samenvoeging. (C) resultaat voorbeeld van de samenvoegbewerking kanaal. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 5: Synchroniseren van windows. (A) lokalisatie in het ImageJ menu van de opdrachten die nodig zijn voor beeld synchronisatie en het resulterende venster (B). Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 6: Selecteer de regio van belang. (A) selectie van het venster van belang met behulp van de rechthoekige selectietool en (B) resultaat van het gewas beeld. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 7: De video opslaan. Sla de regio van belang als een reeks afbeeldingen, en parameters voor het opslaan als reeks afbeeldingsvenster. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 8: Segmentatie. (A) Open de segmentatie redacteur plugin in de ImageJ het plugins menu. (B) etiketten/materialen voor de segmentatie toevoegen. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 9: Masker ontwerp. (A) selectie van de juiste etiketten en de definitie van het groene masker. (B) selectie van het rode masker. Voorbeeld van twee maskers overeenkomt met twee labels. (C) de maskers opslaan als een TIFF-bestand. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 10: MATLAB werkdirectory. Selectie van de juiste directory met reeksen te analyseren. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 11: U-track hoofdmenu. (A) film selectie, (B) film editie en (C) channel instellingen menu's. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 12: Selecteer het type object dat u wilt bijhouden. Selecteer bijhouden van enkele deeltjes. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 13: Detectie van deeltjes. (A) U-track, het Configuratiescherm. (B) voorbeeld van instellingen voor de detectie van deeltjes. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 14: Voorbeeld van de resultaten voor de detectie van de particle. Verschillende vensters waarin film optiemenu, een menu van de viewer en de film. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 15: Tracking menu. Voorbeeld van de instellingen. (A) Tracking, (B) instelling - frame naar frame koppelen en (C) kloof sluiten, samenvoegen en splitsen van menu's. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 16: Voorbeeld van de resultaten van de particle volgen. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 17: Analyse Trackmenu. Voorbeeld van de instellingen. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 18: Verificatie van de analyse van de track. Scherm weergegeven na track analyse, met inbegrip van een video-venster toont de deeltjes ontdekt en hun overeenkomstige tracks. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 19: Berekening van de coëfficiënten van de verspreiding. Histogrammen van de diffusie-coëfficiënten berekend (links) en het gemiddelde kwadraat verplaatsing (MSD, rechts). Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 20: Berekening van de coëfficiënten van de diffusie met inbegrip van de montage van de verschillende modi. Histogrammen van de diffusie-coëfficiënten berekend (links) en het gemiddelde kwadraat verplaatsing (MSD, rechts) voor het beperkte model. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 21: Intensiteit profielen. Voorbeeld van de intensiteit van de plek langs de baan (blauwe lijn) en de achtergrond (rode lijn). Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende figuur 22: Achtergrond voor elk frame. Links: Cel voorbeeldafbeelding. Midden: Automatisch gedetecteerd cel. Rechts: Gebied automatisch geselecteerd als achtergrond. Klik hier om te downloaden van de figuur.

Aanvullende Video 1: Voorbeeld van een typische TIRF videomicroscopie toont de aanwezigheid van deeltjes met verschillende intensiteiten en soorten bewegingen. Klik hier om de video te downloaden.

Aanvullend materiaal 1: Bestanden met alle protocol scripts werkzaam in de ad hoc routines werkzaam voor de classificatie van trajecten en de analyse van de clustergrootte. Klik hier om te downloaden van de materialen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven methode is gemakkelijk uit te voeren zelfs zonder enige eerdere ervaring werken met Matlab. Matlab routines echter uiterst nauwkeurigheid met de nomenclatuur van de verschillende opdrachten en de lokalisatie van de verschillende mappen in dienst van het programma. In de tracking routine analyse (stap 3), meerdere parameters kunnen worden gewijzigd. Het venster van "Instelling Gaussiaans-mengsel Model betaamt" (stap 3.8) bepaalt hoe U-track detecteert enkele deeltjes op de video. Dit wordt gedaan door het aanbrengen van een Gaussiaanse mengsel model zoals beschreven in3. Een van de belangrijkste parameters voor deze montage wordt een filter om te helpen identificeren van lokale maxima gedefinieerd. Het succes van deze operatie is afhankelijk van het afbeeldingscontrast en het lawaai aanwezig in de beelden. De eerste parameter (Alpha waarde voor vergelijking met lokale achtergrond) regelt het vertrouwen van een maxima wordt een reële plek, terwijl de tweede helpt bij het verminderen van lawaai tijdens de identificatie van de plekken. Belangrijke parameters in de stap "Tracking" (3.9) zijn het aantal frames om gaatjes te dichten (dat is dat een track kan beslaan over frames waarin het deeltje is eigenlijk niet gezien, maar het is gezien voordat deze frames en na deze frames; in het voorbeeld, 0) , en het aantal frames die een track omvatten moet om te worden beschouwd als een succesvol track (in ons voorbeeld 20; deze parameter is gerelateerd aan de snelheid van de camera acquisitie en het aantal frames in de track moet zodanig zijn dat hierdoor de berekening van de diffusie-co efficiënt). Het is ook belangrijk om te beslissen of u wilt samenvoegen en splitsen van segmenten (in het voorbeeld dat deze twee mogelijkheden werden gekozen). Vervolgens moeten de parameters voor de stap 1 in kosten functies (frame-voor-frame koppelen) worden ingesteld. Deze functie bepaalt hoe de deeltjes langs de frames worden bijgehouden. De meest belangrijke parameters op dit punt is de selectie van de Brownse Zoek straal, die bepalen hoever elke vlek is naar verwachting in het volgende frame. In ons voorbeeld is gekozen voor 0 en 5 als de onder- en bovengrens, respectievelijk. Merk op dat deze parameters zijn zeer specifiek voor de aard van de deeltjes wordt bijgehouden, en dat zij wellicht in elk specifiek geval worden afgestemd. Bijzonder belangrijk zijn de schalen macht in de Brownse en lineaire zoeken stralen. Deze schalen van bevoegdheden is afhankelijk van de aard van de beweging van de deeltjes (gratis of beperkte diffusie). In het voorbeeld de waarden (0,5, 0,01) van een werden gekozen kostenloos diffusie. Zie voor de specifieke documentatie van deze parameters,3.

Bij de berekening van de diffusie coëfficiënten opdracht (stap 4.4), kan de bovengrens van de coëfficiënt van de diffusie van immobiel deeltjes gekend worden uit eerdere experimenten of door het uitvoeren van de functie calculateDiffusion op een apart project met immobiele deeltjes (gezuiverde monomeer fluorescerende eiwit) en het zien van de diffusie-coëfficiënten gemeld. Deze functie neemt twee extra parameters: ' outputSuffix´, die wordt toegevoegd aan de uitvoer bestandsnamen en neemt standaard de lege waarde, en ' plotLength´, die standaard 13 en is het aantal tijdsverschil (seconden) in waarop de diffusie-berekening wordt uitgevoerd. De montage-modus 'alpha' impliceert een aanpassing van de MSD aan de kromme

Equation 1

dat wil zeggen lag een offset (MSD0) en een functie van de macht van de tijd. De exponent van deze macht functie, Equation 2 , bepaalt of de beweging is beperkt (0 < α < 0.6), abnormale (0.6 < α < 0.9), gratis (0.9 < α < 1.1), of gericht (α > 1.1). Voor een overzicht van dit soort analyse heet de lezer Manzo et al.9

De berekening van de coëfficiënten diffusie4 produceert twee output cijfers (Zie aanvullende figuur 19). Het ene toont een histogram van de diffusie coëfficiënten berekend (merk op dat op dit moment er een onafhankelijke diffusie-coëfficiënt voor elk traject is). Het gemiddelde en de 95% percentiel van deze coëfficiënten worden weergegeven in de console van Matlab. De tweede tekening toont de MSD (rode curve) en het aantal stappen overwogen om het te berekenen als functie van de tijd lag voor deze trajecten beschouwd als mobiele (die waarvan verspreiding coëfficiënt boven de drempel gegeven in de command line is). De gemiddelde en de standaarddeviatie van de mobiele trajecten wordt berekend (dit zijn de waarden voor de trajecten in een enkele cel). In het voorbeeld is de exponent 0.59 betekenis dat het verkeer is beperkt. Voor deze curve-fitting meldt het programma de onzekerheid verbonden aan elke één van de parameters (weergegeven als de standaarddeviatie van elk) en de goedheid van fit (een perfecte pasvorm zou bereiken is nul). Op dit punt en na het controleren van de waarde van alpha kunnen wij besluiten om passen de MSD met een verschillende functie:

Equation 3    Als dit 0 < α < 0.6 (beperkt)

Equation 4als 0.9 < α < 1.1 (gratis)

Equation 5Als α > 1.1 (geregisseerd)

Afwijkende trajecten kunnen niet voorzien zijn van een andere functie. In geval van beperkte deeltjes kan u de grootte van de opsluiting (in micron) berekenen zoals in Destainville et al.14

Equation 6

Een goede indicator van een juiste montage is dat de goedheid-van-fit van de alpha montage op de uiteindelijke montage moet dalen (in het voorbeeld de goedheid passen daalt van 0.30474 naar 0.15749, aanvullende figuur 19-20). calculateDiffusioncreates twee bestanden in de "results\TrackingPackage\tracks" binnen de folder van de serie genaamd "diffusionCoefficients.txt" en "diffusionCoefficientsMobile.txt". Deze bestanden bevatten drie kolommen: 1) de index van elk invoerapparaat traject, 2) hun overeenkomstige diffusie-coëfficiënt, 3) de majoritarian regio in het masker waar dit nummer tot behoort (de regio's zijn verkregen uit het bestand "mask.tif" die we in stappen genereerden " 2.7; Als dit bestand niet bestaat, dan is deze kolom niet aanwezig). U kunt dit bestand en de andere soortgelijke bestanden gegenereerd voor andere cellen voor het analyseren van de verdeling van de diffusie-coëfficiënt voor een reeks cellen onder dezelfde proefomstandigheden.

Bij de berekening van de coëfficiënt van de verspreiding voor korte trajecten (stappen 4,7-4.8), is de laatste parameter 'Korte' een achtervoegsel toegevoegd aan de output bestandsnaam, zodat u verschillende subgroepen van de trajecten analyseren kan zonder het overschrijven van de diffusionCoefficients.txt bestanden. De werkelijke naam van het output-bestanden is "diffusionCoefficients < achtervoegsel > .txt" en "diffusionCoefficientsMobile < achtervoegsel > .txt". Als geen achtervoegsel is opgegeven, zoals in de algemene analyse presteerden boven, wordt vervolgens een leeg achtervoegsel uitgegaan. De parameters van het model (D, v en MSD0) afwijken van die welke zijn uitgerust met alle trajecten. Meest opmerkelijk is de standaarddeviatie van de parameters, alsmede de goedheid pasvorm normaal verhogen. De reden is dat korte trajecten meer onstabiel zijn en een betrouwbare montage moeilijker is.

De analyse van lange trajecten (stap 4.9) classificeren ze in afgesloten (1), gratis (2) of gestuurde (3) volgens hun eerste ogenblik en de ligging ten opzichte van de 2,5% en 97,5% percentiel van het eerste moment van 500 willekeurige paden met Brownse beweging, hetzelfde diffusie coëfficiënt en lengte als het traject wordt geanalyseerd en gesimuleerd door Monte Carlo. Als het eerste moment van het pad wordt geanalyseerd lager dan de 2,5% van de eerste momenten waargenomen in de simulaties is, wordt het pad bestudeerd is geclassificeerd als beperkt. Als het boven de 97,5% van de gesimuleerde eerste momenten, is het geclassificeerd als gericht; het pad is anders geclassificeerd als Brownian. In de opdracht in dienst, 113.88e-3 is de pixelgrootte in µm, 0.0015 is de bovengrens van de coëfficiënt van de diffusie van immobiel spots gemeten in µm2/s, en de 'Lange' is het achtervoegsel voor de output bestandsnaam. De eerste kolom van dit bestand ("trajectoryClassificationLong.txt") is het nummer van de baan, de tweede is de classificatie (1 = beperkt, 2 = gratis, 3 = gericht), en de derde is het traject eerste moment.

Het script voor de berekening van de intensiteit van elk deeltje (stap 5.1) is zeer flexibel en kunt bijhouden van de intensiteit van de fluorescentie op veel verschillende manieren (elk geschikt voor verschillende situaties zoals het bijhouden van immobiel vlekken van een controle-experiment of het bijhouden van zeer beweegbare spots op een cel met variabele fluorescerende achtergrond). Het script zal alle trajecten langs alle frames analyseren. Voor elke plek in elk frame zal het meten van de intensiteit van de pixels rondom de plek (het analyseert een vierkante patch rond de plek, bij verstek van een formaat 3 x 3 pixels), schatten de spot achtergrond en berekenen van de fluorescentie verschil tussen de plek en de achtergrond. Het percentage photobleaching deeltjes en het aantal fluorescerende deeltjes in één cluster, gezien als een enkele plek, kan worden geraamd op deze manier.

Deze geautomatiseerde methode (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) produceert informatie over meerdere parameters (plek intensiteit, laterale verspreiding, soort beweging), die helpen kunnen om te bestuderen van de relatie tussen de grootte van de plek en haar dynamiek op basale voorwaarden, en hoe verschillende behandelingen kunnen deze parameters wijzigen.

De belangrijkste beperking van de methode is dat er cel transfectie met de fluorescente proteïne worden bijgehouden. Meestal leidt transfectie tot eiwit overexpressie, een feit dat een belemmering vormt één eiwit bijhouden. Een cel Sorteren stap moet worden opgenomen om te selecteren cellen uitspreken van een aantal receptoren waarmee detectie en tracking van enkele deeltjes door SPT-TIRF microscopie. Deze methode kan ook worden gebruikt voor het bijhouden van biomoleculen quantumdots voorzien of Fab-fragmenten. Het beschreven protocol vereist een aantal besturingselementen die eerder moet worden geanalyseerd om ervoor te zorgen dat de conclusies die uit de analyse verdreven kloppen. Allereerst is het cruciaal belang voor het bepalen van de juiste expressie voorwaarden waarmee de opsporing en het volgen van enkele deeltjes. Films met dichtheden van ~ 4.5 deeltjes/µm2, overeenkomen met 8500-22.000 receptoren/cel, werden gebruikt voor het analyseren van de spatio-temporele ordening van de celmembraan receptor13.

Het is belangrijk om de minimale detecteerbare diffusie-coëfficiënt met behulp van gezuiverde monomere AcGFP proteïnen of vaste cellen. In beide gevallen wordt ervan uitgegaan dat er geen verspreiding en daarom wij schatten dat de waarden van de verspreiding van deeltjes geanalyseerd in deze voorwaarden overeen met geïmmobiliseerdet deeltjes en gebruikt om te discrimineren tussen mobiele en immobiel trajecten13.

De analyse die wij hier hebben ingediend is een algemene traject analyse tool, die kan worden toegepast aan de analyse van de verspreiding van receptoren door super-resolution, de analyse van beelden van de diffractie beperkt en de analyse van de cellulaire verkeer door standaard microscopie . Het belangrijkste voordeel van deze methode met anderen eerder beschreven, zoals analyse van aantal en helderheid11, is dat het mogelijk maakt voor de evaluatie van de gemiddelde intensiteitswaarden van elke individuele plek langs de baan, rekening houdend met de tijd van voortbestaan van het eiwit AcGFP monomeer voordat photobleaching. De overlevingstijd van een molecuul voordat photobleaching sterk van de excitatie-voorwaarden afhangen zal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij zijn Carlo Manzo en Maria García Parajo dankbaar voor hun hulp en source code van de analyse van de coëfficiënt diffusie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie van wetenschap, innovatie en universiteiten (SAF 2017-82940-R) en het RETICS-programma van het Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 en RD16/0012/0006; RIER). LMM en JV worden ondersteund door het programma van de COMFUTURO van de Fundación generaal CSIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Tags

Immunologie en infecties probleem 146 SPT chemokine receptor tracking clusters verspreiding analysesoftware
Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sorzano, C. O. S.,… More

Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter