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Immunology and Infection

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour une seule particule suivi d’analyse d’images qui permet une évaluation quantitative des coefficients de diffusion, types de tailles de motion et cluster de simples particules détectées par microscopie à fluorescence.

Abstract

Suivi sur une séquence vidéo et de l’analyse postérieure de leurs trajectoires de particules est aujourd'hui une opération courante dans de nombreuses études biologiques. À l’aide de l’analyse des récepteurs de la membrane cellulaire des grappes comme modèle, nous présentons un protocole détaillé pour cette tâche d’analyse image à l’aide de Fidji (ImageJ) et routines Matlab pour : 1) définir des zones d’intérêt et de concevoir des masques adaptés à ces régions ; 2) suivre les particules dans les vidéos de microscopie de fluorescence ; 3) analyser les caractéristiques de diffusion et de l’intensité des titres sélectionnés. L’analyse quantitative des coefficients de diffusion, les types de mouvement et la taille de cluster obtenues en microscopie par fluorescence et de traitement d’image fournit un outil précieux pour déterminer objectivement la dynamique des particules et les conséquences de la modification conditions environnementales. Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour l’analyse de ces fonctionnalités. La méthode décrite ici non seulement permet la détection de molécules simples suivi, mais automatise également l’estimation des paramètres de diffusion latérale à la membrane cellulaire, classifie le type de trajectoire et permet une analyse complète ainsi surmonter la difficultés pour quantifier la taille du spot sur sa trajectoire entière à la membrane cellulaire.

Introduction

Protéines de la membrane intégrées dans la bicouche lipidique sont en mouvement continu en raison de la diffusion thermique. Leur dynamique est essentielle pour réguler les réactions de cellules, comme les interactions intermoléculaires permettent la formation de complexes qui varient en taille de monomères d’oligomères et influencent la stabilité des complexes de signalisation. Élucider les mécanismes qui contrôlent la dynamique des protéines est donc un nouveau défi en biologie cellulaire, nécessaire pour comprendre les voies de transduction de signal et d’identifier les fonctions des cellules imprévus.

Certaines méthodes optiques ont été développées pour étudier ces interactions dans la vie des cellules1. Parmi ceux-ci, microscopie à fluorescence (FRBR) réflexion totale interne, mis au point dans les années 1980, permet l’étude des interactions moléculaires à ou très près de la membrane de la cellule2. Afin d’étudier les paramètres dynamiques des trajectoires de protéine de membrane FRBR données dans les cellules vivantes, il faut une seule particule suivi méthode (SPT). Bien que plusieurs algorithmes sont disponibles pour cela, nous utilisons actuellement celles publiées par Jaqaman et al.3 qui abordent l’hétérogénéité de mouvement de particules dans un champ de particules denses en liant les particules entre images consécutives pour relier la piste qui en résulte segments en trajectoires complets (disparition temporaire de particules). Le logiciel capture la particule qui résulte de l’agrégation et la dissociation des événements3de fractionnement et fusion. Parmi les données de sortie de ce logiciel est détection des particules le long de la trajectoire toute en définissant leurs positions X et Y dans chaque image.

Une fois que les particules sont détectés, nous appliquons différents algorithmes pour déterminer le décalage court diffusion coefficient (D1-4)4,5. En appliquant l’analyse du spectre de mise à l’échelle de Moment (MSS)6,7,8 , ou en ajustant la valeur « alpha » par un ajustement de la déplacement quadratique moyenne (TMS) à la courbe9, nous avons également classer les particules selon le type de trajectoire.

Analyse d’intensité spot en images de fluorescence est un objectif commun pour les scientifiques dans le domaine10,11. L’algorithme couramment utilisé est la soi-disant numéro et la luminosité. Cette méthode néanmoins ne permet pas bonne intensité d’image par image détection de particules dans la fraction mobile. Nous avons, par conséquent, généré un nouvel algorithme d’évaluer ces particules intensités image par image et de déterminer leur état d’agrégation. Une fois que les coordonnées de chaque particule sont détectées à l’aide de logiciel U-Track23, nous définissons son intensité dans chaque image sur la trajectoire complète, compte tenu également de l’arrière-plan de la cellule dans chaque image. Ce logiciel offre différentes possibilités afin de déterminer l’intensité du spot et l’arrière-plan de la cellule et, à l’aide de protéines monomériques et dimériques connues comme références, calcule le nombre approximatif des protéines dans la particule détectés (taille de cluster).

Dans cet article, nous décrivons un guide attentif pour effectuer ces trois étapes : 1) détecter et suivre des particules seul le long d’une vidéo de microscopie de fluorescence à l’aide de rail-U ; 2) analysant le coefficient de diffusion instantanée (D1-4) de ces particules et le type de mouvement (clos, libre ou dirigée) des particules avec longues trajectoires par MSS ; 3) mesure de l’intensité de tache le long de la vidéo corrigée par la fluorescence de fond estimée pour chaque tache. Cela permet l’estimation de taille de cluster et l’identification des étapes Photoblanchiment.

L’utilisation du présent protocole ne nécessite pas de compétences spécialisées et peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire de culture cellulaire, flow cytometry et microscopie des installations. Le protocole utilise ImageJ ou Fidji (une distribution de ImageJ12), U-piste3et des routines de hoc fait ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track et ad hoc routines écrasé de Matlab qui peut être installé dans n’importe quel ordinateur compatible.

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Protocol

1. préparation des échantillons biologiques

  1. La croissance de cellules Jurkat dans RPMI 1640 additionné de 10 % FCS, NaPyr et L-glutamine (RPMI complet). Cellules Electroporate Jurkat (20 x 106 cellules/400 µL de milieu RPMI 1640 avec 10 % FCS) avec un vecteur de récepteurs monomères chemokine GFP-étiqueté (CXCR4-AcGFP, 20 μg) afin de permettre sa détection à l’aide de la microscopie de fluorescence.
    Remarque : Il est possible d’utiliser d’autres protéines fluorescentes monomères tels que mCherry, mScarlet, etc..
  2. 24h après la transfection d’analyser les cellules dans un cytomètre en flux de déterminer la viabilité cellulaire ainsi qu’expression CXCR4-AcGFP.
  3. Sélectionnez les cellules exprimant des niveaux faibles de CXCR4-AcGFP par un tri de cellules des cellules positivesfaible de GFP (Figure 1), comme la faible expression du récepteur transfectée est requis dans les expériences de TIRFM afin d’assurer le suivi de la particule pour le suivi individuel 9de trajectoires.
  4. Quantifier le nombre de récepteurs à la surface des cellules.
    Remarque : Comme un exemple13, ~ 8 500-22 000 marqué AcGFP récepteurs/cellule, correspondent à2~ 2-4.5 particules/μm.
  5. Remettre en suspension les cellules triées dans RPMI complet et incuber pendant au moins 2 h à 37 ° C, 5 % de CO2. Centrifuger les cellules (300 x g, 5 min) et eux resuspendu dans un tampon FRBR (HBSS, 25 mM HEPES, 2 % FCS, pH 7,3).
    1. Plaque sur la vaisselle de microtitration à fond de verre de 35 mm (2-3 x 105 cellules/plat) revêtue de la fibronectine (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) dans la présence ou l’absence du ligand approprié (c.-à-d. CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incuber les cellules (20 min à 37 ° C, 5 % de CO2) avant l’acquisition d’images.
  6. Réaliser des expériences à l’aide d’un microscope TIRF, équipé d’un appareil EM-CCD, un 100 x objectif immersion dans l’huile (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA) et un laser diode à 488 nm. Le microscope permet le contrôle de température et d’incubation en CO2. Localiser et concentrer les cellules avec les boutons de mise au point grossière et fine, en utilisant le champ lumineux afin de minimiser les effets de Photoblanchiment. Pour le réglage de mise au point fine en mode FRBR, utiliser une intensité laser faible, insuffisante pour la détection de la particule ou d’induire des effets de Photoblanchiment (puissance de laser de 5 %, 28 μW).
  7. Acquérir des films (séquences d’images) d’environ 50 s réduisant au minimum l’intervalle de temps entre les images. Pénétration du champ évanescent devrait être de 70-90 nm de profondeur. Enregistrer les films acquis pour chaque condition expérimentale comme « .lif » (video.lif).
    Remarque : Films dans l’exemple décrit ont été acquises à 49 % à la puissance de laser (2 mW) avec un temps de pose de 90 ms et un intervalle de temps de la SP 98, pour 49 s (500 images). Pénétration de l’onde évanescente sélectionné était de 90 nm.

2. sélection d’Images et création de masques

  1. Pour chaque condition expérimentale (video.lif), créez un nouveau dossier (VideoName) qui doit contenir des dossiers différents pour chaque série. Chaque dossier contient un dossier « videoSeq » pour les images vidéo et un dossier de « résultats » pour les résultats de l’analyse. Assurez-vous que la structure de fichier en ce moment est la suivante :
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/videoSeq
    VideoName/Series1/résultats
    Remarque : Du microscope .lif différents fichiers sont obtenus avec plusieurs vidéos pour chaque condition de traitement (FN, FN + SDF). « video.lif » correspond au fichier vidéo input.lif avec toutes les acquisitions de films FRBR (série) réalisé au microscope. «videoSeq» dossier contiendra les 500 cadres du film que nous analysons. Le dossier de «résultats» contient tous les fichiers résultant de l’analyse effectuée. Nomenclature exacte et la localisation des différents dossiers sont essentiels pour le bon fonctionnement des algorithmes. Les noms en caractères gras dans la liste ci-dessus sont fixes (c.-à-d., ils ont d’être appelé de cette façon parce que ce sont les noms recherchés par les scripts). Pas en caractères gras les noms peuvent changer afin de refléter l’expérience réalisée.
  2. Ouvrir la vidéo TIRFM (fichier .lif) avec les Fidji ou ImageJ par glisser-déposer le fichier sur la barre de menus de Fidji et cliquez sur OK pour importer le fichier FRV à l’aide de BioFormats (supplémentaire Figure 1).
  3. Sélectionnez la série de traiter et cliquez sur OK (Supplemental Figure 2 a). Pour créer un masque pour l’analyse de cette vidéo, importez également une image multicanal avec les chromophores différents (dans l’exemple, série 1 est l’image multicanal et série 2 la vidéo correspondante). La vidéo (et l’image multicanal) doivent s’ouvrir comme une pile de ImageJ. Dans l’exemple (Supplemental Figure 2 b), l’image se trouve sur la gauche et la vidéo se trouve sur la droite.
    Remarque : Si la création d’un masque pour la vidéo n’est pas nécessaire, passez à étape 2.5.
  4. Créer un masque. Créer une image unique avec les canaux utiles pour la conception du masque. Dans ce cas, les canaux intéressants sont le rouge, vert et gris.
    1. Diviser les canaux de l’image multicanal (complémentaire Figure 3 a) : sélectionnez l’Image dans la barre de menu et cliquez sur couleur | Fractionner des chaînes. Les différents canaux seront affichera comme images distinctes (complémentaire Figure 3 b).
    2. Fusionner à nouveau les trois chaînes en une seule image (Supplemental Figure 4 a) : sélectionnez l’Image dans la barre de menu et sélectionnez couleur | Fusionner les canaux. Sélectionner les canaux appropriés, puis appuyez sur OK (Supplemental Figure 4 b). Une nouvelle image non-stack sera généré (Supplemental Figure 4).
    3. Synchroniser les deux fenêtres à l’aide de l’outil de Synchronisation Windows (Supplemental Figure 5 a) : sélectionnez analyser dans la barre de menu | Outils | Synchronisation Windows. Une nouvelle fenêtre avec les possibilités de synchroniser image s’affichera (Supplemental Figure 5 b).
    4. Avec les deux fenêtres synchronisés (seule la vidéo s’il n’y a aucune image multicanal associé), la même région dans les deux fenêtres peut être recadrée. Dessinez la zone concernée avec l’outil de sélection rectangulaire du menu flottant ImageJ. Sélectionnez l’Image dans la barre de menu et sélectionnez Crop (Supplemental Figure 6 a). Les deux images recadrées montrera individuellement (Supplemental Figure 6 b).
    5. Unsynchronize les deux fenêtres (Supplemental Figure 6 b) en appuyant sur le bouton Tout Unsynchronize dans le gestionnaire de Synchronisation Windows .
  5. Si un masque n’a pas été créé comme dans l’étape 2.4, dessinez la zone concernée avec l’outil de sélection rectangulaire du menu flottant ImageJ.
  6. Enregistrer la vidéo comme une séquence d’images dans le répertoire videoSeq sous le répertoire vidéo correspondant (Supplemental Figure 7 a) : sélectionnez le fichier dans la barre de menu et cliquez sur Enregistrer sous | Séquence d’image... renommer les étiquettes pour la séquence vidéo comme video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (Supplemental Figure 7 b) : dans la zone nom , renommez en vidéo , cliquez sur OK. La séquence doit être seule dans son répertoire pour être utilisé avec succès par U-track.
    Remarque : Si ce n’est pas le cas, concevoir un masque pour la vidéo, allez à l’étape 2.8.
  7. Concevoir un masque. Sélectionnez l’image multicanal et ouvrez l’éditeur de Segmentation plugin (Supplemental Figure 8 a) : sélectionnez Plugins dans la barre de menu et sélectionnez Segmentation | Éditeur de segmentation. Ajouter et renommer les étiquettes de la segmentation selon les besoins par un clic droit sur l’étiquette de l’éditeur de Segmentation (Supplemental Figure 8 b, C).
    1. Choisissez l’outil de sélection approprié dans le menu flottant ImageJ (utiliser ici, à main levée), sélectionnez une étiquette (vert) et concevoir tout d’abord le masque ultrapériphérique (Supplemental Figure 9 a). Une fois conçu, sur le bouton + en option de sélection de fenêtre Composite et le masque sélectionné apparaît sur l’afficheur (Supplemental Figure 9 a). Répétez cette étape avec des étiquettes suivant (intérieur, en rouge) (Supplemental Figure 9 b).
      Remarque : Après la conception du masque pour les labels verts et de l’intérieur, le masque extérieur occupera le reste de l’image.
    2. Masques sont codées dans l’image comme régions 0, 1, 2... Selon l’ordre des étiquettes dans la fenêtre d’étiquettes de RVB. Lorsque les tous les masques pour les différents labels sont conçus, enregistrez le masque avec le même nom que la vidéo, avec le nom mask.tif (Supplemental Figure 9) : sélectionnez le fichier dans la barre de menu et sélectionnez Enregistrer sous | TIFF....
      Remarque : Les masques sélectionnés seront utilisées dans le calcul des coefficients de diffusion et de classification des trajectoires (voir l’étape 4.2).
  8. Vérifier que la structure de fichier en ce moment est la suivante :
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/résultats
    Remarque : Le mask.tif est une image avec le masque comme conçu en étapes 2,4 et 2,7. Le video*.tiff est la vidéo enregistré à l’étape 2.6. Comme indiqué ci-dessus, les noms en caractères gras dans la liste ci-dessus sont fixés, par exemple, ils doivent être appelé de cette façon parce que ce sont les noms recherchés par les scripts. Pas en caractères gras les noms peuvent changer afin de refléter l’expérience réalisée.

3. suivi des particules

  1. Le suivi de toutes les particules vus dans les vidéos sélectionnées à l’aide d’U-piste.
  2. Ouvrir Matlab et ajouter répertoire U voie le chemin d’accès à l’aide de Set Path | Ajouter avec option de sous-dossiers dans le menu. Enregistrez le chemin afin qu’à l’avenir les exécutions de Matlab U-rail est dans le chemin d’accès. Ce paramètre de chemin d’accès doit être fait qu’une seule fois.
  3. Changer le répertoire de travail vers le répertoire contenant la série pour être analysés. U-voie d’appel en tapant dans la console (Supplemental Figure 10) movieSelectorGUI et appuyez sur entrée. La fenêtre de sélection de films sera ouvert (Supplemental Figure 11 a).
  4. Appuyez sur le bouton de film nouveau et la fenêtre d’édition de film apparaîtra (Supplemental Figure 11 b).
  5. Appuyez sur ajouter un canal pour choisir le répertoire avec la vidéo (VideoName/Series1/vidéo) et renseignez les paramètres d’informations de film. Définir le répertoire de sortie pour les résultats de U-piste aux résultats (videoName/Series1/résultats).
    Remarque : Les paramètres d’informations de film peuvent être obtenues au microscope et les conditions d’acquisition.
  6. Appuyer sur les paramètres avancés de canal et renseignez les paramètres liés à l’acquisition. Regardez les valeurs des paramètres dans l’exemple (Supplemental Figure 11).
  7. Appuyez sur enregistrer dans la fenêtre paramètres de canal avancées et enregistrer sur la fenêtre d’édition de film . Le programme vous demandera confirmation d’écrire le fichier appelé movieData.mat dans le répertoire de résultats . Confirmer.
  8. Après la création du film, appuyez sur continuer dans la fenêtre de sélection du film. U-piste posera sur le type d’objet à analyser. Le choix de Single-particules (Supplemental Figure 12). La fenêtre du panneau contrôle apparaîtra (Supplemental Figure 13 a).
    1. Sélectionnez la première étape Etape 1 : détection et appuyez sur le paramètre. La fenêtre de Montage de mélange-modèle gaussien paramètre s’affiche (Supplemental Figure 13 b). Dans l’exemple, « Valeur Alpha pour la comparaison avec le contexte local » est égale à 0.001 et « Rolling-fenêtre temps moyenne » à 3 (Supplemental Figure 13 b).
    2. Appuyez sur appliquer dans la fenêtre Paramètres de mélange-modèle gaussien mise en place et exécuter dans le panneau de configuration. Avec la configuration supplémentaire Figure13, seulement l’étape de détection s’exécute. Cette étape prend quelques minutes (2-5). Vérifier les résultats en appuyant sur le bouton résultat de l’étape 1 (détection, supplémentaire Figure 14).
      Remarque : Comme indiqué ci-dessus, le film montre les cercles rouges sur les particules détectées. Si aucun cercle rouge ne s’affiche, puis cette étape n’a pas été travaillé correctement.
  9. Effectuer l’identification des titres, c'est-à-dire, fusionnant les particules détectées dans l’étape précédente en pistes qui s’étendent sur plusieurs images. C’est la étape 2 : suivi des de U-track dont les paramètres doivent être définis comme illustré en Figure supplémentaire 15 a-C. L’étape 2 coût fonction paramètres image à image qui relie et écart de fermeture, fractionnement et fusion dans l’exemple sont les complémentaire Figure 15 b et C, respectivement.
  10. Après avoir configuré les paramètres pour l’étape 2, appuyez sur Run dans le panneau de configuration et seule étape 2 s’exécute (Supplemental Figure 16).
  11. Effectuer l’analyse de morceaux, étape 3. Définissez les paramètres comme indiqué dans le supplément Figure 17 (panneau de droite). Ensuite, appuyez sur appliquer dans le panneau d’analyse de la mise en mouvement et courir dans le Control Panel-U-Track. Cette étape prend quelques secondes.
  12. Avec le bouton du résultat de l’étape 3, vérifiez que le processus a identifié correctement toutes les pistes. Pour ce faire, cliquez sur voir la numéro de la piste de la fenêtre options de la vidéo et vérifier l’image par image, que chaque piste a été correctement identifié (Supplemental Figure 18). Manuellement annoter ces particules qui ne sont pas des particules vrais.
    Remarque : Si cette sélection manuelle n’est pas faite, une plus faible sélection automatique peut être effectuée plus tard lors du calcul du coefficient de diffusion (voir étape 4).

4. calcul des Coefficients de Diffusion et Classification des trajectoires

  1. N’oubliez pas que tous les scripts sont appelées à partir du répertoire de la vidéo en cours d’analyse (dans l’exemple, VideoName/Serie1).
  2. Lire toutes les trajectoires pour calculer les coefficients de diffusion en publiant dans Matlab console la commande : trajectories=readTrajectories(0.1), où 0,1 est le temps en secondes entre deux images consécutives (intervalle de temps indiqué dans le panneau de film Informations, supplémentaire Figure 11 b).
  3. Exclure les trajectoires correspondant aux taches/trajectoires incorrectement identifiés. Donner une liste des sites à exclure. Par exemple, pour exclure les points 4, 5 et 28, tapez : trajectoires = readTrajectories (0,1, [4, 5, 28]).
  4. Calculer les coefficients de diffusion instantanée pour chacun des titres de cette cellule. Dans ce cas, calculer le coefficient de diffusion pour un décalage dans le temps = 4, appelé D1-4. Pour ce faire, exécutez dans la console Matlab la commande : D = calculateDiffusion (trajectoires, 113.88e-3, 0.0015, « alpha ») où les trajectoires sont les trajectoires obtenues à l’étape 3, 113.88e-3 est la taille en pixels des images acquises en microns, 0,0015 est un limite supérieure pour les coefficients de diffusion des particules immobiles, mesurées en µm2/s et « alpha » est le modèle ajusté tel qu’expliqué ci-dessous.
    Remarque : Lorsque vous utilisez un appareil photo plus rapide et la nécessité plus d’images pour calculer le paramètre diffusion porter, par exemple à 20, de D = calculateDiffusion (trajectoires, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', '', 20). Avant le 20, dans l’exemple ci-dessus, le paramètre de chaîne '', est le suffixe ajouté aux fichiers de sortie. Ce suffixe peut servir à différencier les différentes analyses.
  5. S’adapter à la MSD avec une fonction différente en appelant la fonction calculateDiffusion avec un mode de montage différentes (« limité », « libre » ou « dirigé »). Dans cet exemple, « limite » : D = calculateDiffusion (trajectoires, 113.88e-3, 0.0015, 'limité').
  6. Obtenez les résultats de raccord pour le modèle réalisé, conformément à la Supplemental Figure 20.
  7. Décomposer les trajectoires en trajectoires courtes et longues. Utilisez la commande : [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) où 50 est la longueur minimale dans les cadres d’une trajectoire à considérer longtemps (dans l’exemple illustré).
  8. Étudier les trajectoires courtes utilisant la même procédure de montage décrite dans étape 4.3 : D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'dirigé', 'Court'). Analyser les trajectoires courtes et anormaux avec la commande : D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, « alpha », « Courte »).
  9. Analyser les longues trajectoires pour classifier le type de requête par le biais de leur spectre de mise à l’échelle de Moment (MSS)7. La commande : trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'Long') présente l’analyse en écran et génère un fichier appelé trajectoryClassification < suffixe > .txt dans le répertoire results\TrackingPackage\tracks.

5. calcul de Ssize Cluster par le biais de la densité de particules

Remarque : N’oubliez pas que tous les scripts sont appelées à partir du répertoire de la vidéo en cours d’analyse (dans l’exemple montré, VideoName/Serie1).

  1. Analyser l’intensité de chaque particule le long de leur trajectoire. Pour ce faire, appelez le script en tapant dans la console de Matlab : analyzeSpotIntensities qui prend comme entrée les trajectoires calculées par U-track dans la première section. Dans sa forme la plus simple, il suffit d’appeler le script sans aucun argument de l’annuaire de la vidéo en cours d’analyse (dans l’exemple montré, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Configurer le comportement de cet base de différentes manières en fournissant des arguments au script comme dans : analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, valeur2,...). Des arguments valides avec leurs valeurs de variable correspondantes (« ArgN´, valeurn) sont répertoriés.
    1. (« spotRadius´, 1)
      Analyser l’intensité de fluorescence à l’aide de la spotRadius de 1 pixel (par défaut) qui correspond à une parcelle de taille 3 x 3, centrée à l’endroit ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Remarque : Pour un timbre de 5 x 5, centrée à l’endroit, choisir un spotRadius de 2, etc..
    2. (« onlyInitialTrajectories´, 1)
      Si cet argument est donné (true, valeur de 1), analyser uniquement les trajectoires qui commencent dans la première image de la vidéo. Ceci est utile pour analyser les images de contrôle (par défaut 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Si cet argument a la valeur 0 (false), puis continuez la coordonnée de la place de sa première image pour tous les cadres (Ceci est utile pour les taches immobiles). Si l’argument est défini sur 1 (par défaut 1, true), le spot est suivi le long de la vidéo qui suit les coordonnées calculées par U-track.
    4. (« excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Inclure le numéro de la trajectoire de ces trajectoires exclu à l’étape 4.3 (dans l’exemple 4, 5, 28).
    5. (' ´ extendTrajectory, 1)
      Si cet argument a la valeur 1 (true), puis analyser l’intensité dans la mise à jour à la fin de la vidéo (même si la trajectoire s’arrête plus tôt). La coordonnée du spot est la dernière coordonnée dans la trajectoire (si trackTrajectory a la valeur true) ou la première coordonnée dans la trajectoire (si trackTrajectory a la valeur false). Cet argument a la valeur false (0) par défaut.
    6. (« subtractBackground´, 1)
      Si ce paramètre est défini, puis corriger la raw fluorescence mesurée à chaque endroit par l’estimation de la fluorescence de fond pour cet endroit (voir ci-dessous). Cet argument a la valeur true (1), par défaut.
    7. (« meanLength´, numéro d’image)
      Si ce paramètre est défini, puis la place de la densité moyenne est mesurée à la longueur indiquée. La valeur « meanLength », 20 pour mesurer l’intensité moyenne de spot dans les 20 premiers cadres. Si l’argument n’est pas défini, l’intensité du spot est calculée à la trajectoire entière (par défaut, toute la longueur).
    8. (« showIntensityProfiles´, 1)
      Définissez ce paramètre en tant que 1 (par défaut, 0, false), pour tracer le profil d’intensité le long les trames différentes ainsi que leurs origines.
      Remarque : Ces emplacements sont très utiles pour identifier le Photoblanchiment comme indiqué dans le supplément Figure 21. Pour chaque chemin d’accès, la routine analyse automatiquement s’il est possible qu’il y a eu le Photoblanchiment. Ceci est fait en comparant les valeurs d’intensité avec t de l’élève dans les premiers et le derniers N cadres le long du chemin. Par défaut, N est de 10, mais cette valeur peut être modifiée par le biais de l’argument ' Nbleach´.
    9. (« backgroundMethod´, valeur)
      Définissez ce paramètre pour déterminer l’arrière-plan de chaque spot. Cela peut être fait de plusieurs façons, et que l'on à utiliser peut être sélectionnée changeant la « valeur » :
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Utilisez cette valeur pour identifier manuellement l’arrière-plan pour l’intégralité de la vidéo. Permettent de sélectionner les 8 points dans la première image de la vidéo. Un patch autour de ces points est analysé le long de la vidéo en entier, et le quantile de 95 % de tous ces intensités est choisie comme l’intensité de l’arrière-plan pour toutes les taches.
      2. (« backgroundMethod´, 1)
        Utilisez cette valeur pour identifier manuellement le fond de chaque image. Choisissez 8 points pour chaque endroit et chaque image. Il s’agit d’une tâche chronophage, mais il donne beaucoup de contrôle à l’utilisateur. Le quantile de 95 % de l’intensité dans ces patchs est choisie comme l’intensité de l’arrière-plan pour cette place dans ce cadre.
      3. (« backgroundMethod´, 2)
        Utiliser cette valeur pour calculer le fond de chaque spot estimée de 8 points situés dans un cercle autour de la tache avec un rayon contrôlé par l’argument ' backgroundRadius´ (par défaut, 4 * spotRadius).
      4. (« backgroundMethod´, 3)
        Utilisez cette valeur pour calculer le fond de chaque image par tout d’abord localiser la cellule dans la vidéo et l’analyse ensuite les intensités de la cellule dans chaque trame (Supplemental Figure 22).
        Remarque : L’arrière-plan est choisie comme la valeur de gris à un quantile donné de cette répartition (par défaut, 0,5 (= 50 %), bien que ce paramètre peut être contrôlé par le biais de l’argument ' backgroundPercentile´, cette valeur peut être plus élevé, par exemple, 0,9 (= 90 %) Si désireux de la plus grande partie de la cellule à considérer comme toile de fond. Pour aider à l’identification de la cellule, indiquer quel est la valeur maximale de fond attendue le long des cadres à l’aide de l’argument ' maxBackground´ (par exemple, dans toutes les vidéos analysées, la valeur background normalement jamais dépasse 6000)13. Par défaut, cette option est définie sur 0, ce qui signifie que cette aide n’est pas utilisée par défaut. Visitez la détection de cellules et de la zone sélectionnée pour l’estimation de l’arrière-plan en définissant l’argument ' showImages´ à 1 (arrêt de l’exécution à tout moment en appuyant sur CTRL-C).
  2. Recueillir les informations de diffusion et de l’intensité pour toutes les trajectoires calculées dans les étapes 4 et 5.1, respectivement, en utilisant gatherDiffusion.AndIntensity (). Recueillir uniquement les informations de diffusion et de l’intensité des trajectoires courtes. Pour ce faire, utiliser les suffixes utilisés dans étape 4.7, tapez : gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) où ' Short´ est le suffixe utilisé dans l’étape 4.7.
  3. Recueillir le Moment mise à l’échelle du spectre et l’intensité informationby en tapant : gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') où « Long » est le suffixe utilisé dans l’étape 4.7. Un résumé de tous les fichiers générés à l’aide de ce protocole est illustré à la Figure 2.

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Representative Results

L’utilisation de ce protocole permet le suivi automatique des particules détectées dans les films de microscopie par fluorescence et de l’analyse de leurs caractéristiques dynamiques. Au début, les cellules sont transfectées avec la protéine fluorescent couplé à suivre. Le niveau approprié des récepteurs présente sur la surface de la cellule qui permet la que SPT est obtenue par cellule tri (Figure 1). Les cellules sélectionnées sont analysés au microscope TIRF qui génère des vidéos dans un format qui peut être étudié avec les outils décrits dans le présent protocole (Supplemental vidéo 1).

Les vidéos générées ne peuvent pas être analysés directement, et des cadres indépendants de chaque vidéo sont requis. L’utilisation d’ImageJ génère des fichiers qui peuvent être interprétées à l’aide du logiciel Matlab tels que des images vidéo au format .tiff ou masques. U-piste pistes les particules vus dans la vidéo sélectionnée et enregistre les informations dans les fichiers Matlab (.mat) (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), voir la Figure 2.

Comme illustré à la Figure 2, le calcul des coefficients de diffusion et la classification des commandes de trajectoires, génère des fichiers différents (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etc.). Les informations contenues dans ces fichiers sont mieux gérées à l’aide du logiciel Excel et "Prism". Les renseignements peuvent être obtenus par cette analyse incluent :

  1. Pourcentage des spots immobiles. Vous pouvez utiliser comme référence de particules immobiles : le centile 95 % de D1-4 valeurs obtenues (1) des particules simples dans les cellules fixes et/ou (2) de la protéine fluorescente purifiée attaché aux lamelles (Figure 3 a).
  2. Pourcentage des trajectoires longues (> 50 cadres) (Figure 3 b).
  3. Type de mouvement des trajectoires longues : réalisé, gratuite, limitée (Figure 3).
  4. Coefficient de diffusion (D1-4) des particules mobiles dans les cellules traitées avec différents stimulus (Figure 4 a).

L’étape 5 du protocole analyse les intensités de chaque particule le long de la trajectoire. script analyzeSpotIntensities imprimera à l’écran toutes les informations analysées. Pour chaque tache et châssis, le script affiche la coordonnée de la tache dans ce cadre (x, y) en unités de pixel, l’estimation de la fluorescence de fond (k0), l’intensité brute de spot dans le patch de 3 x 3, l’intensité corrigée (calculée comme étant l’intensité brute moins sa l’arrière-plan), la valeur maximale de l’intensité observée dans le patch et le numéro de région dans le masque où cet endroit se trouve à ce cadre. Un exemple du type de production est

Spot = cadre 43 = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Toutes ces informations sont stockées dans un fichier journal (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) et une table qui peut être lu à partir d’Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Après avoir analysé chaque tache, le script affiche l’intensité moyenne le long de la trajectoire et la région majoritaire au sein du masque

Spot = 43
meanCorrectedSpotIntensity le long des cadres = 4762.303
région majoritaire = 3

Ces informations sont stockées dans le fichier journal ci-dessus et une table qui peut être lue depuis une feuille de calcul (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). À titre d’exemple, moyenne intensité spot (msi) pour chaque particule le long de leur trajectoire dans les cellules stimulées avec des conditions différentes est illustrée à la Figure 4 b. Nous pouvons maintenant utiliser ces informations pour estimer approximativement la taille du cluster fluorescent. En moyenne un spot intensité corrigée est liée avec le nombre de protéines fluorescentes présentes dans cet endroit, et la fluorescence d’un monomère peut être mesuré grâce à une expérience semblable mais indépendante, calculer directement le nombre de récepteurs par particule. La distribution de fréquence du nombre de récepteurs par particule en utilisant comme référence l’intensité de la protéine monomérique exprimée dans les mêmes cellules est montrée dans la Figure 4.

La diffusion se rassemblent et commande d’intensité créent deux fichiers : un appelé diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtet un autre appelé log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt dans le répertoire résultats / TrackingPackage/pistes. Les deux fichiers contiennent 1) l’indice spot, 2) le coefficient de diffusion, 3) l’intensité et 4) le numéro de région dans le masque. Ces fichiers peuvent être lus d’une feuille de calcul.

De même, la commande de classification et de l’intensité de trajectoire se rassemblent va créer deux fichiers appelés un trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt et un autre log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt dans la résultats/TrackingPackage/titresde répertoire. La première contient 1) l’indice de la place, 2) le type de mouvement, 3) l’endroit premier moment, 4) l’intensité, D 5)1-4 et 6) le numéro de région dans le masque. Ce fichier peut être lu à partir d’Excel.

Un résumé de tous les fichiers générés à l’aide de ce protocole est illustré à la Figure 2. Autres analyses qui peuvent être effectuées à l’aide de ce protocole comprend la comparaison des paramètres dynamiques de taches plus petites vs, c'est-à-dire des oligomères de vs monomères, variations sur ces paramètres dynamiques induites par les ligands, inhibiteurs, composition de la membrane, modification de la signalisation des voies, etc.. En utilisant ce protocole13a effectué une analyse complète du comportement CXCR4 en réponse à son ligand CXCL12 dans différentes conditions expérimentales.

Figure 1
Figure 1 : Cellule tri. Expression de la GFP dans des cellules Jurkat transfectées avec CXCR4-AcGFP avant et après le tri cellulaire. Les cellules exprimant des niveaux faibles de GFP (GFPfaible) sont sélectionnés et utilisés pour des expériences de la FRBR.

Figure 2
Figure 2 : Sommaire des fichiers générés. La figure montre tous les fichiers générés à l’aide de la routine Matlab décrite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Classification des trajectoires. Nombre de différents types de trajectoires correspondant aux cellules traitées à différents stimuli. (A) pourcentage de spots immobiles, (B) pourcentage des trajectoires longues et (C) type de mouvement des trajectoires longues.

Figure 4
Figure 4 : Coefficient de diffusion, intensités spots moyennes et nombre de récepteurs par particule. (A) Distribution des valeurs courtes diffusion coefficients (D1-4) pour chaque place en réponse à différents stimuli (I, II, II, IV et v). La ligne rouge représente la valeur médiane pour D1-4. (B) les valeurs de moyenne intensité spot (msi) pour chaque point le long de ses 20 premiers cadres en réponse à différents stimuli (I, II, II, IV et v). La ligne rouge représente la valeur d’intensité moyenne (SD). (C) pourcentage de récepteurs/particule comme extrait de répartition de l’intensité des particules individuelles, en prenant comme largeur bin la valeur d’intensité de protéine monomérique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : Ouverture d’un fichier TIRFM dans les îles Fidji ou ImageJ. Options qui apparaissent sur la fenêtre de Bio-formats à glisser / déposer une vidéo de .lif. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre. 

Supplémentaire Figure 2 : Sélectionnez la série. Des images présentent dans la vidéo de .lif. Fenêtre (A) qui permet la sélection de la série à être analyser, y compris les images multicanaux. (B) exemple de résultat de la sélection de série, y compris image multicanal (à gauche) et correspondant vidéo (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre. 

Supplémentaire Figure 3 : Fractionner des chaînes. (A) fenêtre capture des commandes ImageJ nécessaire pour la séparation des canaux d’une image multicanal et (B) exemple de résultat du canal partagé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 4 : Fusion de chaînes. (A) fusion des canaux différents en une seule image. (B) la sélection pour la fusion de canal. (C) exemple de résultat de la fusion de canal. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 5 : Synchroniser windows. Localisation (A) dans le menu ImageJ des commandes requises pour la synchronisation de l’image et la fenêtre qui apparaît (B). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 6 : Sélectionnez la zone concernée. (A) sélection de la fenêtre d’intérêt à l’aide de l’outil de sélection rectangulaire et le résultat (B) de la culture de l’image. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 7 : Enregistrer la vidéo. Sauver la région d’intérêt comme une séquence d’images et de paramètres pour l’enregistrer comme fenêtre de séquence d’Image. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 8 : Segmentation. (A) ouvrir le plugin editor de Segmentation dans le menu plugins de la ImageJ. (B) ajouter des étiquettes/des matériaux pour la segmentation. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 9 : Conception du masque. (A) sélection des étiquettes appropriées et définition du masque vert. (B) sélection du masque rouge. Exemple de deux masques correspondant à deux étiquettes. (C) enregistrer les masques au format .tiff. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 10 : Répertoire de travail de MATLAB. Sélection du répertoire correct contenant la série pour être analysés. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 11 : U-piste menu principal. (A) sélection de films, édition de film (B) et (C) des menus de réglages des canaux. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 12 : Sélectionnez le type d’objet à suivre. Sélectionnez suivi de particules unique. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 13 : Détection des particules. (A) U-piste, panneau de configuration. (B) exemple de réglages pour la détection des particules. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 14 : Exemple de résultats pour la détection de particules. Fenêtres différentes qui incluent un menu visualisation, menu options cinéma et le film. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 15 : Menu de suivi. Exemple de paramètres. Suivi de (A), (B) réglage - cadre à cadre liant et (C) la fracture sociale fermeture, fusion et fractionnement des menus. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 16 : Exemple de résultats pour suivi de particules. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 17 : Menu de piste de l’analyse. Exemple de paramètres. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 18 : Vérification de l’analyse de morceaux. Écran affiché après l’analyse de morceaux, dont une fenêtre de la vidéo montrant les particules détectées et leurs pistes correspondantes. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 19 : Calcul des coefficients de diffusion. Histogrammes des coefficients de diffusion calculés (à gauche) et la moyenne quadratique de déplacement (MSD, droit). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 20 : Calcul des coefficients de diffusion, y compris les modes de montage différent. Histogrammes des coefficients de diffusion calculés (à gauche) et la moyenne quadratique de déplacement (MSD, droit) pour le modèle clos. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 21 : Profils d’intensité. Exemple de spot intensité le long de sa trajectoire (ligne bleue) et fond (ligne rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Supplémentaire Figure 22 : Fond pour chaque image. Gauche : Image échantillon cellulaire. Au milieu : Détecté automatiquement la cellule. Droite : Zone sélectionnée automatiquement en arrière-plan. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.

Vidéo supplémentaire 1 : Exemple d’une microscopie vidéo FRBR typique, montrant la présence de particules avec des intensités différentes et de types de mouvements. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger la vidéo.

Matériel supplémentaire 1 : Fichiers contenant tous les scripts de protocole employés dans les routines ad hoc utilisées pour la classification des trajectoires et l’analyse de la taille de cluster. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger le matériel.

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Discussion

La méthode décrite est facile à réaliser, même sans avoir aucune expérience antérieure de travail avec Matlab. Toutefois, les routines Matlab exigent extrêmement précision avec la nomenclature des différentes commandes et la localisation des différents dossiers utilisés par le programme. Dans le suivi routine d’analyse (étape 3), plusieurs paramètres peuvent être modifiés. La fenêtre « Réglage mélange gaussien modèle convenable » (étape 3,8) contrôle comment U-track permet de détecter des particules unique sur la vidéo. Cela se fait en ajustant un modèle de mélange gaussien tel que décrit dans3. L’un des paramètres clés pour ce montage définit un filtre afin de faciliter l’identification des maxima locaux. Le succès de cette opération dépend le contraste de l’image et le bruit dans les images. Le premier paramètre (valeur Alpha pour la comparaison avec le contexte local) contrôle la confiance des maxima étant une place réelle, tandis que le deuxième permet de réduire le bruit lors de l’identification des points. Les paramètres importants à l’étape de « Tracking » (3.9) sont le nombre d’images à combler les écarts (c’est qu'une piste pouvant couvrir plus de cadres dans lequel la particule n’est pas réellement vu, mais on le voit devant ces images et après ces cadres ; dans l’exemple, 0) et le nombre d’images qui doit s’étendent sur une piste pour être considéré comme une voie de succès (dans notre exemple, 20 ; ce paramètre est lié à la vitesse d’acquisition de caméra et les trames de numéro dans la voie doivent être telle qu’elle permet le calcul de la diffusion de co efficace). Il est aussi important de décider s’il faut fusionner et fractionner des segments (dans l’exemple de que ces deux possibilités ont été choisies). Puis, les paramètres pour l’étape 1 dans les fonctions de coût (image à image reliant) doivent être définis. Cette fonction contrôle la façon dont les particules sont suivis le long les cadres. Les paramètres les plus importants à ce stade est le choix du rayon de recherche Brownienne, qui contrôler dans quelle mesure chaque tache est censée être dans la section suivante. Dans notre exemple nous avons choisi 0 et 5 limites inférieure et supérieure, respectivement. Notez que ces paramètres sont très spécifiques à la nature des particules étant l’objet d’un suivi, et qu’ils pourraient avoir à accorder dans chaque cas concret. Particulièrement importante sont la puissance mise à l’échelle dans le brownien et linéaire recherche des rayons. Ces pouvoirs d’échelle dépendent du type de mouvement des particules (diffusion libre ou restreint). Dans l’exemple, les valeurs (0.5, 0,01) ont été choisis gratuite de diffusion. Pour la documentation spécifique de ces paramètres, voir3.

Dans le calcul de la commande de coefficients de diffusion (étape 4.4), la limite supérieure du coefficient de diffusion de particules immobiles peut être connue des expériences antérieures ou en exécutant la fonction calculateDiffusion sur un projet séparé avec immobile particules (protéine fluorescente monomère purifiée) et en voyant les coefficients de diffusion signalés. Cette fonction prend deux paramètres supplémentaires : « outputSuffix´, qui est ajouté pour les noms de fichier de sortie par défaut prend la valeur empty, et ' plotLength´, qui par défaut est le 13 et le nombre de décalage dans le temps (secondes) dans lequel est effectué le calcul de la diffusion. Le mode de montage « alpha » implique un ajustement de la TMS à la courbe

Equation 1

Autrement dit, un offset (MSD0) et une fonction de la puissance du temps lag. L’exposant de cette fonction de puissance, Equation 2 , détermine si le mouvement est limité (0 < α < 0,6), anormal (0,6 < α < 0,9), libre (0,9 < α < 1.1), ou réalisé (α > 1.1). Une révision de ce type d’analyse on se reportera à Manzo Al.9

Le calcul des coefficients diffusion4 produit deux figures de sortie (voir supplément Figure 19). Le premier montre un histogramme de la diffusion coefficients calculés (note qu’à ce stade, il y a un coefficient de diffusion indépendante pour chaque trajectoire). La moyenne et le percentile 95 % de ces coefficients apparaissent dans la console de Matlab. Le deuxième indique la MSD (courbe rouge) et le nombre d’étapes considérées comme de la calculer en fonction du décalage dans le temps pour ces trajectoires considéré comme mobile (ceux dont coefficient de diffusion est supérieur au seuil donné dans la ligne de commande). La moyenne et l’écart des trajectoires mobiles est calculé (ce sont les valeurs pour les trajectoires dans une seule cellule). Dans l’exemple, l’exposant est 0,59 sens que le mouvement est limité. Pour cet ajustement de la courbe, le programme signale l’incertitude associée à chacun des paramètres (représenté par l’écart-type de chacun) et la qualité de l’ajustement (parfaitement atteindrait zéro). À ce stade et après avoir vérifié la valeur d’alpha, nous pouvons décider pour s’adapter à la MSD avec une fonction différente :

Equation 3    Si 0 < α < 0,6 (limité)

Equation 4Si 0,9 < α < 1.1 (gratuit)

Equation 5Si α > 1.1 (réalisé)

Trajectoires anormales ne peut pas être équipés d’une fonction différente. Dans le cas de particules clos, vous pouvez calculer la taille de confinement (en microns) comme Destainville et al.,14

Equation 6

Un bon indicateur d’un montage correct est que la qualité de l’ajustement devrait diminuer de l’alpha pour le montage final (dans l’exemple, la bonté fit tombe de 0.30474 à 0.15749, supplémentaire Figure 19-20). calculateDiffusioncreates deux fichiers dans le « results\TrackingPackage\tracks » dans le répertoire de série appelé «diffusionCoefficients.txt» et «diffusionCoefficientsMobile.txt». Ces fichiers contiennent trois colonnes : 1) l’indice de chaque entrée de trajectoire, 2) leur coefficient de diffusion correspondants, 3) la région majoritaire dans le masque où cette piste appartient à (les régions sont obtenues à partir du fichier « mask.tif » que nous avons généré en étapes 2.7 ; Si ce fichier n’existe pas, puis cette colonne n’est pas présente). Vous pouvez utiliser ce fichier et les fichiers analogues générés pour les autres cellules pour analyser la distribution du coefficient de diffusion pour un ensemble de cellules dans des conditions expérimentales similaires.

Dans le calcul du coefficient de diffusion pour les trajectoires courtes (étapes 4.7-4,8), le dernier paramètre « Court » est un suffixe ajouté au nom du fichier de sortie afin que vous pouvez analyser différents sous-ensembles de trajectoires sans écraser le diffusionCoefficients.txt fichiers. Le nom réel des fichiers de sortie est « diffusionCoefficients < suffixe > .txt » et « diffusionCoefficientsMobile < suffixe > .txt ». Si aucun suffixe n’est donné, comme dans l’analyse générale effectuée ci-dessus, puis un suffixe vide est supposé. Les paramètres du modèle (0D, v et TMS) peuvent différer de ceux montés sur toutes les trajectoires. Plus remarquable, la déviation standard des paramètres ainsi que l’ajustement normalement augmenter. La raison est que les trajectoires courtes sont plus instables et un raccord fiable est plus difficile.

L’analyse des trajectoires longues (étape 4,9) classez-les dans clos (1), gratuit (2), ou dirigée (3) selon leurs premiers instants et sa situation en ce qui concerne les percentiles de 2,5 et 97,5 % du premier instant de 500 chemins au hasard avec le mouvement brownien, la même coefficient de diffusion et de la longueur de la trajectoire étant analysé et simulation de Monte Carlo. Si les premiers instants de la trajectoire analysée est inférieure à la 2,5 % des premiers instants observées dans les simulations, le chemin d’accès à l’étude est considérée comme limitée. Si elle est supérieure à la 97,5 % des premiers instants simulées, elle est classée selon les directives ; dans le cas contraire, le chemin d’accès est classé comme Brownienne. Dans la commande des employés, des 113.88e-3 est la taille du pixel en µm, 0,0015 est la limite supérieure du coefficient de diffusion des spots immobiles mesurée en µm2/s et « Long » est le suffixe pour le nom du fichier de sortie. La première colonne de ce fichier («trajectoryClassificationLong.txt») est le numéro de trajectoire, la seconde est sa classification (1 = confinée, 2 = gratuit, 3 = réalisé), et la troisième est la trajectoire premier moment.

Le script de calcul de l’intensité de chaque particule (étape 5.1) est très flexible et permet un suivi précis de différentes manières les intensités de fluorescence (chacun est bien adapté pour différentes situations comme des taches immobiles d’une expérience de contrôle de suivi ou suivi des taches très mobiles sur une cellule avec fond fluorescent variable). Le script va analyser toutes les trajectoires le long de toutes les trames. Pour chaque place à chaque image, il va mesurer l’intensité des pixels autour de l’endroit (il analyse un patch carré autour de la tache, par défaut d’une taille de 3 x 3 pixels), estimer la tache de fond et calculer la différence de fluorescence entre le spot et le arrière-plan. De cette façon, on peut estimer le pourcentage de particules photobleaching et le nombre de particules fluorescentes dans un cluster unique, considérée comme une seule tache.

Cette méthode automatisée (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) produit des informations sur plusieurs paramètres (intensité spot, diffusion latérale, type de mouvement), qui permettent d’étudier la relation entre la taille du spot et sa dynamique en conditions basales, et comment les différents traitements peuvent modifier ces paramètres.

La principale limite de la méthode est qu’elle nécessite la transfection de cellules avec la protéine fluorescente à suivre. Transfection mène habituellement à la surexpression de la protéine, ce qui entrave la seule protéine suivi. Une cellule à l’étape de tri doit être incluse pour sélectionner les cellules exprimant un certain nombre de récepteurs qui permettent la détection et le suivi des particules unique par microscopie SPT-FRBR. Cette méthode pourrait également être employée pour le suivi des biomolécules étiquetés avec des boîtes quantiques ou fragments Fab. Le protocole décrit nécessite un certain nombre de contrôles qui doivent être analysés précédemment afin de s’assurer que les conclusions de l’analyse sont correctes. Tout d’abord, il est essentiel de déterminer les conditions d’expression appropriés qui permettent la détection et la poursuite des particules unique. Films avec des densités de ~ 4,5 particules/µm2, correspondant à 8 500-22 000 récepteurs/cellule, ont été utilisées pour analyser l’organisation spatio-temporelle de la membrane cellulaire du récepteur13.

Il est important d’établir le coefficient de diffusion détectable minimale à l’aide de protéines purifiées à AcGFP monomères ou des cellules fixées. Dans les deux cas, on présume qu’il n’y a aucune diffusion et c’est pourquoi nous estimons que les valeurs de la diffusion de particules analysées dans ces conditions correspondent à des particules immobilisées et utilisée pour distinguer les trajectoires mobiles et immobiles,13.

L’analyse que nous présentons ici est un outil d’analyse de trajectoire générales, qui peut être appliqué à l’analyse de la diffusion des récepteurs par superrésolution et à l’analyse des images de diffraction limitée à l’analyse du mouvement cellulaire au microscope standard . Le principal avantage de cette méthode avec d’autres décrites précédemment, telles que l’analyse du nombre et la luminosité11, est qu’il permet d’évaluer les valeurs de la densité moyenne de chaque spot individuel le long de sa trajectoire, en tenant compte du temps de survie de la protéine monomérique AcGFP avant Photoblanchiment. Le temps de survie d’une molécule avant Photoblanchiment dépendra fortement des conditions d’excitation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à Carlo Manzo et Maria García Parajo pour leur aide et le code source de l’analyse de coefficient de diffusion. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du ministère espagnol de la Science, l’Innovation et des universités (SAF 2017-82940-R) et le programme RETICS de l’Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 et RD16/0012/0006 ; RIER). LMM et JV sont pris en charge par le programme COMFUTURO de la Fundación General CSIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

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Immunologie et Infection numéro 146 SPT récepteurs de chemokine tracking grappes diffusion logiciel d’analyse
Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence
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