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Immunology and Infection

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली रिसेप्टर्स के प्रसार और क्लस्टर आकार के विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एकल कण ट्रैकिंग छवि विश्लेषण है कि प्रसार गुणांक, गति और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया कणों के क्लस्टर आकार के प्रकार के मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

कण एक वीडियो अनुक्रम पर नज़र रखने और उनके प्रक्षेप के पीछे विश्लेषण आजकल कई जैविक अध्ययनों में एक आम ऑपरेशन है । एक मॉडल के रूप में सेल झिल्ली रिसेप्टर क्लस्टर्स के विश्लेषण का उपयोग करना, हम इस छवि विश्लेषण कार्य के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान फिजी का उपयोग कर (ImageJ) और Matlab दिनचर्या के लिए: 1) ब्याज और डिजाइन इन क्षेत्रों के लिए अनुकूलित मास्क के क्षेत्रों को परिभाषित; 2) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वीडियो में कणों को ट्रैक; 3) चयनित पटरियों के प्रसार और तीव्रता विशेषताओं का विश्लेषण. प्रसार गुणांक का मात्रात्मक विश्लेषण, गति के प्रकार, और क्लस्टर आकार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण द्वारा प्राप्त एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करने के लिए चाहिए निर्धारित कण गतिशीलता और संशोधित करने के परिणाम पर्यावरण की स्थिति । इस लेख में हम इन सुविधाओं के विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यहां वर्णित विधि न केवल एकल अणु ट्रैकिंग का पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी कोशिका झिल्ली पर पार्श्व प्रसार मापदंडों का अनुमान automates, प्रक्षेपवक्र के प्रकार वर्गीकृत और पूरा विश्लेषण इस प्रकार पर काबू पाने की अनुमति देता है सेल झिल्ली पर अपने पूरे प्रक्षेपवक्र पर हाजिर आकार बढ़ाता में कठिनाइयों ।

Introduction

लिपिड बिलयर में एम्बेड किए गए झिल्ली प्रोटीन थर्मल विसरण के कारण लगातार आवाजाही में हैं । उनकी गतिशीलता के लिए सेल प्रतिक्रियाओं को विनियमित आवश्यक हैं, के रूप में अंतराआण्विक बातचीत परिसरों कि मोनोमर से oligomers के आकार में बदलती है और संकेतन परिसरों की स्थिरता को प्रभावित करने की अनुमति देते हैं । प्रोटीन गतिशीलता को नियंत्रित करने के तंत्र को स्पष्ट करना इस प्रकार सेल जीव विज्ञान में एक नई चुनौती है, संकेत पारक्रमण रास्ते को समझने के लिए और अप्रत्याशित सेल कार्यों की पहचान करने के लिए आवश्यक है ।

कुछ ऑप्टिकल विधियों को जीवित कोशिकाओं1में इन बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । इन के अलावा, कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी, 1980 के दशक में विकसित की है, पर या बहुत सेल झिल्ली2के पास आणविक बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है । जीवित कोशिकाओं में TIRF डेटा से प्राप्त झिल्ली प्रोटीन प्रक्षेपणों के गतिशील मापदंडों का अध्ययन करने के लिए, एक एकल कण ट्रैकिंग विधि (SPT) की आवश्यकता है । हालांकि कई एल्गोरिदम इस के लिए उपलब्ध हैं, हम वर्तमान में jaqaman एट अल.3 द्वारा प्रकाशित उन का उपयोग करें कि पता कण गति विविधता एक घने कण क्षेत्र में लगातार फ्रेम के बीच कणों को जोड़ने के लिए परिणामी ट्रैक कनेक्ट द्वारा खंडों में पूर्ण प्रक्षेप पथ (अस्थाई कण गायब) । सॉफ्टवेयर कण विलय और बंटवारे कि एकत्रीकरण और वियोजन घटनाओं3से परिणाम पर कब्जा । इस सॉफ्टवेयर के आउटपुट डेटा में से एक पूरे प्रक्षेपवक्र के साथ कणों का पता लगाने के प्रत्येक फ्रेम में अपने एक्स और वाई पदों को परिभाषित कर रहा है ।

एक बार कणों का पता चला रहे हैं, हम कम timelag प्रसार गुणांक (डी1-4)4,5का निर्धारण करने के लिए विभिन्न एल्गोरिदम लागू होते हैं । पल स्केलिंग स्पेक्ट्रम (MSS)6,7,8 विश्लेषण लागू करके या वक्र9के लिए मतलब वर्ग विस्थापन (msd) के समायोजन द्वारा ' अल्फा ' मूल्य फिटिंग करके, हम भी अनुसार कणों को वर्गीकृत प्रक्षेप पथ का प्रकार ।

प्रतिदीप्ति छवियों में हाजिर तीव्रता का विश्लेषण10,11क्षेत्र में वैज्ञानिकों के लिए एक साझा उद्देश्य है । सबसे आम इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म तथाकथित संख्या और चमक है । यह विधि फिर भी मोबाइल अंश में कणों में सही फ़्रेम-दर-फ़्रेम तीव्रता का पता लगाने की अनुमति नहीं देता है । हम है, इस प्रकार, एक नया एल्गोरिथ्म इन कण तीव्रता फ्रेम-दर-फ्रेम का मूल्यांकन करने के लिए और उनके एकत्रीकरण राज्य का निर्धारण करने के लिए उत्पंन । एक बार प्रत्येक कण के निर्देशांक U-Track2 सॉफ्टवेयर3का उपयोग कर का पता लगाया है, हम प्रत्येक फ्रेम में अपनी तीव्रता को परिभाषित पूरा प्रक्षेपवक्र पर, भी खाते में प्रत्येक फ्रेम में सेल पृष्ठभूमि ले रही है । इस सॉफ्टवेयर अलग संभावनाएं प्रदान करता है स्पॉट तीव्रता और सेल पृष्ठभूमि का निर्धारण करने के लिए और, संदर्भ के रूप में ज्ञात एकलक और dimeric प्रोटीन का उपयोग कर, कण में प्रोटीन की अनुमानित संख्या की गणना (क्लस्टर आकार) का पता लगाया ।

इस आलेख में, हम इन तीन चरणों को पूरा करने के लिए एक सावधानीपूर्वक मार्गदर्शिका का वर्णन करते हैं: 1) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यू-ट्रैक के वीडियो के साथ एकल कणों का पता लगाना और ट्रैकिंग करना; 2) तात्कालिक प्रसार गुणांक (डी1-4) उन कणों का विश्लेषण और आंदोलन के प्रकार (सीमित, नि: शुल्क, या निर्देशित) द्वारा लंबे प्रक्षेप के साथ कणों की MSS; 3) प्रत्येक स्थान के लिए अनुमानित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति द्वारा सही वीडियो के साथ हाजिर तीव्रता को मापने. यह क्लस्टर आकार अनुमान और photoब्लीचिंग चरणों की पहचान की अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए विशेष कौशल की आवश्यकता नहीं है और कोशिका संस्कृति, प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी सुविधाओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है । प्रोटोकॉल ImageJ या फिजी का उपयोग करता है (ImageJ12का एक वितरण), U-ट्रैक3, और कुछ तदर्थ मेड दिनचर्या (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) । यू ट्रैक और तदर्थ दिनचर्या मतलब है कि किसी भी संगत कंप्यूटर में स्थापित किया जा सकता है पर चलाते हैं ।

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Protocol

1. जैविक नमूनों की तैयारी

  1. 10% FCS, NaPyr और एल-ग्लूटामिन (पूर्ण RPMI) के साथ RPMI १६४० मध्यम पूरक में जूरकट कोशिकाओं को विकसित. एक एकलक gfp-लेबल chemokine रिसेप्टर वेक्टर (CXCR4-acgfp, 20 μg) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर इसकी पहचान की अनुमति देने के साथ (20 x 106 कोशिकाओं/10% FCS के साथ rpmi १६४० के 400 μl)
    नोट: यह अन्य मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे कि mCherry, मकारलेट, आदि का उपयोग करने के लिए संभव है ।
  2. एक प्रवाह cytometer में कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए दोनों सेल व्यवहार्यता और CXCR4-AcGFP अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के बाद 24 h ।
  3. सेल द्वारा कम CXCR4-AcGFP स्तरों को व्यक्त करने वाले कक्षों का चयन करें GFPकम सकारात्मक कोशिकाओं की छंटाई (चित्रा 1), के रूप में transfected रिसेप्टर की कम अभिव्यक्ति tirfm प्रयोगों में आवश्यक है क्रम में एकल कण ट्रैकिंग के लिए सुनिश्चित करने के लिए व्यक्ति ट्रेसिंग प्रक्षेक9.
  4. सेल की सतह में रिसेप्टर्स की संख्या का परिमाण ।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में13, ~ ८,५००-२२,००० AcGFP-लेबल रिसेप्टर्स/सेल, के अनुरूप ~ 2-४.५ कणों/
  5. Resuspend पूर्ण RPMI और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2में कम से 2 एच के लिए सेते में छांटे गए कक्षों । सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं (३०० x जी, 5 मिनट), और उंहें tirf बफर (hbss, 25 मिमी hepes, 2% FCS, पीएच ७.३) में सस्पेंड ।
    1. थाली पर ३५ मिमी ग्लास-तली microwell व्यंजन (2-3 एक्स 105 सेल/) fibronectin के साथ लेपित (20 μg/mL, 1 एच, ३७ डिग्री सेल्सियस) उचित संलग्नी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में (यानी, CXCL12, १०० एनएम, 1 एच, ३७ डिग्री सेल्सियस). सेते सेल (३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट, 5% सह2) छवि अधिग्रहण से पहले ।
  6. एक TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रयोगों प्रदर्शन, एक EM-सीसीडी कैमरा, एक 100x तेल विसर्जन उद्देश्य (HCX PL एपीओ 100x/ खुर्दबीन तापमान नियंत्रण और सीओ2के साथ ऊष्मायन की अनुमति देता है । पता लगाएँ और मोटे और ठीक ध्यान knobs के साथ कोशिकाओं को फोकस, प्रकाशविरंजन प्रभाव को कम करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग. TIRF मोड में ठीक फोकस समायोजन के लिए एक कम लेजर तीव्रता का उपयोग करें, एकल कण का पता लगाने के लिए अपर्याप्त या photoब्लीचिंग प्रभाव पैदा करने के लिए (5% लेजर शक्ति, 28 μW) ।
  7. फिल्मों के अधिग्रहण (छवि दृश्यों) लगभग ५० s फ्रेम के बीच समय अंतराल को ंयूनतम । एवंसेंट क्षेत्र की पैठ गहराई के 70-90 एनएम होना चाहिए । ". Lif" (वीडियो. lif) के रूप में प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए अधिग्रहीत फिल्मों को बचाओ ।
    नोट: वर्णित उदाहरण में चलचित्र ४९% पर लेज़र पावर (2 मेगावाट) पर ९० ms का एक्सपोज़र समय के साथ, और ४९ s (५०० फ़्रेम) के लिए ९८ ms, के समय अंतराल पर प्राप्त किए गए थे । चयनित एवंसेंट वेव के प्रवेश ९० एनएम था ।

2. छवियों और मास्क के निर्माण का चयन

  1. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (वीडियो. lif) के लिए, प्रत्येक श्रृंखला के लिए अलग फ़ोल्डर्स होना चाहिए एक नया फ़ोल्डर (VideoName) बनाएँ । प्रत्येक फ़ोल्डर वीडियो छवियों और विश्लेषण के परिणामों के लिए एक "परिणाम" फ़ोल्डर के लिए एक "videoSeq" फ़ोल्डर शामिल होंगे । सुनिश्चित करें कि इस समय फ़ाइल संरचना निंन है:
    VideoName/वीडियो. lif
    विडियोनामे/Series1/Videoseq
    VideoName/Series1/परिणाम
    नोट: माइक्रोस्कोप से अलग. lif फ़ाइलें हर इलाज की स्थिति के लिए कई वीडियो के साथ प्राप्त कर रहे है (यानी एफ एन, एफ एन + SDF) । "वीडियो. lif" सभी TIRF फिल्मों अधिग्रहण (श्रृंखला) माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन के साथ इनपुट. lif वीडियो फ़ाइल से मेल खाती है । "Videoseq" फ़ोल्डर फिल्म है कि हम विश्लेषण कर रहे हैं की ५०० फ्रेम में शामिल होंगे । "परिणाम" फ़ोल्डर विश्लेषण प्रदर्शन से उत्पंन सभी फ़ाइलें शामिल होंगे । सटीक नामकरण और अलग फ़ोल्डर्स के स्थानीयकरण एल्गोरिदम के सही समारोह के लिए आवश्यक हैं । ऊपर की सूची में बोल्ड में नाम तय कर रहे है (यानी, वे इस तरह से कहा जा सकता है क्योंकि इन लिपियों द्वारा मांगे गए नाम हैं) । प्रदर्शन को दर्शाने के लिए बोल्ड में नहीं नाम बदल सकते हैं ।
  2. फिजी मेनू बार पर फ़ाइल को खींचकर और छोड़ने के द्वारा फ़िजी या imagej के साथ tirfm वीडियो (. लिफ फ़ाइल) खोलें और bioformats (अनुपूरक चित्रा 1) का उपयोग कर लिफ फ़ाइल को आयात करने के लिए ठीक पर क्लिक करें ।
  3. प्रक्रिया करने के लिए श्रृंखला का चयन करें और ठीक पर क्लिक (पूरक चित्रा 2a) । इस वीडियो के विश्लेषण के लिए एक मुखौटा डिजाइन करने के लिए, अलग chromophores के साथ भी एक मल्टीचैनल छवि आयात (उदाहरण में, श्रृंखला 1 मल्टीचैनल छवि और श्रृंखला 2 इसी वीडियो है) । वीडियो (और मल्टीचैनल छवि) एक imagej ढेर के रूप में खुला होना चाहिए । उदाहरण में (पूरक चित्रा 2B), छवि बाईं ओर है और वीडियो दाईं ओर है ।
    नोट: वीडियो के लिए एक मास्क के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, तो चरण २.५ पर जाएँ ।
  4. एक मुखौटा बनाएं । मुखौटा के डिजाइन के लिए उपयोगी चैनलों के साथ एक एकल छवि बनाएँ । इस मामले में, दिलचस्प चैनल लाल, हरे और ग्रे वाले हैं ।
    1. मल्टीचैनल छवि (अनुपूरक चित्रा 3A) से चैनल विभाजित: बार मेनू में छवि का चयन करें और रंग । विभाजित चैनल। विभिन्न चैनल अलग चित्र (अनुपूरक आंकड़ा 3 ख) के रूप में प्रदर्शित होंगे ।
    2. फिर से एक ही छवि में तीन चैनलों (पूरक चित्रा 4a) विलय: बार मेनू में छवि का चयन करें और रंग का चयन करें । चैनल्स मर्जकरें । उपयुक्त चैनल का चयन करें और ठीक दबाएँ (पूरक चित्रा 4b). एक नई गैर-स्टैक्ड छवि जनरेट किया जाएगा (पूरक चित्रा 4C) ।
    3. सिंक्रनाइज़ windows उपकरण (पूरक चित्रा 5a) का उपयोग करके दो windows सिंक्रनाइज़: बार मेनू में विश्लेषण का चयन करें । उपकरण । Windows सिंककरें । छवि सिंक्रनाइज़ संभावनाओं के साथ एक नई विंडो (पूरक चित्रा 5B) दिखाया जाएगा ।
    4. दो windows सिंक्रनाइज़ के साथ (केवल वीडियो यदि कोई मल्टीचैनल छवि संबद्ध नहीं है), दोनों windows में एक ही क्षेत्र फसली किया जा सकता है । इमेजेज फ्लोटिंग मेनू के आयताकार चयन टूल के साथ रुचि के क्षेत्र को ड्रा करें । पट्टी मेनू में छवि का चयन करें और फसल का चयन करें (पूरक चित्रा 6a) । दो फसली छवियां व्यक्तिगत रूप से (पूरक चित्रा 6B) दिखाएगा ।
    5. सिंक्रनाइज़ windows प्रबंधक में सभी अनसिंक्रनाइज़ करें बटन दबाकर Windows (पूरक चित्रा 6B) दोनों को अनसिंक्रोनाइज़ ।
  5. यदि कोई मास्क चरण २.४ के रूप में नहीं बनाया गया है, तो अस्थिर मेनू की ImageJ के आयताकार चयन उपकरण के साथ रुचि का क्षेत्र आरेखित करें ।
  6. निर्देशिका Videoseq में एक छवि अनुक्रम के रूप में इसी वीडियो निर्देशिका के तहत वीडियो सहेजें (पूरक चित्रा 7a): बार मेनू में फ़ाइल का चयन करें और इस रूप में सहेजें । छवि अनुक्रम... . video0000 के रूप में वीडियो अनुक्रम के लिए लेबल्स का नाम बदलें. tif, video0001. tif,..., video0499. tif (पूरक चित्रा 7b) : नाम बॉक्स में, वीडियो के रूप में नाम बदलें और ठीकक्लिक करें । अनुक्रम को सफलतापूर्वक यू-ट्रैक द्वारा उपयोग किया जा करने के लिए अपनी निर्देशिका में अकेले होना चाहिए ।
    नोट: यदि वीडियो के लिए कोई मास्क डिज़ाइन नहीं कर रहा है, तो चरण २.८ पर जाएं ।
  7. एक मुखौटा डिजाइन । मल्टीचैनल छवि का चयन करें और फॉल्ट संपादक प्लगइन खोलें (पूरक चित्रा 8A): बार मेनू में Plugins का चयन करें और विभाजन का चयन करें । विभाजन संपादक । फॉल्ट संपादक (पूरक चित्रा 8B, सी) के लेबल पर दायां क्लिक करके आवश्यक के रूप में विभाजन के लेबल जोड़ें और नाम बदलें ।
    1. ImageJ फ्लोटिंग मेनू में उपयुक्त चयन उपकरण चुनें (यहां, freehand का उपयोग करें), एक लेबल का चयन करें (हरा) और डिजाइन पहले सबसे बाहरी मुखौटा (पूरक चित्रा 9A) । एक बार डिजाइन, संयुक्त खिड़की के चयन विकल्प में + बटन दबाएँ, और चयनित मुखौटा दर्शक पर प्रदर्शित किया जाएगा (पूरक चित्रा 9a). अगले लेबल के साथ इस चरण को दोहराएं (इंटीरियर, लाल रंग में) (पूरक चित्रा 9B) ।
      नोट: हरे और इंटीरियर लेबल के लिए मुखौटा डिजाइन करने के बाद, बाहरी मुखौटा छवि के बाकी पर कब्जा होगा ।
    2. मास्क क्षेत्र 0, 1, 2, के रूप में छवि में कोडित रहे हैं... RGB लेबल विंडो में लेबल्स के क्रम के अनुसार । जब विभिंन लेबल्स के लिए सभी मास्क डिज़ाइन किए जाते हैं, तो नाम मास्क के साथ, वीडियो के रूप में एक ही फ़ाइल नाम के साथ मास्क को सहेजें । tif (पूरक चित्रा 9c): बार मेनू में फ़ाइल का चयन करें और के रूप में सहेजें का चयन करें । झगड़ा....
      नोट: चयनित मास्क प्रसार गुणांक और प्रक्षेप-पथ के वर्गीकरण की गणना में नियोजित किया जाएगा (चरण ४.२ देखें) ।
  8. जांचें कि इस समय फ़ाइल संरचना निंन है:
    VideoName/वीडियो. lif
    VideoName/Series1/ मास्क. tif
    VideoName/Series1/ Videoseq/video0000. tif
    VideoName/Series1/ Videoseq/video0001. tif
    ...
    VideoName/Series1/ Videoseq/video0499. tif
    VideoName/Series1/ परिणाम
    नोट: मुखौटा. tif कदम २.४ और २.७ में डिजाइन के रूप में मुखौटा के साथ एक छवि है । Video*. tiff कदम २.६ में सहेजा गया के रूप में वीडियो है । उपर्युक्त के अनुसार, उपरोक्त सूची में बोल् ड में नाम तय किए जाते हैं, यानी उन् हें इस तरह से बुलाया जाना होता है क् योंकि इन लिपियों द्वारा मांगे गए नाम हैं । प्रदर्शन को दर्शाने के लिए बोल्ड में नहीं नाम बदल सकते हैं ।

3. कणों ट्रैकिंग

  1. यू ट्रैक का उपयोग कर चयनित वीडियो में देखा सभी कणों को ट्रैक ।
  2. खुला Matlab और पथ के लिए सेट पथ का उपयोग करके U-ट्रैक निर्देशिका जोड़ें । मेनू में सबफ़ोल्डर्स के साथ जोड़ें विकल्प । पथ को बचाने के लिए तो यह है कि Matlab यू ट्रैक के भविष्य में फांसी पथ में है । यह पथ सेटिंग केवल एक बार किए जाने की आवश्यकता है ।
  3. निर्देशिका श्रृंखला युक्त करने के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए कार्य निर्देशिका बदलें । कंसोल में टाइप करके यू ट्रैक आह्वान (पूरक चित्रा 10) movieselectorgui और प्रेस दर्ज करें. चलचित्र चयन विंडो खोली जाएगी (पूरक चित्रा 11a) ।
  4. नई चलचित्र बटन पर दबाएँ और चलचित्र संस्करण विंडो (पूरक चित्र 11b) दिखाई देगा ।
  5. वीडियो के साथ निर्देशिका का चयन करने के लिए जोड़ें चैनल पर प्रेस (VideoName/Series1/वीडियो) और फिल्म जानकारी पैरामीटर भरें । परिणाम के लिए U-ट्रैक के परिणाम के लिए आउटपुट निर्देशिका सेट करें (videoname/Series1/परिणाम) ।
    नोट: फिल्म की जानकारी के मापदंडों माइक्रोस्कोप और अधिग्रहण की स्थिति से प्राप्त किया जा सकता है ।
  6. उंनत चैनल सेटिंग्स पर प्रेस और अधिग्रहण से संबंधित मापदंडों को भरने । उदाहरण में पैरामीटर्स के मान देखें (पूरक आकृति 11C) ।
  7. उन्नत चैनल सेटिंग्स विंडो पर सहेजें दबाएँ और चलचित्र संस्करण विंडो पर सहेजें । कार्यक्रम के परिणाम निर्देशिका पर moviedata. mat नामक फ़ाइल लिखने की पुष्टि के लिए पूछना होगा । पुष्टि.
  8. चलचित्र बनाने के बाद, चलचित्र चयन विंडो में जारी रखें पर दबाएं । यू ट्रैक वस्तु के प्रकार के बारे में पूछने के लिए विश्लेषण किया जाएगा । एकल कणों का चयन (पूरक चित्रा 12). नियंत्रण कक्ष विंडो (पूरक आकृति 13A) दिखाई देगा ।
    1. प्रथम चरण चरण 1 का चयन करें : पता लगाना और सेटिंगपर दबाएँ. सेटिंग गाऊसी मिश्रण मॉडल फिटिंग खिड़की (पूरक चित्रा 13b) दिखाई देगा । उदाहरण में, "स्थानीय पृष्ठभूमि के साथ तुलना के लिए अल्फ़ा मान" ०.००१ और "रोलिंग-विंडो समय औसत" 3 (पूरक चित्रा 13B) करने के लिए सेट किया गया है ।
    2. पर प्रेस सेटिंग्स गाऊसी मिश्रण मॉडल फिटिंग विंडो में लागू करें और नियंत्रण कक्षमें चलाते हैं । पूरक चित्रा 13में विंयास के साथ, केवल पता लगाने कदम चलाता है । यह चरण कुछ (2-5) मिनट लेता है । चरण 1 (डिटेक्शन, पूरक आरेख 14) का परिणाम बटन दबाकर परिणामों की जांच करें ।
      नोट: जैसा कि ऊपर दिखाया गया है, चलचित्र पता लगाए गए कणों पर लाल वृत्त दिखाता है । कोई लाल वृत्त दिखाया गया है, तो यह चरण ठीक से काम नहीं किया है ।
  9. पटरियों की पहचान करने, कि है, पटरियों में पिछले कदम में पता लगाया कणों विलय कि कई फ्रेम अवधि । यह चरण 2: यू-ट्रैक जिनकी सेटिंग्स को पूरक चित्रा 15A-Cमें दिखाया गया है के रूप में परिभाषित किया जाना है की ट्रैकिंग है । फ्रेम-टू-फ्रेम लिंकिंग और गैप क्लोजिंग के लिए स्टेप 2 कॉस्ट फंक्शन सेटिंग्स, उदाहरण में विलय और विपाटन क्रमशः पूरक चित्र 15b और Cमें दर्शाए गए हैं ।
  10. चरण 2 के लिए पैरामीटर सेट करने के बाद , दबाएँ चलाएँ नियंत्रण कक्ष में और केवल चरण 2 रन (पूरक चित्र 16) ।
  11. ट्रैक विश्लेषण, चरण 3 निष्पादित करें । पूरक चित्रा 17 (सही पैनल) में दिखाया गया है के रूप में सेटिंग्स को परिभाषित करें. फिर, सेटिंग-मोशन विश्लेषण के पैनल में लागू प्रेस, और नियंत्रण कक्ष में चलाने -यू ट्रैक । यह चरण कुछ सेकंड लेता है ।
  12. प्रक्रिया सही रूप से सभी पटरियों की पहचान की है कि चरण 3 के परिणाम बटन के साथ सत्यापित करें । ऐसा करने के लिए, फिल्म विकल्प विंडो के शो ट्रैक संख्या पर क्लिक करें, और फ्रेम है कि प्रत्येक ट्रैक सही ढंग से पहचान की गई है द्वारा फ्रेम की जांच (पूरक आंकड़ा 18) । मैंयुअल रूप से उन कणों कि सच कणों नहीं है एनोटेट ।
    नोट: यदि यह मैंयुअल चयन नहीं किया है, तो एक कमज़ोर स्वत: चयन बाद में किया जा सकता है जब प्रसार गुणांक परिकलित है (चरण 4 देखें) ।

4. प्रसार गुणांक की गणना और प्रक्षेप-पथ का वर्गीकरण

  1. यकीन है कि सभी लिपियों वीडियो की निर्देशिका से लागू कर रहे है विश्लेषण किया जा रहा है (उदाहरण में, VideoName/Serie1) ।
  2. सभी प्रक्षेपकों पढ़ें Matlab कंसोल में जारी करने के द्वारा प्रसार गुणांक की गणना आदेश: प्रक्षेपटोरी = Readप्रक्षेपटोरी (0.1), जहां ०.१ सेकंड में दो लगातार फ्रेम के बीच समय है (समय अंतराल, पैनल फिल्म में दिखाया गया है सूचना, पूरक आंकड़ा 11B)।
  3. गलत पहचान किए गए धब्बों/प्रक्षेपस्थलों के अनुरूप प्रक्षेप-पथ को बाहर निकालें । बाहर करने के लिए स्पॉट की एक सूची दे । उदाहरण के लिए, स्पॉट 4, 5 और 28 को बाहर करने के लिए, टाइप करें: प्रक्षेप-पथ = Readप्रक्षेप्रटोरी (0.1, [4, 5, 28]) ।
  4. इस कक्ष के हर एक ट्रैक के लिए तात्कालिक प्रसार गुणांक परिकलित करें । इस स्थिति में, एक समय अंतराल के लिए प्रसार गुणांक की गणना = 4, D1-4कहा जाता है । ऐसा करने के लिए, Matlab कंसोल कमांड में भागो: डी = calculateDiffusion (प्रक्षेप-पथ, 113.88 e-3, ०.००१५, ' अल्फा ') जहां प्रक्षेप पथ चरण 3, 113.88 ई-3 में प्राप्त की गई छवियों का पिक्सेल आकार है माइक्रोन में हासिल की है, ०.००१५ एक ऊपरी परिबंध के प्रसार के लिए स्थिर कणों के गुणांक में मापा μm2/, और ' अल्फा ' फिट मॉडल के रूप में नीचे समझाया है ।
    नोट: एक तेज कैमरा का उपयोग करते समय और अधिक फ्रेम की आवश्यकता प्रसार पैरामीटर की गणना करने के लिए इसे बढ़ाने के लिए, उदाहरण के लिए 20, डी द्वारा = calculateDiffusion (प्रक्षेप, 113.88 e-3, ०.००१५, ' अल्फा ', ', 20). स्ट्रिंग पैरामीटर 20 से पहले, ऊपर के उदाहरण में, ' ', आउटपुट फ़ाइलों में जोड़ा गया प्रत्यय है । इस प्रत्यय का उपयोग विभिंन विश्लेषणों में अंतर करने के लिए किया जा सकता है ।
  5. एक अलग फिटिंग मोड के साथ फिर से calculateDiffusion समारोह फोन करके एक अलग समारोह के साथ MSD फिट (' सीमित ', ' मुक्त ', या ' निर्देशित '). इस उदाहरण में, ' सीमित ': D = calculateDiffusion (प्रक्षेप-पथ, 113.88 e-3, ०.००१५, ' सीमित ')।
  6. के रूप में पूरक चित्रा 20में दिखाया गया है, निर्देशित मॉडल के लिए फिटिंग परिणाम प्राप्त करें ।
  7. प्रक्षेप-पथ को लघु और दीर्घ प्रक्षेप पथ में विघटित करना । इस आदेश का उपयोग करें: [Shorttrajectories, longTrajectories] = विभाजक (प्रक्षेप-पथ, 50) जहां ५० एक प्रक्षेपवक्र के फ्रेम में ंयूनतम लंबाई (दिखाए गए उदाहरण में) माना जाता है ।
  8. चरण ४.३ में वर्णित एक ही फिटिंग प्रक्रिया का उपयोग करते हुए लघु प्रक्षेप-पथ का अध्ययन करें: D = calculateDiffusion (शॉर्टराजectories, 113.88 e-3, ०.००१५, ' निर्देश ', ' लघुकथा '). आदेश के साथ लघु और असंगत प्रक्षेप-पथ का विश्लेषण करें: D = calculateDiffusion (शॉर्टराजectories, 113.88 e-3, ०.००१५, ' अल्फा ', ' शॉर्ट ').
  9. अपने पल स्केलिंग स्पेक्ट्रम (MSS)7के माध्यम से गति के प्रकार को वर्गीकृत करने के लिए लंबी प्रक्षेप-पथ का विश्लेषण करें । कमांड: प्रक्षेप-पथ वर्गीकरण = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88 e-3, 0.0015, ' Long ') स्क्रीन में विश्लेषण से पता चलता है और एक फ़ाइल के लिए कहा जाता है प्रक्षेतोरवर्गीकरण < प्रत्यय >. txt में निर्देशिका Results\trackingpackage\tracks।

5. कण घनत्व के माध्यम से क्लस्टर Ssize की गणना

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी लिपियों वीडियो की निर्देशिका से लागू कर रहे है विश्लेषण किया जा रहा है (उदाहरण में दिखाया, VideoName/Serie1) ।

  1. अपने प्रक्षेपवक्र के साथ प्रत्येक कण की तीव्रता का विश्लेषण । ऐसा करने के लिए, Matlab कंसोल में टाइप करके स्क्रिप्ट को इनवोक करें: विश्लेषणात्मक Zespotतीव्रताओं कि इनपुट के रूप में लेता है प्रक्षेप पथ पहले खंड में यू-ट्रैक द्वारा परिकलित । अपने सबसे बुनियादी रूप में, बस वीडियो की निर्देशिका से किसी भी तर्क के बिना स्क्रिप्ट फोन विश्लेषण किया जा रहा है (उदाहरण में दिखाया, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities () । के रूप में स्क्रिप्ट के लिए तर्क प्रदान करके कई विभिंन तरीकों से इस बुनियादी व्यवहार कॉंफ़िगर: analyzeSpotIntensities (' Arg1 ́, Value1, ' Arg2 ́, Value2,...) । उनके इसी चर मूल्यों के साथ वैध तर्क (' ArgN ́, ValueN) सूचीबद्ध हैं ।
    1. (' स्पोटरडियस ́, 1)
      प्रतिदीप्ति तीव्रता 1 पिक्सेल (डिफ़ॉल्ट रूप से) है कि आकार 3x3 के एक पैच से मेल खाती है का उपयोग कर का विश्लेषण (2 * spotRadius + 1) x (2 * सपोट्रेडिअस + 1)) ।
      नोट: मौके पर केंद्रित 5x5 के एक पैच के लिए, 2, आदि का एक spotRadius चुनें
    2. (' Onlyinitialप्रक्षेपलटोरी ́, 1)
      यदि यह तर्क दिया जाता है (true, 1 का मान), तो केवल उस प्रक्षेप-पथ का विश्लेषण करें जो वीडियो के पहले फ़्रेम में प्रारंभ होता है । यह (डिफ़ॉल्ट रूप से 0, false) नियंत्रण छवियों का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है ।
    3. (' Trackप्रक्षेपटोरी ́, 0)
      यदि यह तर्क 0 (false) पर सेट है, तो सभी फ़्रेंस के लिए स्थान का समंवय अपने पहले फ़्रेम में रखें (यह स्थिर स्पॉट के लिए उपयोगी है) । यदि तर्क 1 (डिफ़ॉल्ट रूप से 1, true) पर सेट है, तो स्पॉट यू-ट्रैक द्वारा परिकलित निर्देशांक के बाद वीडियो के साथ ट्रैक किया जाता है.
    4. (' excludeTrajectories ́, [4, 5, 28])
      चरण ४.३ (उदाहरण 4, 5, 28) में छोड़े गए प्रक्षेपवक्र की प्रक्षेप संख्या को शामिल करें ।
    5. (' Extendप्रक्षेपवक्र ́, 1)
      यदि इस तर्क को 1 (सच) पर सेट है, तो वीडियो के अंत करने के लिए पैच में तीव्रता का विश्लेषण (यहां तक कि अगर प्रक्षेपवक्र पहले बंद हो जाता है) । स्पॉट के समंवय या तो पथ में पिछले समंवय है (यदि Trackप्रक्षेपवक्र सच है) या पहले प्रक्षेपवक्र में समंवय (यदि Trackप्रक्षेपवक्र झूठी है) । यह तर्क डिफ़ॉल्ट रूप से (0) false है ।
    6. (' subtractBackground ́, 1)
      यदि यह पैरामीटर सेट है, तो उस स्थान के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का अनुमान द्वारा प्रत्येक स्थान पर मापा कच्चे प्रतिदीप्ति सही है (नीचे देखें) । यह तर्क (1), डिफ़ॉल्ट रूप से सत्य है ।
    7. (' meanLength ́, फ़्रेम संख्या)
      यदि यह पैरामीटर सेट है, तो माध्य तीव्रता स्थान इंगित लंबाई पर मापा जाता है । ' MeanLength ', 20 पहले 20 तख्ते पर मतलब स्पॉट तीव्रता को मापने के लिए सेट करें । यदि तर्क सेट नहीं है, तो हाजिर तीव्रता पूरे प्रक्षेपवक्र पर गणना की है (डिफ़ॉल्ट रूप से, पूर्ण लंबाई).
    8. (' शॉविनटेंस्टप्रोफाइल ́, 1)
      इस पैरामीटर को 1 के रूप में सेट करें (डिफ़ॉल्ट रूप से 0, false), विभिंन फ़्रेम के साथ तीव्रता प्रोफ़ाइल प्लॉट करने के लिए और साथ ही उनकी पृष्ठभूमि ।
      नोट: इन भूखंडों के रूप में पूरक चित्रा 21में दिखाया गया है photoब्लीचिंग की पहचान करने के लिए बहुत उपयोगी हैं. हर रास्ते के लिए, दिनचर्या स्वचालित रूप से विश्लेषण करती है अगर यह संभव है कि वहां photoब्लीचिंग किया गया है । इस पथ के साथ पहली और आखिरी N तख्ते में एक छात्र टी के साथ तीव्रता मूल्यों की तुलना द्वारा किया जाता है । डिफ़ॉल्ट रूप से, N 10 है, लेकिन इस मान को तर्क के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है ' Nbleach ́ ।
    9. (' backgroundMethod ́, मान)
      प्रत्येक स्थान की पृष्ठभूमि निर्धारित करने के लिए यह पैरामीटर सेट करें । यह कई मायनों में किया जा सकता है, और जो एक का उपयोग करने के लिए "मूल्य" बदलने का चयन किया जा सकता है:
      1. (' backgroundMethod ́, 0)
        पूरे वीडियो के लिए पृष्ठभूमि को मैंयुअल रूप से पहचानने के लिए इस मान का उपयोग करें । वीडियो के पहले फ़्रेम में 8 बिंदुओं का चयन करने की अनुमति दें । इन बिंदुओं के आसपास एक पैच पूरे वीडियो के साथ विश्लेषण किया है, और इन सभी तीव्रताओं के ९५% quantile सभी स्थानों के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता के रूप में चुना जाता है ।
      2. (' backgroundMethod ́, 1)
        प्रत्येक फ़्रेम के लिए पृष्ठभूमि की मैंयुअल रूप से पहचान करने के लिए इस मान का उपयोग करें । हर जगह और हर फ्रेम के लिए 8 अंक चुनें । यह एक समय लेने का काम है, लेकिन यह उपयोगकर्ता के लिए नियंत्रण का एक बहुत कुछ देता है । इन पैच में तीव्रता के ९५% quantile इस फ्रेम में इस स्थान के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता के रूप में चुना जाता है ।
      3. (' backgroundMethod ́, 2)
        इस मान का उपयोग प्रत्येक स्थान की पृष्ठभूमि की गणना करने के लिए स्थान के चारों ओर एक सर्कल में स्थित एक वृत्त के साथ एक ' तर्क द्वारा नियंत्रित त्रिज्या के साथ अनुमान (डिफ़ॉल्ट रूप से, 4 * spotRadius) ।
      4. (' backgroundMethod ́, 3)
        इस मान का उपयोग प्रत्येक फ़्रेम के लिए पृष्ठभूमि की गणना करने के लिए पहले वीडियो में कक्ष का पता लगाना और तब प्रत्येक फ़्रेम में कक्ष की तीव्रता का विश्लेषण करना (पूरक चित्र 22) ।
        नोट: पृष्ठभूमि इस वितरण के एक दिए गए quantile पर ग्रे मूल्य के रूप में चुना जाता है (डिफ़ॉल्ट रूप से ०.५ (= ५०%), हालांकि इस पैरामीटर तर्क के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है ' backgroundPercentile ́, इस मूल्य को उच्च सेट किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ०.९ (= ९०%) यदि कोशिका के अधिकांश चाहने पृष्ठभूमि के रूप में माना जा सकता है । सेल की पहचान में मदद करने के लिए, जो अधिकतम पृष्ठभूमि मूल्य तर्क ' maxBackground ́ का उपयोग कर फ्रेम के साथ की उंमीद है संकेत मिलता है (उदाहरण के लिए, सभी विश्लेषण वीडियो में, पृष्ठभूमि मूल्य सामांय रूप से नहीं जाता है ६००० से परे)13। डिफ़ॉल्ट रूप से, यह विकल्प 0 पर सेट होता है, जिसका अर्थ है कि यह मदद डिफ़ॉल्ट रूप से उपयोग नहीं की जाती है । देखें कि कौन सी कोशिका का पता लगाना है और ' तर्क ' showImages ́ सेट करके पृष्ठभूमि अनुमान के लिए चयनित क्षेत्र (CTRL-C दबाकर किसी भी समय निष्पादन रोकें) ।
  2. क्रमशः चरण 4 और ५.१ में परिकलित सभी प्रक्षेप-पथ के लिए प्रसार और तीव्रता की जानकारी एकत्रित करें, जो gatherDiffusion. AndIntensity () का उपयोग करते हुए । केवल प्रसार और कम प्रक्षेप-पथ के लिए तीव्रता जानकारी इकट्ठा । ऐसा करने के लिए, चरण ४.७ में प्रयुक्त प्रत्ययों का उपयोग करें, और प्रकार: Gatherdiffusionandintensity (' लघु ́) जहां ' लघु ́ चरण ४.७ में प्रयुक्त प्रत्यय है ।
  3. पल स्पेक्ट्रम स्केलिंग और तीव्रता जानकारी टाइपिंग द्वारा इकट्ठा: Gatherप्रक्षेतक-Classificationandतीव्रता (' लंबी ') जहां ' long ' प्रत्यय चरण ४.७ में उपयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर जनरेट की गई सभी फ़ाइलों का सारांश चित्रा 2में दिखाया गया है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी फिल्मों और उनके गतिशील विशेषताओं के विश्लेषण में पता लगाया कणों की स्वचालित ट्रैकिंग की अनुमति देता है । शुरू में, कोशिकाओं प्रतिदीप्ति-युग्मित प्रोटीन के साथ transfected को ट्रैक किया जाएगा । रिसेप्टर्स के उचित स्तर सेल सतह है कि SPT सेल छंटाई द्वारा प्राप्त की अनुमति देता है पर प्रस्तुत करता है (चित्रा 1) । चयनित कक्षों का विश्लेषण TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है जो इस प्रोटोकॉल में वर्णित उपकरणों के साथ अध्ययन किए जा सकने वाले किसी स्वरूप में वीडियो जनरेट करता है (पूरक वीडियो 1).

वीडियो उत्पंन सीधे विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, और प्रत्येक वीडियो के स्वतंत्र फ्रेम की आवश्यकता है । ImageJ का उपयोग फ़ाइलें कि ऐसे. tiff प्रारूप या मास्क में वीडियो फ्रेम के रूप में Matlab सॉफ्टवेयर का उपयोग कर व्याख्या की जा सकती उत्पंन करता है । यू ट्रैक चयनित वीडियो में देखा कणों पटरियों और Matlab में जानकारी (. mat) फ़ाइलें बचाता है (. mat, Channel_1_detection_result. mat, Channel_1 चटाई, Channel_1_tracking_result. Mat), चित्रा 2देखें ।

चित्रा 2में दिखाया गया है के रूप में, प्रसार गुणांक और प्रक्षेप-पथ का वर्गीकरण आदेश का परिकलन, भिन्न फ़ाइलें जनरेट करताहै (Diffusioncoefficients. txt, diffusioncoefficientsmobile. txt , diffusionCoefficientsShort. txt, प्रक्षेप-पथ वर्गीकरण लंबा. txt, आदि). इन फ़ाइलों में मौजूद जानकारी श्रेष्ठ Excel और प्रिज्म सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर प्रबंधित की जाती हैं । इस विश्लेषण से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी में शामिल हैं:

  1. स्थिर स्पॉट का प्रतिशत । आप स्थिर कणों के संदर्भ के रूप में उपयोग कर सकते हैं: D1-4 मूल्यों के ९५% शतमक प्राप्त (1) स्थिर कोशिकाओं में एकल कणों से और/या (2) शुद्ध फ्लोरिसेंट प्रोटीन से जुड़े coverslips (चित्रा 3a).
  2. लंबी प्रक्षेपायों का प्रतिशत (> 50 फ्रेम) (चित्रा 3B) ।
  3. दीर्घ प्रक्षेप-पथ का प्रकार: निदेश, मुक्त, सीमित (चित्रा 3C) ।
  4. विसरण गुणांक (D1-4) कोशिकाओं में मोबाइल कणों के विभिन्न उत्तेजना के साथ इलाज (चित्र 4a).

प्रोटोकॉल के चरण 5 प्रक्षेपवक्र के साथ प्रत्येक कण की तीव्रता का विश्लेषण करती है । स्क्रिप्ट Analyzespotintensities स्क्रीन पर मुद्रित सभी जानकारी का विश्लेषण करेंगे । प्रत्येक स्थान और फ्रेम के लिए, स्क्रिप्ट पिक्सेल इकाइयों में है कि फ्रेम (एक्स, वाई) में हाजिर के समंवय से पता चलता है, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का अनुमान (k0), 3x3 पैच में कच्चे स्थान की तीव्रता, सही तीव्रता (कच्चे तीव्रता के रूप में गणना शूंय से अपनी पृष्ठभूमि), पैच में मनाया तीव्रता का अधिकतम मूल्य, और मुखौटा के भीतर क्षेत्र संख्या जहां इस जगह इस फ्रेम में स्थित है । उत्पादित उत्पादन की तरह का एक उदाहरण है

स्पॉट = 43 फ़्रेम = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
k0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

यह सब जानकारी एक लॉग फ़ाइल में संग्रहित है (परिणाम/TrackingPackage/पटरियों/log. txt) और एक मेज है कि एक्सेल से पढ़ा जा सकता है (परिणाम/trackingpackage/पटरियों/ प्रत्येक स्थान का विश्लेषण करने के बाद, स्क्रिप्ट प्रक्षेपवक्र के साथ औसत तीव्रता और मुखौटा के भीतर बहुवादी क्षेत्र मुद्रित करता है

स्पॉट = 43
Meaning of frames = 4762.303
बहुसत्तावादी क्षेत्र = 3

यह जानकारी ऊपर लॉग फ़ाइल में संग्रहीत किया जाता है और एक तालिका है कि एक स्प्रेडशीट से पढ़ा जा सकता है (परिणाम/TrackingPackage/ट्रैक्स/ एक उदाहरण के रूप में, विभिन्न स्थितियों के साथ प्रेरित कोशिकाओं में अपने प्रक्षेपवक्र के साथ हर कण के लिए हाजिर तीव्रता (msi) का मतलब चित्रा 4Bमें दिखाया गया है । अब हम इस जानकारी का उपयोग करने के लिए मोटे तौर पर फ्लोरोसेंट क्लस्टर के आकार का अनुमान कर सकते हैं । के रूप में एक स्थान का मतलब सही तीव्रता फ्लोरोसेंट इस मौके में मौजूद प्रोटीन की संख्या के साथ संबंधित है, और एक एकलक के प्रतिदीप्ति एक समान लेकिन स्वतंत्र प्रयोग के माध्यम से मापा जा सकता है, सीधे कण प्रति रिसेप्टर्स की संख्या की गणना । संदर्भ के रूप में उपयोग कण प्रति रिसेप्टर संख्या के आवृत्ति वितरण एक ही कोशिकाओं में व्यक्त एकलक प्रोटीन की तीव्रता चित्रा 4cमें दिखाया गया है.

एकत्रित प्रसार और तीव्रता आदेश दो फ़ाइलों को बनाने: एक Diffusioncoefficientsandतीव्रताके लिए कहा जाता है और निर्देशिका परिणामों में एक और log_diffusioncoefficientsandintensitiesshort. txt कहा जाता है / ट्रैकिंगपैकेज/ दोनों फ़ाइलों में 1) हाजिर सूचकांक, 2) प्रसार गुणांक, 3) तीव्रता, और 4) मुखौटा के भीतर क्षेत्र संख्या होते हैं । ये फ़ाइलें किसी स्प्रेडशीट से पढ़ी जा सकती हैं ।

इसी तरह, इकट्ठा प्रक्षेपवक्र वर्गीकरण और तीव्रता कमान दो फ़ाइलों को एक प्रक्षेपके वर्गीकरण और तीव्रगति से लंबी. txt और एक अंय log_trajectoryclassificationandintensitieslong. txt में बनाया जाएगा / TrackingPackage/पटरियों निर्देशिका परिणाम। पहले एक शामिल है 1) स्पॉट सूचकांक, 2) आंदोलन प्रकार, 3) हाजिर पहले पल, 4) तीव्रता, 5) डी1-4 और 6) मुखौटा के भीतर क्षेत्र संख्या । यह फ़ाइल Excel से पढ़ी जा सकती है ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर जनरेट की गई सभी फ़ाइलों का सारांश चित्रा 2में दिखाया गया है । अंय विश्लेषण है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है छोटे बनाम बड़े धब्बे, यानी मोनोमर बनाम oligomers के गतिशील मापदंडों की तुलना शामिल है, इन गतिशील ligands द्वारा प्रेरित मापदंडों पर बदलाव, inhibitors, झिल्ली संरचना, सिग्नलिंग मार्ग आदि में परिवर्तन । विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत अपने संलग्नी CXCL12 के जवाब में CXCR4 व्यवहार का एक पूरा विश्लेषण इस प्रोटोकॉल13का उपयोग किया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1 : कक्ष सॉर्टिंग । जूरकट कोशिकाओं में GFP की अभिव्यक्ति CXCR4-AcGFP से पहले और बाद में सेल छंटाई के साथ transfected । GFP (GFPlow) के निम्न स्तर को व्यक्त करने वाले सेल का चयन किया जाता है और tirf प्रयोगों के लिए नियोजित किया जाता है.

Figure 2
चित्रा 2 : जनरेट की गई फ़ाइलों का सारांश । चित्रा पता चलता है सभी फ़ाइलें वर्णित Matlab दिनचर्या का उपयोग कर उत्पंन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रक्षेप का वर्गीकरण । विभिन्न उद्दीपन के साथ उपचारित कोशिकाओं से संबंधित विभिन्न प्रकार के प्रक्षेप-पथ की संख्या । (क) स्थिर स्पॉट का प्रतिशत, (ख) लंबी प्रक्षेप-पथ का प्रतिशत और (ग) दीर्घ प्रक्षेप के संचलन का प्रकार ।

Figure 4
चित्रा 4 : प्रसार गुणांक, मतलब हाजिर तीव्रता और कण प्रति रिसेप्टर्स की संख्या । (क) विभिन्न उद्दीपन (I, II, II और IV) के प्रत्युत्तर में प्रत्येक स्थान के लिए लघु प्रसार गुणांक (D1-4) मूल्यों का वितरण । लाल रेखा D1-4के लिए माध्य मान का प्रतिनिधित्व करती है । (ख) विभिन्न उद्दीपन (I, II, II और IV) के प्रत्युत्तर में अपने पहले 20 तख्तों के साथ प्रत्येक स्थान के लिए हाजिर तीव्रता (एमएसआई) मान । लाल रेखा माध्य तीव्रता मान (SD) का प्रतिनिधित्व करती है । (ग) व्यक्तिगत कणों के तीव्रता से वितरण से निकाले गए अभिग्राही/कण का प्रतिशत, मोनोमेरिक प्रोटीन तीव्रता मान को बिन चौड़ाई के रूप में लेते हुए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: फिजी या ImageJ में एक TIRFM फ़ाइल खोलरहा है । विकल्प है कि जैव पर दिखाई देते हैं, खींचने और एक. lif वीडियो छोड़ने पर खिड़की प्रारूपों । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

पूरक चित्रा 2: श्रृंखला का चयन करें। . Lif वीडियो में मौजूद छवियां । (क) खिड़की है कि मल्टीचैनल छवियों सहित, विश्लेषण किया जा करने के लिए श्रृंखला के चयन की अनुमति देता है । (ख) श्रृंखला चयन के परिणाम उदाहरण, मल्टीचैनल छवि (बाएं) और इसी वीडियो (दाएं) सहित । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें । 

पूरक चित्रा 3: विभाजित चैनल । (क) एक मल्टीचैनल छवि और (ख) चैनल विभाजन के परिणाम उदाहरण के बंटवारे चैनलों के लिए आवश्यक imagej आज्ञाओं का विंडो कैप्चर । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 4: चैनल्स मर्ज करें । (क) विभिन्न चैनलों को एक ही छवि में विलय करना । (ख) विलय के लिए चैनल चयन । (ग) चैनल विलय का परिणाम उदाहरण । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 5: Windows सिंक्रनाइज़ करें । (A) छवि सिंक्रनाइज़ेशन और (B) परिणामी विंडो के लिए आवश्यक आदेशों के imagej मेनू में स्थानीयकरण । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 6: रुचि के क्षेत्र का चयन करें । (क) छवि फसल के परिणाम आयताकार चयन उपकरण और (ख) का उपयोग कर ब्याज की खिड़की का चयन । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 7: वीडियो सहेजें । एक छवि अनुक्रम और पैरामीटर्स के रूप में सहेजें छवि अनुक्रम विंडो के लिए के रूप में ब्याज के क्षेत्र सहेजें । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 8: विभाजन. (क) इमेजेज के प्लगइंस मेन्यू में फॉल्ट एडिटर प्लगइन खोलें । (ख) खंडीकरण के लिए लेबल/सामग्री जोड़ें । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 9: मुखौटा डिजाइन । (क) उपयुक्त लेबल और ग्रीन मास्क की परिभाषा का चयन । (ख) लाल मास्क का चयन । दो लेबलों के समान मास्क का उदाहरण । (C) मास्क को. tiff फ़ाइल के रूप में सहेजें । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 10: Matlab काम निर्देशिका । सही निर्देशिका का चयन श्रृंखला युक्त विश्लेषण किया जाना है । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 11: यू ट्रैक मुख्य मेनू । (A) चलचित्र चयन, (B) चलचित्र संस्करण और (C) चैनल सेटिंग्स मेनू । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 12: ट्रैक करने के लिए ऑब्जेक्ट के प्रकार का चयन करें । एकल कणों की ट्रैकिंग का चयन करें । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 13: कणों का पता लगाना । (क) यू-ट्रैक, नियंत्रण कक्ष (ख) कणों का पता लगाने के लिए सेटिंग्स का उदाहरण । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 14: कण का पता लगाने के लिए परिणामों का उदाहरण । भिंन विंडो जिसमें व्यूअर मेनू, चलचित्र विकल्प मेनू और चलचित्र शामिल हैं । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 15: ट्रैकिंग मेनू । सेटिंग्स का उदाहरण है । (A) ट्रैकिंग, (B) सेटिंग-फ़्रेम को फ़्रेम से जोड़ना और (C) गैप बंद करना, मेनू को मर्ज करना और विभाजित करना. चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 16: कण ट्रैकिंग के लिए परिणाम का उदाहरण । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 17: विश्लेषण मेनू ट्रैक करना । सेटिंग्स का उदाहरण है । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 18: रेलपथ विश्लेषण का सत्यापन । ट्रैक विश्लेषण के बाद प्रदर्शित स्क्रीन, पता लगाया कणों और उनके इसी पटरियों दिखा एक वीडियो विंडो सहित. चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 19: प्रसार गुणांक की गणना । विसरण गुणांक परिकलित (बाएँ) और माध्य चुकता विस्थापन (MSD, दाएँ) के Histograms । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 20: विभिंन फिटिंग मोड सहित प्रसार गुणांक की गणना । विसरण गुणांक परिकलित (बाएँ) का Histograms और सीमित मॉडल के लिए माध्य चुकता विस्थापन (MSD, दाएँ) । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 21: तीव्रता प्रोफाइल । अपने प्रक्षेपवक्र (नीली रेखा) और पृष्ठभूमि (लाल रेखा) के साथ हाजिर तीव्रता का उदाहरण । चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 22: प्रत्येक फ़्रेम के लिए पृष्ठभूमि । बाएँ: नमूना कक्ष छवि । मध्य: स्वचालित रूप से खोजा गया कक्ष. दाएँ: क्षेत्र स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि के रूप में चयनित. चित्र डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक वीडियो 1: एक ठेठ TIRF वीडियो माइक्रोस्कोपी का उदाहरण विभिंन तीव्रता और आंदोलनों के प्रकार के साथ कणों की उपस्थिति दिखा । कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक सामग्री 1: सभी प्रोटोकॉल में कार्यरत तदर्थ दिनचर्या के वर्गीकरण और क्लस्टर आकार के विश्लेषण के लिए कार्यरत है लिपियों युक्त फ़ाइलें । कृपया सामग्री डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्णित विधि भी किसी भी पिछले Matlab के साथ काम कर रहे अनुभव के बिना प्रदर्शन करने के लिए आसान है । हालांकि, Matlab दिनचर्या विभिंन आज्ञाओं का नामकरण और विभिंन कार्यक्रम द्वारा नियोजित फ़ोल्डर्स के स्थानीयकरण के साथ अत्यंत सटीकता की आवश्यकता है । ट्रैकिंग विश्लेषण दिनचर्या (चरण 3) में, एकाधिक पैरामीटर्स संशोधित किए जा सकते हैं । "सेटिंग Gaussian-मिश्रण मॉडल फिटिंग" विंडो (चरण ३.८) नियंत्रण कैसे यू ट्रैक वीडियो पर एकल कणों का पता लगाने जाएगा । यह3में वर्णित के रूप में एक गाऊसी मिश्रण मॉडल फिटिंग द्वारा किया जाता है । इस फिटिंग के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक स्थानीय maxima की पहचान करने में मदद करने के लिए एक फिल्टर परिभाषित करता है । इस आपरेशन की सफलता छवि इसके विपरीत और छवियों में मौजूद शोर पर निर्भर करता है । पहला पैरामीटर (स्थानीय पृष्ठभूमि के साथ तुलना के लिए अल्फा मूल्य) एक असली जगह जा रहा है एक maxima के विश्वास को नियंत्रित करता है, जबकि दूसरा स्पॉट की पहचान के दौरान शोर को कम करने में मदद मिलती है. महत्वपूर्ण पैरामीटर "ट्रैकिंग" चरण (३.९) में अंतराल को बंद करने के लिए फ़्रेंस की संख्या है (जो है एक ट्रैक फ़्रेंस में जो पार्टिकल वास्तव में नहीं देखा जाता है पर अवधि हो सकता है, लेकिन यह इन फ़्रेंस के पहले और इन फ़्रेंस के बाद देखा है; उदाहरण में, 0) , और एक सफल ट्रैक के रूप में माना जा करने के क्रम में एक ट्रैक अवधि होना चाहिए कि फ्रेम की संख्या (हमारे उदाहरण में, 20; इस पैरामीटर कैमरा अधिग्रहण की गति से संबंधित है और ट्रैक में संख्या फ्रेम ऐसा होना चाहिए कि यह प्रसार सह की गणना की अनुमति देता है कुशल) । यह भी तय करना है कि विलय और विभाजन (उदाहरण में इन दो संभावनाओं को चुना गया था) के लिए महत्वपूर्ण है । उसके बाद, चरण 1 में लागत फ़ंक्शंस (फ़्रेम-से-फ़्रेम लिंकिंग) के लिए पैरामीटर सेट करना आवश्यक है । इस समारोह नियंत्रण कैसे कणों तख्ते के साथ ट्रैक कर रहे हैं । इस बिंदु पर सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर ब्राउनियां खोज त्रिज्या, जो कितनी दूर प्रत्येक स्थान पर नियंत्रण के लिए अगले फ्रेम में होने की उंमीद है का चयन है । हमारे उदाहरण में हमने क्रमशः 0 और 5 को निचली और ऊपरी सीमा के रूप में चुना । ध्यान दें कि इन मापदंडों को ट्रैक किया जा रहा कणों की प्रकृति के लिए बहुत विशिष्ट हैं, और है कि वे प्रत्येक विशिष्ट मामले में देखते हो सकता है । विशेष रूप से महत्वपूर्ण ब्राउनी और रैखिक खोज radii में स्केलिंग शक्ति हैं । इन स्केलिंग शक्तियों कणों के आंदोलन की तरह (मुक्त या सीमित प्रसार) पर निर्भर करते हैं । उदाहरण में, मान (०.५, ०.०१) को मुक्त प्रसार के लिए चुना गया था । इन पैरामीटर्स के विशिष्ट दस्तावेज़ीकरण के लिए,3देखें ।

प्रसार गुणांक आदेश (चरण ४.४) की गणना में, स्थिर कणों के प्रसार के लिए ऊपरी परिबंध पिछले प्रयोगों से या स्थिर के साथ एक अलग प्रोजेक्ट पर calculatediffusion फ़ंक्शन चलाकर ज्ञात किया जा सकता कणों (शुद्ध मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन) और प्रसार गुणांक देखने की सूचना दी । यह फ़ंक्शन दो अतिरिक्त पैरामीटर लेता है: ' आउटपुटप्रत्यय ́, जो आउटपुट filenames में जोड़ा जाता है और डिफ़ॉल्ट रूप से खाली मान लेता है, और ' प्लॉलंबाई ́, जो डिफ़ॉल्ट रूप से 13 है और समय अंतराल (सेकंड) की संख्या है जिसमें प्रसार परिकलन किया जाता है । फिटिंग मोड ' अल्फा ' वक्र करने के लिए MSD के एक समायोजन का तात्पर्य

Equation 1

अर्थात, एक ऑफ़सेट (MSD0) और समय अंतराल का एक पावर फ़ंक्शन । इस शक्ति समारोह के नवोन्मेष, Equation 2 , निर्धारित करता है कि क्या आंदोलन सीमित (0 < α < ०.६), असंगत (०.६ < α < ०.९), मुक्त (०.९ < α < १.१), या निर्देशित (α > १.१) । विश्लेषण के इस तरह के पाठक Manzo एट अल9 को संदर्भित किया जाता है की समीक्षा के लिए

प्रसार गुणांक4 का परिकलन दो आउटपुट आंकड़ों का उत्पादन करता है ( पूरक आरेख 19देखें) । पहले एक प्रसार गुणांक की एक हिस्टोग्राम की गणना से पता चलता है (ध्यान दें कि इस बिंदु पर, वहां प्रत्येक प्रक्षेपवक्र के लिए एक स्वतंत्र प्रसार गुणांक है) । माध्य और इन गुणांक के ९५% शतमक matlab कंसोल में दिखाए जाते हैं । दूसरा भूखंड MSD (लाल वक्र) और उन के लिए समय अंतराल के एक समारोह के रूप में गणना करने के लिए माना जाता कदम की संख्या से पता चलता है उन के लिए मोबाइल माना जाता है (जिनका प्रसार गुणांक कमांड लाइन में दी गई सीमा से ऊपर है) । मोबाइल प्रक्षेप-पथ का औसत और मानक विचलन परिकलित है (ये एक एकल कक्ष में प्रक्षेप-पथ के लिए मान हैं) । उदाहरण में, नवोन्मेष ०.५९ अर्थ है कि आंदोलन सीमित है । इस वक्र फिटिंग के लिए, कार्यक्रम के मापदंडों के हर एक से जुड़े अनिश्चितता की रिपोर्ट (हर एक के मानक विचलन के रूप में दिखाया गया है) और फिट की अच्छाई (एक सही फिट शूंय तक पहुंच जाएगा) । इस बिंदु पर और अल्फा के मूल्य की जाँच के बाद हम एक अलग समारोह के साथ MSD फिट करने के लिए तय कर सकते हैं:

Equation 3    यदि 0 < α < ०.६ (सीमित)

Equation 4यदि ०.९ < α < १.१ (मुक्त)

Equation 5यदि α > १.१ (निदेश)

असंगत प्रक्षेप-पथ किसी भिन्न फलन से सज्जित नहीं किया जा सकता । सीमित कणों के मामले में आप परिमित आकार (microns में) के रूप में Destainville एट अल .14 की गणना कर सकते हैं

Equation 6

एक सही फिटिंग का एक अच्छा संकेतक है कि अच्छाई की-फिट अल्फा फिटिंग से अंतिम फिटिंग करने के लिए कम होना चाहिए (उदाहरण में, अच्छाई फिट ०.३०४७४ से ०.१५७४९, पूरक आंकड़ा 19-20) गिर जाता है । "Diffusioncoefficients. txt" और "Diffusioncoefficientsmobile. txt" नामक श्रृंखला निर्देशिका के अंदर "results\TrackingPackage\tracks" में दो फ़ाइलें calculateDiffusioncreates । इन फ़ाइलों में तीन कॉलम होते हैं: 1) प्रत्येक इनपुट प्रक्षेपवक्र के सूचकांक, 2) उनके इसी प्रसार गुणांक, 3) मुखौटा में बहुवादी क्षेत्र जहां इस ट्रैक के अंतर्गत आता है (क्षेत्रों फ़ाइल से प्राप्त कर रहे हैं "मुखौटा. tif" कि हम चरणों में उत्पंन २.७; यदि यह फ़ाइल मौजूद नहीं है, तो यह स्तंभ मौजूद नहीं है) । आप इस फ़ाइल और समान प्रायोगिक शर्तों के अंतर्गत कक्षों के किसी सेट के लिए प्रसार गुणांक के वितरण का विश्लेषण करने के लिए अंय कक्षों के लिए जनरेट की गई अनुरूप फ़ाइलों का उपयोग कर सकते हैं ।

कम प्रक्षेपवक्र के लिए प्रसार गुणांक की गणना में (कदम 4.7-4.8), पिछले पैरामीटर ' लघु ' एक प्रत्यय आउटपुट फ़ाइल नाम करने के लिए जोड़ा गया है ताकि आप ओवरराइटिंग के बिना प्रक्षेप पथ के विभिन्न सबसेट का विश्लेषण कर सकते हैं diffusionCoefficients. txt फ़ाइलें । आउटपुट फ़ाइलों का वास्तविक नाम "diffusionCoefficients < प्रत्यय >. txt" और "diffusionCoefficientsMobile < प्रत्यय >. txt" है । यदि कोई प्रत्यय नहीं दिया गया है, जैसा कि सामान्य विश्लेषण के ऊपर किया गया है, तो एक खाली प्रत्यय ग्रहण कर लिया जाता है । मॉडल पैरामीटर्स (D, v, और MSD0) सभी प्रक्षेप-पथ पर लगे लोगों से अलग हो सकते हैं । सबसे उल्लेखनीय, मानकों के मानक विचलन के रूप में अच्छी तरह से अच्छाई फिट आम तौर पर वृद्धि हुई है । कारण यह है कि लघु प्रक्षेप अधिक अस्थिर है और एक विश्वसनीय फिटिंग अधिक कठिन है ।

लंबी प्रक्षेप-पथ (चरण ४.९) का विश्लेषण उंहें सीमित (1), नि: शुल्क (2), या निर्देशित (3) के अनुसार उनके पहले पल और उसके स्थान के संबंध में २.५% और ९७.५% ब्राउनिआन गति के साथ ५०० यादृच्छिक रास्तों के पहले पल के शतमक के हिसाब से वर्गीकृत, एक ही प्रसार गुणांक और लंबाई के रूप में प्रक्षेपवक्र का विश्लेषण किया जा रहा है और मोंटे कार्लो द्वारा नकली । यदि पथ का पहला क्षण विश्लेषित किया जा रहा है तो पहले क्षणों के २.५% के नीचे है, जिसका अध्ययन किया जा रहा है, वह सीमित रूप में वर्गीकृत है । यदि यह नकली पहले क्षणों के ९७.५% से ऊपर है, यह निर्देश के रूप में वर्गीकृत है; अन्यथा, पथ को ब्राउनियां के रूप में वर्गीकृत किया जाता है । नियोजित आदेश में, 113.88 e-3 में पिक्सेल आकार है μm, ०.००१५ में मापा स्थिर स्पॉट के प्रसार गुणांक के ऊपरी बंधे है μm2/s, और ' Long ' आउटपुट फ़ाइल नाम के लिए प्रत्यय है । इस फ़ाइल का पहला कॉलम ("प्रक्षेपवक्रवर्गीकरण लांग. txt") प्रक्षेपपथ संख्या है, दूसरा इसके वर्गीकरण (1 = सीमित, 2 = मुक्त, 3 = निर्देशित) है, और तीसरे प्रक्षेपवक्र पहले पल है ।

प्रत्येक कण की तीव्रता की गणना के लिए स्क्रिप्ट (कदम ५.१) अत्यधिक लचीला है और कई अलग तरीके में प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रैकिंग की अनुमति देता है (हर एक अच्छी तरह से एक नियंत्रण प्रयोग के स्थिर स्पॉट ट्रैकिंग जैसे विभिंन स्थितियों के लिए अनुकूल है या चर फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि के साथ एक सेल पर उच्च जंगम स्पॉट ट्रैकिंग) । पटकथा सभी तख्तों के साथ सभी प्रक्षेप-पथ का विश्लेषण करेगी । प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक स्थान के लिए यह स्पॉट के आसपास पिक्सल की तीव्रता को मापने (यह एक आकार 3x3 पिक्सल के डिफ़ॉल्ट रूप से, घटनास्थल के आसपास एक वर्ग पैच का विश्लेषण करती है), हाजिर पृष्ठभूमि का अनुमान है और हाजिर और के बीच प्रतिदीप्ति अंतर की गणना पृष्ठभूमि. एक ही स्थान के रूप में देखा, एक ही क्लस्टर में फ्लोरोसेंट कणों की संख्या और photoब्लीचिंग कणों का प्रतिशत, इस तरह से अनुमान लगाया जा सकता है ।

इस स्वचालित विधि (Gatherप्रक्षेपके Classificationandतीव्रता) एकाधिक मापदंडों पर जानकारी का उत्पादन (हाजिर तीव्रता, पार्श्व प्रसार, गति के प्रकार), कि स्थान के आकार और बेसल शर्तों पर अपने गतिशील के बीच संबंध का अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं, और कैसे अलग उपचार इन मापदंडों को संशोधित कर सकते हैं ।

विधि की मुख्य सीमा है कि यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सेल अभिकर्मक की आवश्यकता को ट्रैक किया जाएगा । आमतौर पर अभिकर्मक प्रोटीन overexpression, एक तथ्य यह है कि एक प्रोटीन ट्रैकिंग बाधा की ओर जाता है । एक सेल छँटाई कदम रिसेप्टर्स कि SPT-TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा एक कणों का पता लगाने और ट्रैकिंग की अनुमति की एक संख्या व्यक्त कोशिकाओं का चयन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए. इस विधि भी क्वांटम डॉट्स या फैब टुकड़े के साथ लेबल जैव अणुओं ट्रैकिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है । वर्णित प्रोटोकॉल नियंत्रणों की एक संख्या की आवश्यकता है कि पहले विश्लेषण किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कि निष्कर्ष से प्रेरित निष्कर्षों सही हैं । सबसे पहले, यह उचित अभिव्यक्ति की स्थिति है कि पता लगाने और एकल कणों की ट्रैकिंग की अनुमति निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । ~ ४.५ कणों/μm2के घनत्व के साथ फिल्में, 8500-22000 रिसेप्टर्स/सेल के लिए इसी सेल झिल्ली रिसेप्टर13के spatio-लौकिक संगठन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

यह शुद्ध एकलक acgfp प्रोटीन या फिक्स्ड कोशिकाओं का उपयोग करके न्यूनतम detectable प्रसार गुणांक स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । दोनों ही मामलों में यह माना जाता है कि वहाँ कोई प्रसार है और इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि इन स्थितियों में विश्लेषित कणों के प्रसार मूल्यों को मैटीरियल कणों के अनुरूप और मोबाइल और मैटीरियल प्रक्षेप टोरी13के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया.

विश्लेषण हम यहां प्रस्तुत किया है एक सामांय प्रक्षेपवक्र विश्लेषण उपकरण है, जो superresolution द्वारा रिसेप्टर्स के प्रसार के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है, विवर्तन सीमित छवियों के विश्लेषण के लिए और मानक माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर आंदोलन के विश्लेषण के लिए . दूसरों के साथ इस विधि का मुख्य लाभ पहले से वर्णित है, इस तरह की संख्या और चमक11के विश्लेषण के रूप में, यह है कि यह अपने प्रक्षेपवक्र साथ प्रत्येक व्यक्ति स्थान के माध्य तीव्रता मूल्यों के मूल्यांकन की अनुमति देता है, खाते में लेने के समय photoब्लीचिंग से पहले AcGFP मोनोमेरिक प्रोटीन का अस्तित्व । Photoब्लीचिंग से पहले एक अणु के अस्तित्व का समय दृढ़ता से उत्तेजन शर्तों पर निर्भर करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनकी मदद और प्रसार गुणांक विश्लेषण के स्रोत कोड के लिए कार्लो Manzo और मारिया García प्लाजो के लिए आभारी हैं । इस काम के भाग में विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों (SAF 2017-82940-R) और instituto डी सैलड कार्लोस III के रेटिक्स कार्यक्रम के मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (RD12/0009/009 और RD16/0012/0006; आरआईईआर) । LMM और जेवी Fundación जनरल CSIC के COMFUTURO कार्यक्रम द्वारा समर्थित हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

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References

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Immunology और संक्रमण १४६ मुद्दा SPT chemokine रिसेप्टर ट्रैकिंग क्लस्टर प्रसार विश्लेषण सॉफ्टवेयर
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली रिसेप्टर्स के प्रसार और क्लस्टर आकार के विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल
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Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

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