Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Abstract

Monitoraggio su una sequenza video e l'analisi posteriore dei loro traiettorie delle particelle al giorno d'oggi sono un'operazione comune a molti studi biologici. Utilizzando l'analisi del ricevitore della membrana cellulare cluster come un modello, vi presentiamo un protocollo dettagliato per questa attività di analisi di immagine utilizzando Fiji (ImageJ) e routine di Matlab per: 1) definire le aree di interesse e progettare maschere adattate a queste regioni; 2) traccia le particelle in video microscopia di fluorescenza; 3) analizzare le caratteristiche di diffusione e l'intensità dei brani selezionati. I tipi di movimento e la dimensione dei cluster, analisi quantitativa dei coefficienti di diffusione ottenuta mediante microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini fornisce un valido strumento per determinare oggettivamente particelle dinamiche e le conseguenze della modifica condizioni ambientali. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per l'analisi di queste caratteristiche. Il metodo descritto qui non solo permette la rilevazione di rilevamento di singola molecola, ma consente anche di automatizzare la stima dei parametri di diffusione laterale alla membrana delle cellule, classifica il tipo di traiettoria e consente analisi completa superando così il Difficoltà a quantificare la dimensione dello spot sulla sua intera traiettoria alla membrana delle cellule.

Introduction

Proteine di membrana incorporati nel bilayer del lipido sono in continuo movimento a causa di diffusione termica. Le dinamiche sono essenziali per regolare le risposte cellulari, come interazioni intermolecolari permettono la formazione di complessi che variano nel formato da monomeri di oligomeri e influenzare la stabilità di complessi di segnalazione. Chiarire i meccanismi che controllano la dinamica della proteina è dunque una nuova sfida in biologia cellulare, necessaria per comprendere le vie di trasduzione del segnale e per identificare le funzioni delle cellule imprevisti.

Alcuni metodi ottici sono stati sviluppati per lo studio di queste interazioni in vivo le cellule¹. Tra questi, microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, sviluppata nei primi anni 1980, permette lo studio delle interazioni molecolari o molto vicino alla membrana cellulare². Per studiare i parametri dinamici di traiettorie di proteine di membrana ottenuti dai dati di TIRF in cellule viventi, una singola particella inseguimento del metodo (SPT) è richiesta. Anche se diversi algoritmi sono disponibili per questo, utilizziamo attualmente quelli pubblicati da Jaqaman et al.³ che indirizzo eterogeneità di movimento delle particelle in un campo di particelle dense collegando particelle tra fotogrammi consecutivi per collegare la traccia risultante segmenti in traiettorie complete (scomparsa temporanea delle particelle). Il software acquisisce la particella Unione e divisione di quel risultato da aggregazione e dissociazione eventi³. Uno dei dati di output di questo software è rilevamento delle particelle lungo l'intera traiettoria definendo le posizioni X e Y in ogni fotogramma.

Una volta che le particelle vengono rilevate, applichiamo diversi algoritmi per determinare l'intervallo breve diffusione coefficiente (D_1-4)^4,5. Applicando l'analisi di^{8 7,6,}momento Scaling spettro (MSS) o inserendo il valore di 'alpha' di regolazione della cilindrata di Mean Square (MSD) alla curva⁹, classifichiamo anche le particelle secondo il tipo di traiettoria.

Analisi di spot intensità nelle immagini di fluorescenza sono un obiettivo condiviso per gli scienziati nel campo^10,11. L'algoritmo più comune utilizzato è il cosiddetto numero e luminosità. Questo metodo tuttavia non consente rilevamento corretto frame-by-frame intensità in particelle nella frazione del mobile. Abbiamo, quindi, generato un nuovo algoritmo per valutare queste particelle intensità frame-by-frame e per determinare il loro stato di aggregazione. Una volta le coordinate di ogni particella vengono rilevate utilizzando U-Track2 software³, definiamo la sua intensità in ogni fotogramma sopra la traiettoria completa, tenendo conto anche lo sfondo della cella in ogni fotogramma. Questo software offre diverse possibilità per determinare l'intensità di spot e lo sfondo della cella e, utilizzando proteine note monomeriche e dimeriche come riferimenti, calcola il numero approssimativo delle proteine della particella rilevato (dimensione del cluster).

In questo articolo, descriviamo una guida attenta per eseguire questi tre passi: 1) rilevazione e monitoraggio delle singole particelle lungo un video di microscopia di fluorescenza usando U-traccia; 2) analizzare il coefficente di diffusione istantanea (D_1-4) di quelle particelle e al tipo di movimento (confinato, gratuito o diretto) di particelle con lunghe traiettorie di MSS; 3) misurando l'intensità posto lungo il video rettificato da fluorescenza di fondo stimato per ogni spot. Questo consente di stima delle dimensioni cluster e identificazione dei passaggi photobleaching.

L'utilizzo di questo protocollo non richiede competenze specialistiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con coltura cellulare, strutture di microscopia e citometria di flusso. Il protocollo utilizza ImageJ o Fiji (una distribuzione di ImageJ¹²), U-traccia³e alcune routine di hoc fatta di annuncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-traccia e ad hoc routine eseguite su Matlab che può essere installato in qualsiasi computer compatibile.

Protocol

1. preparazione dei campioni biologici

1. Crescere le cellule Jurkat in RPMI 1640 supplementato con 10% FCS, NaPyr e L-Glutammina (RPMI completo). Cellule di Electroporate Jurkat (20 x 10⁶ cellule/400 µ l di RPMI 1640 con 10% FCS) con un vettore di ricevitore di chemokine GFP-etichettata monomerico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) per consentire il rilevamento utilizzando la microscopia a fluorescenza.
   Nota: È possibile utilizzare altre proteine fluorescenti monomerici come mCherry, mScarlet, ecc.
2. 24 ore dopo la trasfezione di analizzare le cellule in un citometro a flusso per determinare sia la vitalità cellulare e l'espressione di CXCR4-AcGFP.
3. Selezionare le cellule che esprimono bassi livelli di CXCR4-AcGFP di ordinamento delle cellule delle cellule positive^basso di GFP (Figura 1), come bassa espressione del recettore trasfettato è richiesto in TIRFM esperimenti al fine di garantire il rilevamento di singola particella per l'analisi individuale traiettorie⁹.
4. Quantificare il numero di recettori sulla superficie cellulare.
   Nota: Come un esempio¹³, recettori AcGFP-labeled ~ 8.500-22.000/cella, corrispondono a ~ 2-4.5 particelle/μm².
5. Risospendere le cellule ordinate in RPMI completo e incubare per almeno 2 ore a 37 ° C, 5% CO₂. Centrifugare le cellule (300 x g, 5 min) e li risospesi in tampone TIRF (HBSS, 25mm HEPES, 2% FCS, pH 7,3).
   1. Piastra su piatti di pozzetti con fondo di vetro 35 mm (2-3 x 10⁵ cellule/piatto) ricoperta di fibronectina (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) in presenza o in assenza del ligando appropriato (cioè, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incubare le cellule (20 min a 37 ° C, 5% CO₂) prima dell'acquisizione dell'immagine.
6. Eseguire esperimenti utilizzando un microscopio TIRF, equipaggiato con una telecamera di EM-CCD, un obiettivo a immersione in olio di 100x (HCX PL APO 100 x / 1,46 NA) e un diodo laser di 488 nm. Il microscopio permette il controllo della temperatura e l'incubazione con CO₂. Individuare e mettere a fuoco le cellule con le manopole di messa a fuoco macro e micrometrica, utilizzando il campo luminoso per minimizzare gli effetti photobleaching. Per la regolazione di messa a fuoco in modalità TIRF usare laser a bassa intensità, insufficiente per il rilevamento di singola particella o di indurre effetti photobleaching (potere del laser di 5%, 28 μW).
7. Acquisire filmati (sequenze di immagini) di circa 50 s riducendo al minimo l'intervallo di tempo tra i fotogrammi. Penetrazione del campo evanescente dovrebbe essere 70-90 nm di profondità. Salvare i filmati acquisiti per ogni condizione sperimentale come ".lif" (video.lif).
   Nota: Film nell'esempio descritto sono state acquisite al 49% alla potenza del laser (2 mW) con un tempo di esposizione di 90 ms e un intervallo di tempo di 98 ms, per 49 s (500 fotogrammi). Penetrazione dell'onda evanescente selezionato era 90 nm.

2. selezione di immagini e creazione di maschere

1. Per ogni condizione sperimentale (video.lif), creare una nuova cartella (VideoName) che deve contenere diverse cartelle per ogni serie. Ogni cartella conterrà una cartella "videoSeq" per le immagini video e una cartella "risultati" per i risultati dell'analisi. Assicurarsi che la struttura di file in questo momento è il seguente:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/videoSeq
   VideoName/Series1/risultati
   Nota: Dal microscopio .lif diversi file sono ottenuti con diversi video per ogni condizione di trattamento (cioè FN, FN + SDF). "video.lif" corrisponde al file video input.lif, con tutte le acquisizioni di film TIRF (serie), eseguito al microscopio. "videoSeq" cartella conterrà i 500 fotogrammi del film che stiamo analizzando. La cartella "risultati" conterrà tutti i file risultanti dall'analisi effettuata. Nomenclatura precisa e localizzazione delle cartelle differenti sono essenziali per il corretto funzionamento degli algoritmi. I nomi in grassetto nell'elenco precedente sono fissi (cioè, devono essere chiamati in questo modo, perché questi sono i nomi ricercati dagli script). I nomi non in grassetto possono cambiare per riflettere l'esperimento eseguito.
2. Apri il video TIRFM (file .lif) con Fiji o ImageJ trascinando e rilasciando il file sulla barra dei menu Fiji e fare clic su OK per importare il file lif utilizzando BioFormats (complementare figura 1).
3. Selezionare la serie di elaborare e fare clic su OK (Supplemental Figura 2A). Per progettare una maschera per l'analisi di questo video, anche importare un'immagine multicanale con diversi cromofori (nell'esempio, la serie 1 è l'immagine multicanale e 2 serie il video corrispondente). Il video (e l'immagine multicanale) dovrebbe aprire come una pila di ImageJ. Nell'esempio (Supplemental figura 2B), l'immagine è a sinistra e il video è sulla destra.
   Nota: Se non è richiesta la creazione di una maschera per il video, andare al punto 2.5.
4. Creare una maschera. Creare una singola immagine con i canali utili per la progettazione della maschera. In questo caso, i canali interessanti sono quelli rosso, verde e grigio.
   1. Dividere i canali dall'immagine multicanale (complementare figura 3A): selezionare l'immagine nella barra dei menu e fare clic colore | Dividere canali. I diversi canali mostrerà come immagini separate (complementare figura 3B).
   2. Unire nuovamente i tre canali in un'unica immagine (Supplemental figura 4A): selezionare l'immagine nella barra dei menu e selezionare colore | Unire i canali. Selezionare i canali appropriati e premere OK (Supplemental figura 4B). Una nuova immagine non in pila sarà generato (Supplemental figura 4).
   3. Sincronizzare le due finestre utilizzando lo strumento di Sincronizzazione Windows (Supplemental Figura 5A): selezionare Analyze nella barra dei menu di | Strumenti | Sincronizzare Windows. Una nuova finestra con la possibilità di sincronizzare immagine apparirà (Supplemental figura 5B).
   4. Con le due finestre sincronizzate (solo il video se non c'è nessuna immagine multicanale associata), la stessa regione in entrambe le finestre possa essere ritagliata. Disegnare l'area di interesse con lo strumento selezione rettangolare di ImageJ menu fluttuante. Selezionare l'immagine nella barra dei menu e selezionare Ritaglia (Supplemental Figura 6A). Le immagini ritagliate due mostrerà individualmente (Supplemental Figura 6B).
   5. Unsynchronize entrambe le finestre (Supplemental Figura 6B) premendo il tasto Unsynchronize tutti in gestione Sincronizzazione di Windows .
5. Se una maschera non è stata creata come descritto al punto 2.4, disegnare l'area di interesse con lo strumento selezione rettangolare di ImageJ menu fluttuante.
6. Salvare il video come una sequenza di immagini nella directory videoSeq sotto la directory di video corrispondente (Supplemental figura 7A): selezionare File nella barra dei menu e fare clic Salva | Sequenza di immagini... rinominare le etichette per la sequenza dei video come video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (Supplemental figura 7B): nella casella nome , rinominare come video e fare clic su OK. La sequenza deve essere da solo nella relativa directory per essere utilizzato con successo da U-traccia.
   Nota: Se non la progettazione di una maschera per il video, andare al punto 2.8.
7. Progettazione di una maschera. Selezionare l'immagine multicanale e aprire il Editor di segmentazione plugin (Supplemental figura 8A): selezionare Plugins nella barra dei menu e selezionare segmentazione | Editor di segmentazione. Aggiungere e rinominare le etichette della segmentazione come necessario facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle etichette di editor di segmentazione (Supplemental Figura 8B, C).
   1. Scegliete lo strumento selezione appropriata nel menu mobile ImageJ (qui, utilizzare a mano libera), selezionare un'etichetta (verde) e progettare prima la maschera più esterna (Supplemental figura 9A). Una volta progettato, premere il pulsante + in opzione di selezione della finestra composita e la maschera selezionata verrà visualizzato nel Visualizzatore (Supplemental figura 9A). Ripetere questo passaggio con successiva etichette (interno, in rosso) (Supplemental figura 9B).
      Nota: Dopo aver progettato la maschera per le etichette verdi e interni, la maschera esterna occuperà il resto dell'immagine.
   2. Maschere sono codificate nell'immagine come regioni 0, 1, 2,... secondo l'ordine delle etichette nella finestra etichette RGB. Quando tutte le maschere per le diverse etichette sono progettate, salvare la maschera con lo stesso nome di file come video, con il nome mask.tif (Supplemental figura 9): selezionare File nella barra dei menu e selezionare Salva | TIFF....
      Nota: Le maschere selezionate saranno impiegate nel calcolo dei coefficienti di diffusione e classificazione delle traiettorie (Vedi punto 4.2).
8. Verifica che la struttura di file in questo momento è il seguente:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/mask.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
   ...
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
   VideoName/Series1/risultati
   Nota: La mask.tif è un'immagine con la maschera come progettato in passaggi 2.4 e 2.7. Il video*.tiff è il video come salvato in passaggio 2.6. Come sopra, i nomi in grassetto nell'elenco sopra riportato sono fisse, cioè, che devono essere chiamati in questo modo, perché questi sono i nomi ricercati dagli script. I nomi non in grassetto possono cambiare per riflettere l'esperimento eseguito.

3. monitoraggio delle particelle

1. Tenere traccia di tutte le particelle vista nei video selezionati tramite U-track.
2. Aprire Matlab e aggiungere directory U-traccia il percorso utilizzando il Set Path | Aggiungi con sottocartelle opzione nel menu. Salvare il percorso in modo che in futuro le esecuzioni di Matlab U-track è nel percorso. Questa impostazione del percorso deve essere fatto solo una volta.
3. Modificare la directory di lavoro alla directory contenente la serie per essere analizzati. U-traccia di richiamare digitando la console (Supplemental figura 10) movieSelectorGUI e premere INVIO. La finestra di selezione dei film sarà aperto (Supplemental Figura 11A).
4. Premere sul pulsante di film New e verrà visualizzata la finestra di Movie edition (Supplemental figura 11B).
5. Premere su Aggiungi canale per scegliere la directory con il video (VideoName/Series1/video) e riempire i film informazioni parametri. Impostare la directory di output per i risultati di U-traccia su risultati (videoName/Series1/risultati).
   Nota: I parametri di informazioni di film possono essere ricavati il microscopio e le condizioni di acquisizione.
6. Premere su Impostazioni avanzate di canale e riempire i parametri relazionati all'acquisizione. Guardare i valori dei parametri nell'esempio (Supplemental figura 11).
7. Premere Salva sulla finestra delle regolazioni avanzate canale e Salva sulla finestra Movie edition . Il programma chiederà conferma della scrittura del file chiamato movieData.mat nella directory di risultati . Confermare.
8. Dopo aver creato il filmato, premete su continua nella finestra di selezione di film. U-traccia chiederà circa il tipo di oggetto da analizzare. Scegliere Single-particelle (Supplemental figura 12). La finestra del pannello di controllo verrà visualizzato (Supplemental figura 13A).
   1. Selezionare il primo passo passo 1: rilevamento e premere sull'impostazione. (Supplemental figura 13B) verrà visualizzata la finestra di Impostazione gaussiana modello mistura raccordo . Nell'esempio, "Valore alfa per il confronto con sfondo locale" è impostata a 0,001 e "Con una media di Rolling-finestra tempo" 3 (Supplemental figura 13B).
   2. Premere su applica nella finestra Impostazioni gaussiana modello mistura montaggio e correre nel Pannello di controllo. Con la configurazione supplementare nella figura 13, solo il passaggio di rilevamento viene eseguito. Questo passaggio richiede pochi minuti (2-5). Verifica i risultati premendo il pulsante di risultato del passaggio 1 (Detection, supplementare figura 14).
      Nota: Come mostrato sopra, il filmato mostra i cerchi rossi sulle particelle rilevate. Se non appare nessun cerchio rosso, questo passaggio non ha funzionato correttamente.
9. Eseguire l'identificazione delle tracce, vale a dire l'Unione le particelle rilevate nel passaggio precedente in tracce che si estendono su più fotogrammi. Questo è il passo 2: rilevamento di U-traccia le cui impostazioni devono essere definite come mostrato nella Figura supplementare 15A-C. Le impostazioni della funzione costo passaggio 2 per il collegamento a un fotogramma e Gap di chiusura, fusione e scissione nell'esempio sono mostrate in Figura supplementare 15B e C, rispettivamente.
10. Dopo aver impostato i parametri per il passaggio 2, premere Esegui nel Pannello di controllo e solo passaggio 2 viene eseguito (Supplemental figura 16).
11. Eseguire l'analisi di traccia, passaggio 3. Definire le impostazioni come mostrato nella Figura 17 supplementare (pannello di destra). Quindi, premere applica nel pannello di impostazione-Motion Analysis ed eseguire in controllo pannello-U-Track. Questo passaggio richiede pochi secondi.
12. Verificare con il tasto del risultato del passaggio 3 che il processo abbia identificato correttamente tutte le tracce. Per farlo, fare clic su Mostra il numero di traccia della finestra Opzioni filmato e controllare fotogramma per fotogramma che ogni traccia è stato identificato correttamente (Supplemental figura 18). Annotare manualmente quelle particelle che non sono vere particelle.
    Nota: Se questa selezione manuale non è fatto, una selezione automatica più debole può essere eseguita più tardi quando si calcola il coefficiente di diffusione (Vedi punto 4).

4. calcolo dei coefficenti di diffusione e classificazione delle traiettorie

1. Assicurarsi che tutti gli script vengono richiamati dalla directory del video analizzato (nell'esempio, VideoName/Serie1).
2. Leggi tutte le traiettorie per calcolare i coefficienti di diffusione mediante l'emissione in Matlab console il comando: trajectories=readTrajectories(0.1), dove 0.1 è il tempo in secondi tra due fotogrammi consecutivi (intervallo di tempo, mostrato nel pannello film Informazioni, supplementare figura 11B).
3. Escludi traiettorie corrispondente erroneamente identificato macchie/traiettorie. Dare un elenco dei punti da escludere. Per esempio, per escludere i punti 4, 5 e 28, digitare: traiettorie = readTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
4. Calcolare i coefficienti di diffusione istantanea per ognuno dei brani di questa cella. In questo caso, calcolare il coefficiente di diffusione per un lasso di tempo = 4, chiamato D_1-4. Per farlo, eseguire in Matlab console il comando: D = calculateDiffusion (traiettorie, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha') dove le traiettorie sono le traiettorie ottenute nel passaggio 3, 113.88e-3 è la dimensione in pixel delle immagini acquisite in micron, 0,0015 è un limite superiore per i coefficenti di diffusione delle particelle immobile misurate in µm2/s e 'alpha' è il modello adattato come spiegato di seguito.
   Nota: Quando si utilizza una fotocamera più veloce e si desidera più fotogrammi per calcolare il parametro di diffusione aumentano, per esempio a 20, da D = calculateDiffusion (traiettorie, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', ', 20). Il parametro di stringa prima di 20, nell'esempio precedente, ', è il suffisso aggiunto al file di output. Questo suffisso può essere utilizzato per distinguere le diverse analisi.
5. Montare il MSD con una funzione diversa chiamando la funzione calculateDiffusion nuovo con una raccordo diverse modalità ('limitato', 'libero' o 'diretto'). In questo esempio, 'confinati': D = calculateDiffusion (traiettorie, 113.88e-3, 0,0015, 'confinati').
6. Ottenere i risultati di raccordo per il modello diretto, come mostrato nella Figura 20 supplementare.
7. Scomporre le traiettorie in traiettorie brevi e lunghi. Utilizzare il comando: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) dove 50 è la lunghezza minima in cornici di una traiettoria da considerarsi lungo (nell'esempio riportato).
8. Studiare le traiettorie breve utilizzando la stessa procedura di montaggio descritta al punto 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'regia', 'Corto'). Analizzare le traiettorie anomale e breve con il comando: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', 'Breve').
9. Analizzare lunghe traiettorie per classificare il tipo di movimento attraverso il loro spettro di Scaling momento (MSS)⁷. Il comando: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'Long') Mostra l'analisi nella schermata e genera un file chiamato trajectoryClassification < suffisso >. txt Directory results\TrackingPackage\tracks.

5. calcolo dei Cluster Ssize attraverso la densità delle particelle

Nota: Assicurarsi che tutti gli script vengono richiamati dalla directory del video analizzato (nell'esempio illustrato, VideoName/Serie1).

1. Analizzare l'intensità di ogni particella lungo la loro traiettoria. Per farlo, è necessario richiamare lo script digitando nella console di Matlab: analyzeSpotIntensities che accetta come input le traiettorie calcolate da U-traccia nella prima sezione. Nella sua forma più semplice, basta chiamare lo script senza alcun argomento dalla directory del video analizzato (nell'esempio illustrato, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Configurare questo comportamento di base in molti modi diversi, fornendo argomenti dello script come in: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, valore2,...). Argomenti validi con i corrispondenti valori di variabile ('ArgN´, valoreN) sono elencati.
   1. ('spotRadius´, 1)
      Analizzare l'intensità di fluorescenza utilizzando il spotRadius di 1 pixel (impostazione predefinita) che corrisponde a una patch di dimensioni 3x3 centrato nel punto ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Nota: Per una patch di 5 x 5 centrato nel punto, scegliere un spotRadius di 2, ecc.
   2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Se questo argomento è dato (true, il valore di 1), è possibile analizzare solo le traiettorie che iniziano nel primo fotogramma del video. Questo è utile per analizzare le immagini di controllo (di default 0, false).
   3. ('trackTrajectory´, 0)
      Se questo argomento è impostato su 0 (falso), quindi tenere la coordinata del punto in suo primo fotogramma per tutte le cornici (questo è utile per le macchie immobile). Se l'argomento è impostato su 1 (di default 1, true), quindi il posto viene rilevato lungo il video seguendo le coordinate calcolate da U-traccia.
   4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Includere il numero di traiettoria di tali traiettorie esclusi nella fase 4.3 (nell'esempio 4, 5, 28).
   5. ('extendTrajectory ', 1)
      Se questo argomento è impostato su 1 (true), quindi analizzare l'intensità nella patch fino alla fine del video (anche se la traiettoria si ferma all'inizio). La coordinata del punto è l'ultima coordinata nella traiettoria (se trackTrajectory è true) o la prima coordinata nella traiettoria (se trackTrajectory è false). Questo argomento è falso (0) per impostazione predefinita.
   6. ('subtractBackground´, 1)
      Se questo parametro è impostato, quindi corretto il crudo la fluorescenza misurata in ogni punto dalla stima di fluorescenza di fondo per questo spot (Vedi sotto). Questo argomento è vero (1), per impostazione predefinita.
   7. ('meanLength´, numero di telaio)
      Se questo parametro è impostato, il posto di intensità media è misurato la lunghezza indicata. Impostare 'meanLength', 20 di misurare l'intensità di spot media presso i primi 20 fotogrammi. Se l'argomento non è impostato, l'intensità di spot è calcolata l'intera traiettoria (per impostazione predefinita, integrale).
   8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Impostare questo parametro come 1 (di default 0, false), per tracciare il profilo di intensità lungo le cornici differenti come pure loro background.
      Nota: Queste trame sono molto utili per identificare photobleaching come mostrato nella Figura 21 supplementare. Per ogni percorso, la routine analizza automaticamente se è possibile che ci sia stato photobleaching. Ciò avviene confrontando i valori di intensità con t di uno studente nel primo e l'ultimo fotogramma N lungo il percorso. Per impostazione predefinita, N è 10, ma questo valore può essere modificato tramite l'argomento ' Nbleach´.
   9. ('backgroundMethod´, valore)
      Impostare questo parametro per determinare il fondo di ogni spot. Questo può essere fatto in diversi modi, e quello da utilizzare può essere selezionato cambia il "valore":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
         Utilizzare questo valore per identificare manualmente lo sfondo per l'intero video. Permettono di selezionare 8 punti nel primo fotogramma del video. Una patch attorno a questi punti è analizzata lungo tutto il video, e il quantile 95% di tutte queste intensità viene scelto come l'intensità di sfondo per tutti i punti.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
         Utilizzare questo valore per identificare manualmente lo sfondo per ogni fotogramma. Scegliere 8 punti per ogni punto e ogni fotogramma. Si tratta di un compito che richiede tempo, ma dà un sacco di controllo per l'utente. Il quantile 95% delle intensità in queste patch è scelto come l'intensità di sfondo per questo spot in questo frame.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
         Utilizzare questo valore per calcolare lo sfondo di ogni spot stimato da 8 punti si trova in un cerchio intorno il posto con un raggio controllato dall'argomento ' backgroundRadius´ (per impostazione predefinita, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
         Utilizzare questo valore per calcolare lo sfondo per ogni fotogramma prima individuazione della cella nel video e poi analizzando le intensità della cella in ogni fotogramma (Supplemental figura 22).
         Nota: Lo sfondo è stato scelto come il valore di grigio in un dato quantile di questa distribuzione (per impostazione predefinita 0,5 (= 50%), anche se questo parametro può essere controllato tramite l'argomento ' backgroundPercentile´, questo valore può essere impostato più alto, per esempio, 0,9 (= 90%) anche se la maggior parte della cella deve essere considerato come sfondo. Per aiutare nell'identificazione della cella, indicano quale è il valore di background massimo previsto lungo i fotogrammi usando l'argomento ' maxBackground´ (per esempio, in tutti i video analizzati, il valore di sfondo normalmente non va oltre 6000)¹³. Per impostazione predefinita, questa opzione è impostata su 0, ovvero che questo aiuto non viene utilizzato per impostazione predefinita. Vedere quale è la rilevazione delle cellule e l'area selezionata per la stima di sfondo impostando l'argomento ' showImages´ a 1 (fermata l'esecuzione in qualsiasi momento premendo CTRL-C).
2. Raccogliere le informazioni di diffusione e intensità per tutte le traiettorie calcolate in passaggi 4 e 5.1, rispettivamente, utilizzando gatherDiffusion.AndIntensity (). Raccogliere solo le informazioni di diffusione e intensità per breve traiettorie. Per farlo, utilizzare i suffissi utilizzati nel punto 4.7 e tipo: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) dove ' Short´ è il suffisso utilizzato nel passo 4.7.
3. Raccogliere la rappresentazione in scala di momento spettro e l'intensità informationby digitando: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') dove 'Lungo' è il suffisso utilizzato nel passo 4.7. Un riepilogo di tutti i file generati usando questo protocollo è illustrato nella Figura 2.

Representative Results

L'utilizzo di questo protocollo consente il rilevamento automatizzato delle particelle rilevato nel film di microscopia di fluorescenza e l'analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Inizialmente, le cellule transfected con la proteina fluorescente-accoppiato di cui tenere traccia. Il livello appropriato di recettori presenta sulla superficie delle cellule che permette che SPT è ottenuta dalla cella ordinamento (Figura 1). Celle selezionate vengono analizzate da microscopia TIRF che genera video in un formato che può essere studiato con gli strumenti descritti in questo protocollo (Supplemental Video 1).

I video generati non possono essere analizzati direttamente, e telai indipendenti di ogni video sono necessari. L'uso di ImageJ genera file che possono essere interpretati utilizzando Matlab software quali fotogrammi video nel formato. TIFF o maschere. U-traccia traccia le particelle visibile nel video selezionato e salva le informazioni nei file di Matlab (Mat) (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), Vedi Figura 2.

Come illustrato nella Figura 2, il calcolo dei coefficienti di diffusione e classificazione dei comandi di traiettorie, genera file diversi (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, ecc). Le informazioni contenute in questi file sono meglio gestiti utilizzando software Excel e prisma. Informazioni che possono essere ottenuti da questa analisi comprendono:

1. Percentuale di punti immobile. È possibile utilizzare come riferimento di particelle immobile: il 95% percentile di D_1-4 i valori ottenuti (1) da singole particelle in celle fisse e/o (2) da purificato proteina fluorescente collegato a lamelle (Figura 3A).
2. Percentuale delle traiettorie lunghe (> 50 fotogrammi) (Figura 3B).
3. Tipo di movimento delle traiettorie lunghe: diretto, libero, confinati (Figura 3).
4. Coefficente di diffusione (D_1-4) di particelle mobili in cellule trattate con stimoli diversi (Figura 4A).

Il passo 5 del protocollo analizza le intensità di ogni particella lungo la traiettoria. Il analyzeSpotIntensities di script verrà stampato sullo schermo tutte le informazioni analizzate. Per ogni spot e telaio, lo script Mostra le coordinate del punto in quel fotogramma (x, y) in unità di pixel, la stima di fluorescenza di fondo (k0), l'intensità di spot crudo nella patch 3 x 3, l'intensità corretta (calcolato come l'intensità prima meno suo Priorità bassa), il valore massimo di intensità osservata nella patch e il numero della regione all'interno della maschera, dove questo posto si trova in questo fotogramma. Un esempio del tipo di output prodotto è

punto = 43 telaio = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Tutte queste informazioni vengono memorizzate in un file di log (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) e una tabella che può essere letta da Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Dopo aver analizzato ogni spot, lo script stampa l'intensità media lungo la traiettoria e la regione maggioritaria all'interno della maschera

punto = 43
meanCorrectedSpotIntensity lungo frame = 4762.303
maggioritario regione = 3

Queste informazioni vengono memorizzate nel file di registro sopra e una tabella che può essere letto da un foglio di calcolo (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Ad esempio, media intensità spot (msi) per ogni particella lungo la loro traiettoria in cellule stimolate con condizioni diverse è mostrato in Figura 4B. Noi ora possiamo utilizzare queste informazioni per stimare approssimativamente la dimensione del cluster fluorescente. Come media di un posto intensità corretta è correlato con il numero di proteine fluorescenti presenti in questo luogo, e la fluorescenza di un monomero può essere misurata attraverso un esperimento simile ma indipendente, direttamente calcolare il numero di recettori per particella. La distribuzione di frequenza del numero di recettori per particella utilizzando come riferimento l'intensità della proteina monomerica espressa nelle stesse cellule è illustrata nella Figura 4.

La diffusione di raccogliere e intensità comando crea due file: uno chiamato diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txte un altro chiamato log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt nella directory risultati / TrackingPackage/tracce. Entrambi i file contengono 1) l'indice posto, 2) il coefficiente di diffusione, 3) l'intensità e 4) il numero della regione all'interno della maschera. Questi file possono essere letti da un foglio di calcolo.

Allo stesso modo, il comando di classificazione e intensità di traiettoria o raccogliere creerà due file uno chiamato trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt e un altro log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt nella Directory risultati/TrackingPackage/tracce. Il primo contiene 1) l'indice posto, 2) il tipo di movimento, 3) il punto primo momento, 4) l'intensità, 5) D_1-4 e 6) il numero della regione all'interno della maschera. Questo file può essere letto da Excel.

Un riepilogo di tutti i file generati usando questo protocollo è illustrato nella Figura 2. Altre analisi che possono essere eseguite usando questo protocollo comprende il confronto dei parametri dinamici di macchie più grandi di vs piccolo, cioè gli oligomeri di vs di monomeri, variazioni su questi parametri dinamici indotti da ligandi, inibitori, la composizione della membrana, alterazione del signaling pathways, ecc. Un'analisi completa del comportamento di CXCR4 in risposta al suo ligando CXCL12 in differenti condizioni sperimentali è stata eseguita utilizzando questo protocollo¹³.

Figura 1 : L'ordinamento cell. Espressione della GFP in Jurkat cellule trasfettate con CXCR4-AcGFP prima e dopo l'ordinamento delle cellule. Cellule che esprimono bassi livelli di GFP (GFP^basso) sono selezionate e utilizzate per esperimenti di TIRF.

Figura 2 : Riepilogo dei file generati. La figura Mostra tutti i file generati utilizzando la routine di Matlab descritta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Classificazione delle traiettorie. Numero di diversi tipi di traiettorie corrispondenti alle cellule trattate con diversi stimoli. (A) percentuale di macchie immobile, (B) percentuale di lunghe traiettorie e (C) tipo di movimento delle traiettorie lunghe.

Figura 4 : Diffusione coefficiente, media intensità spot e numero di recettori per particella. (A) distribuzione dei valori di coefficienti (D_1-4) breve diffusione per ogni spot in risposta a stimoli diversi (I, II, II e IV). Linea rossa rappresenta il valore mediano per D_1-4. (B) i valori di intensità media spot (msi) per ogni posto lungo i primi 20 frame in risposta a stimoli diversi (I, II, II e IV). Linea rossa rappresenta il valore di intensità media (SD). (C) percentuale di recettori/particella come estratti dalla distribuzione di intensità delle singole particelle, prendendo come bin larghezza il valore di intensità di proteina monomerica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare figura 1: Apertura di un file TIRFM in Fiji o ImageJ. Opzioni che appaiono sulla finestra di Bio-formati su trascinando e rilasciando un video di .lif. Per favore clicca qui per scaricare la figura. 

Supplementare nella figura 2: Selezionare la serie. Immagini presenti nel video .lif. Finestra di (A) che permette la selezione della serie ad essere analizzare, comprese le immagini multicanale. (B) esempio di risultato della selezione di serie, tra cui immagine multicanale (a sinistra) e registrazione video (a destra). Per favore clicca qui per scaricare la figura. 

Supplementare nella figura 3: Dividere i canali. (A) finestra acquisizione dei comandi ImageJ necessaria per spaccare i canali di un'immagine multicanale e (B) esempio di risultato del canale diviso. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 4: Canali di tipo merge. (A) l'Unione di diversi canali in un'unica immagine. (B) selezione per la fusione del canale. (C) esempio di risultato dell'Unione di canale. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare nella figura 5: Sincronizzare windows. Localizzazione (A) nel menu ImageJ dei comandi necessari per la sincronizzazione di immagine e la finestra risultante (B). Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 6: Selezionare la regione di interesse. (A) selezione della finestra di interesse utilizzando lo strumento selezione rettangolare e (B) risultato del ritaglio immagine. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare nella figura 7: Salvare il video. Salvare la regione di interesse come una sequenza di immagini e i parametri per il salvataggio come finestra di sequenza di immagine. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 8: Segmentazione. (A) Apri il segmentazione editor plugin nel menu plugin di ImageJ. (B) aggiungere etichette/materiali per la segmentazione. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare nella figura 9: Design di maschera. (A) selezione delle etichette appropriate e definizione della maschera verde. (B) selezione della maschera rossa. Esempio di due maschere corrispondenti ai due etichette. (C) salvare le maschere come un file TIFF. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 10: Directory di lavoro di MATLAB. Selezione della directory corretta contenente la serie per essere analizzati. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare nella figura 11: U-traccia dal menu principale. (A) selezione di film, edizione film (B) e (C) canale menu impostazioni. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare nella figura 12: Selezionare il tipo di oggetto da monitorare. Seleziona il rilevamento delle singole particelle. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare nella figura 13: Rilevamento di particelle. (A) U-traccia, pannello di controllo. (B) esempio di impostazioni per il rilevamento di particelle. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 14: Esempio di risultati per il rilevamento di particelle. Diverse finestre che includono un menu di Visualizzatore, menu di opzioni di film e il film. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 15: Menu di rilevamento. Esempio di impostazioni. Rilevamento (A), (B) impostazione - fotogramma per fotogramma che collega e (C) divario chiusura, Unione e divisione di menu. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 16: Esempio di risultati per particella di rilevamento. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 17: Menu di analisi di traccia. Esempio di impostazioni. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 18: Verifica di analisi della traccia. Schermata visualizzata dopo l'analisi di traccia, tra cui una finestra video mostrando le particelle rilevate e le loro tracce corrispondenti. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 19: Calcolo dei coefficenti di diffusione. Gli istogrammi dei coefficenti di diffusione calcolati (a sinistra) e la media al quadrato cilindrata (MSD, destra). Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 20: Calcolo dei coefficienti di diffusione come le modalità di raccordo diverse. Gli istogrammi dei coefficenti di diffusione calcolati (a sinistra) e la media al quadrato cilindrata (MSD, destra) per il modello confinato. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 21: Profili di intensità. Esempio di spot intensità lungo la sua traiettoria (linea blu) e sfondo (linea rossa). Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Supplementare figura 22: Sfondo per ogni fotogramma. Sinistra: Immagine campione delle cellule. Medio: Rilevato automaticamente la cella. A destra: Area selezionata automaticamente come sfondo. Per favore clicca qui per scaricare la figura.

Video supplementare 1: Esempio di un tipico videomicroscopia TIRF mostrando la presenza di particelle con intensità diverse e tipi di movimenti. Per favore clicca qui per scaricare il video.

Materiale supplementare 1: File contenente tutti gli script di protocollo impiegati nelle routine hoc impiegate per la classificazione delle traiettorie e l'analisi della dimensione del cluster. Per favore clicca qui per scaricare i materiali.

Discussion

Il metodo descritto è facile da eseguire anche senza avere alcuna precedente esperienza di lavoro con Matlab. Tuttavia, la routine di Matlab estremamente richiedono precisione con la nomenclatura dei comandi diversi e la localizzazione delle diverse cartelle impiegato dal programma. Di rilevamento routine di analisi (passaggio 3), più parametri possono essere modificati. La finestra "Impostazione gaussiana-miscela modello raccordo" (punto 3.8) controlla come U-traccia rileverà singole particelle sul video. Questo viene fatto inserendo un modello gaussiano miscela come descritto in³. Uno dei parametri chiavi per questo raccordo definisce un filtro per aiutare a identificare i massimi locali. Il successo di questa operazione dipende il contrasto dell'immagine e il rumore presente nelle immagini. Il primo parametro (valore alfa per il confronto con sfondo locale) controlla la fiducia di una maxima essendo un posto reale, mentre il secondo aiuta a ridurre il rumore durante l'identificazione dei punti. Parametri importanti per il passo di "Tracking" (3,9) sono il numero di fotogrammi per colmare le lacune (che è una pista può estendersi su più di fotogrammi in cui la particella non è effettivamente visto, ma si è visto prima queste cornici e dopo queste cornici; nell'esempio, 0) e il numero di fotogrammi che un brano deve estendersi al fine di essere considerato come un brano di successo (nel nostro esempio, 20; questo parametro è correlato alla velocità di acquisizione della fotocamera e i fotogrammi numeri della traccia devono essere tale da consentire il calcolo della diffusione co efficiente). È anche importante decidere se unire e dividere i segmenti (nell'esempio che sono stati scelti questi due possibilità). Quindi, i parametri per il passaggio 1 in funzioni di costo (collegamento a fotogramma per fotogramma) devono essere impostati. Questa funzione controlla il modo in cui le particelle vengono rilevate lungo le cornici. I parametri più importanti è a questo punto la selezione del raggio di ricerca browniano, che controllano quanto ogni spot dovrebbe essere nel frame successivo. Nel nostro esempio abbiamo scelto 0 e 5 come limiti inferiore e superiore, rispettivamente. Si noti che questi parametri sono specifici per la natura delle particelle monitorata e che potrebbero dover essere sintonizzati in ciascun caso specifico. Particolarmente importanti sono il potere di ridimensionamento nel browniano e lineare di ricerca raggi. Questi poteri di ridimensionamento dipendono dal tipo di movimento delle particelle (diffusione gratuita o ristretti). Nell'esempio, i valori (0,5, 0.01) sono stati scelti per libero diffusione. Per la documentazione specifica di questi parametri, vedere³.

Nel calcolo del comando di coefficienti di diffusione (punto 4.4), il limite superiore del coefficiente di diffusione di particelle immobile può essere conosciuto da precedenti esperimenti o eseguendo la funzione calculateDiffusion su un progetto separato con immobile particelle (purificata proteina monomerica fluorescente) e vedendo i coefficenti di diffusione segnalati. Questa funzione accetta due parametri aggiuntivi: ' outputSuffix´, che viene aggiunto per i nomi dei file di output e per impostazione predefinita porta il valore vuoto, e ' plotLength´, che per impostazione predefinita è 13 ed è il numero di lasso di tempo (secondi) in cui viene eseguito il calcolo della diffusione. La modalità di montaggio 'alpha' implica un adeguamento di MSD alla curva

vale a dire un offset (MSD₀) e una funzione di potere del tempo di ritardo. L'esponente di questa funzione di potenza, , determina se il movimento è limitato (0 < α < 0,6), anomala (0,6 < α < 0,9), libero (0,9 < α < 1.1), o diretto (α > 1.1). Per una recensione di questo tipo di analisi si rinvia a Manzo et al.⁹

Il calcolo dei coefficienti diffusione⁴ produce due figure di uscita (Vedi Supplemental figura 19). Il primo Mostra un istogramma della diffusione coefficienti calcolati (Nota che a questo punto, c'è un coefficente di diffusione indipendenti per ogni traiettoria). La media e il 95% percentile di questi coefficienti sono visualizzate nella console di Matlab. Il secondo grafico mostra il MSD (curva rossa) e il numero di passi considerati di calcolarlo in funzione del tempo GAL per tali traiettorie considerato mobile (quelli il cui coefficiente di diffusione è superiore alla soglia nella riga di comando). Viene calcolata la media e la deviazione standard delle traiettorie mobile (questi sono i valori per le traiettorie in una singola cella). Nell'esempio, l'esponente è 0,59 significato che il movimento è limitato. Per questo montaggio di curva, il programma segnala l'incertezza associata a ciascuno dei parametri (mostrato come la deviazione standard di ciascuna di esse) e la bontà di adattamento (una misura perfetta sarebbe arrivare a zero). A questo punto e dopo aver controllato il valore di alfa potremmo decidere di montare il MSD con una funzione diversa:

    Se 0 < α < 0.6 (limitato)

Se 0,9 < α < 1.1 (gratis)

Se α > 1.1 (diretto)

Traiettorie anomale non possono essere dotate di una funzione diversa. In caso di particelle confinate si può calcolare la dimensione di confinamento (in micron) come in Destainville et al.¹⁴

Un buon indicatore di un montaggio corretto è che la bontà di adattamento dovrebbe diminuire dall'alfa raccordo per il montaggio finale (nell'esempio, la bontà in forma cade da 0.30474 a 0.15749, supplementari figura 19-20). calculateDiffusioncreates due file in "results\TrackingPackage\tracks" all'interno della directory di serie chiamato "diffusionCoefficients.txt" e "diffusionCoefficientsMobile.txt". Questi file contengono tre colonne: 1) l'indice di ciascun ingresso traiettoria, 2) il loro corrispondente coefficiente di diffusione, 3) la regione maggioritaria nella maschera dove questa pista appartiene (le regioni sono ottenute dal file "mask.tif" che abbiamo generato nei passaggi 2.7; Se questo file non esiste, quindi questa colonna non è presente). È possibile utilizzare questo file e i file analoghi generati per altre cellule per analizzare la distribuzione del coefficiente di diffusione per un insieme di celle in condizioni sperimentali simili.

Nel calcolo del coefficiente di diffusione per breve traiettorie (passaggi 4.7-4.8), l'ultimo parametro 'Short' è un suffisso aggiunto al nome del file di output in modo che si possono analizzare diversi sottoinsiemi di traiettorie senza sovrascrivere il diffusionCoefficients.txt file. "DiffusionCoefficients < suffisso >. txt" e "diffusionCoefficientsMobile < suffisso >. txt" è il nome effettivo del file di output. Se non è dato alcun suffisso, come in generale analisi eseguita sopra, quindi presuppone un suffisso vuoto. I parametri del modello (D, v e MSD₀) possono differire da quelli montati su tutte le traiettorie. Il più notevolmente, la deviazione standard dei parametri così come la bontà di adattamento normalmente aumentano. Il motivo è che traiettorie brevi sono più instabili e un montaggio affidabile è più difficile.

L'analisi delle traiettorie lunghe (passo 4.9) classificarli in ristretti (1), gratis (2), o diretto (3) secondo il loro primo momento e la sua posizione per quanto riguarda i percentili 2,5% e il 97,5% del primo momento di 500 percorsi casuali con moto browniano, lo stesso Coefficente di diffusione e lunghezza della traiettoria viene analizzato e simulata da Monte Carlo. Se il primo momento del percorso analizzato è sotto il 2,5% dei primi momenti osservati nelle simulazioni, il percorso in fase di studio è classificato come limitato. Se è sopra il 97,5% dei primi momenti simulati, è classificato come diretto; in caso contrario, il percorso è classificato come browniano. Nel comando impiegato, 113.88e-3 è la dimensione in pixel in µm, 0,0015 è il limite superiore del coefficiente di diffusione di immobile punti misurati in µm/s²e 'Lunga' è il suffisso per il nome del file di output. La prima colonna di questo file ("trajectoryClassificationLong.txt") è il numero di traiettoria, il secondo è la sua classificazione (1 = confinato, 2 = libera, 3 = diretto), e il terzo è la traiettoria primo momento.

Lo script per il calcolo dell'intensità di ogni particella (azione 5.1) è estremamente flessibile e consente di tenere traccia le intensità di fluorescenza in modi diversi (ciascuno adatto per diverse situazioni come immobile macchie di un esperimento di controllo di monitoraggio o rilevamento punti altamente mobili su una cella con sfondo fluorescente variabile). Lo script analizzerà tutte le traiettorie lungo tutti i fotogrammi. Per ogni posto a ogni fotogramma sarà misurare l'intensità dei pixel intorno il posto (analizza una patch quadrata intorno sul posto, per impostazione predefinita di un pixel di dimensioni 3x3), stimare il punto di base e calcola la differenza di fluorescenza tra il luogo e la Priorità bassa. La percentuale di particelle photobleaching e il numero di particelle fluorescenti in un singolo cluster, visto come un singolo punto, può essere stimata in questo modo.

Questo metodo automatizzato (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) produce informazioni su molteplici parametri (spot intensità, diffusione laterale, tipo di movimento), che può aiutare a studiare la relazione tra dimensione dello spot e la sua dinamica alle condizioni basali, e come trattamenti diversi possono modificare questi parametri.

La limitazione principale del metodo è che richiede transfezione delle cellule con la proteina fluorescente da rilevare. Transfezione di solito porta alla sovraespressione di proteina, un fatto che ostacola la singola proteina di rilevamento. Una cella ordinamento passo deve essere inclusa per selezionare celle esprimendo un numero di recettori che permettono la rilevazione e il monitoraggio delle singole particelle da microscopia SPT-TIRF. Questo metodo potrebbe essere impiegato anche per tenere traccia delle biomolecole etichettati con punti quantici o frammenti Fab. Il protocollo descritto richiede un numero di controlli che devono essere analizzati in precedenza al fine di garantire la corrette delle conclusioni guidate dall'analisi. Prima di tutto, è fondamentale per determinare le condizioni di espressione appropriata che consentono il rilevamento e tracking delle singole particelle. Film con densità di ~ 4,5 particelle/µm², corrispondente a 8.500-22.000 recettori/cella, sono stati utilizzati per analizzare l'organizzazione spazio-temporale della membrana delle cellule del ricevitore¹³.

È importante determinare il coefficiente di diffusione rilevabile minimo utilizzando proteine purificate di AcGFP monomeriche o celle fisse. In entrambi i casi si presume che non c'è nessuna diffusione e pertanto si stima che i valori di diffusione delle particelle analizzate in queste condizioni corrispondono alle particelle immobilizzate e utilizzato per discriminare tra mobile e immobile traiettorie¹³.

L'analisi che abbiamo presentato qui è uno strumento di analisi della traiettoria generale, che può essere applicato all'analisi della diffusione dei recettori di superresolution, all'analisi delle immagini di diffrazione limitata e l'analisi del movimento cellulare da microscopia standard . Il vantaggio principale di questo metodo con altri precedentemente descritti, quali l'analisi delle luminosità e numero¹¹, è che permette la valutazione dei valori di intensità media di ogni singolo spot lungo la sua traiettoria, tenendo conto del tempo di sopravvivenza della proteina monomerica AcGFP prima photobleaching. Il tempo di sopravvivenza di una molecola prima photobleaching dipenderà fortemente le condizioni di eccitazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software