Summary
ここでは、単一粒子の拡散係数、蛍光顕微鏡で検出する単一粒子の運動とクラスター サイズの種類の定量評価ができる画像解析を追跡するためのプロトコルを提案する.
Abstract
粒子追跡ビデオ シーケンスとそれらの軌道の事後解析では、今日多くの生物学研究の一般的な操作です。細胞膜受容体の解析を使用してクラスター モデルが、フィジー (ImageJ) および Matlab ルーチンを使用してこの画像解析タスクの詳細なプロトコルを提案する: 1) 関心領域を定義し、これらの地域に適応したマスクをデザイン2) 蛍光顕微鏡動画内の粒子を追跡します。3) 選択したトラックの拡散と強度特性を解析する.拡散係数の定量的解析、モーション、およびクラスター サイズの型を用いて蛍光顕微鏡と画像処理が粒子のダイナミクスと変更の結果を客観的に判断するための貴重なツールを提供します環境条件。この記事ではこれらの機能の解析のための詳しいプロトコルを提案する.説明する方法ここでだけでなく単一分子追跡検出が細胞膜で横方向の拡散パラメーターの推定の自動化にも、軌道の種類を分類でき、したがって克服する完全な分析、細胞膜でその全体の軌道上のスポット サイズを定量化の難しさ。
Introduction
脂質二重膜に埋め込まれる膜タンパク質は、熱拡散のための連続的な動きにあります。そのダイナミクスは、分子間相互作用は、オリゴマー、モノマーからサイズが異なります、シグナリング複合体の安定性に影響を与える複合体の形成を許可する細胞応答を調整することが不可欠。細胞生物学、シグナル伝達経路を理解し、予期しない細胞機能を識別するために必要な新たな挑戦は、蛋白質ダイナミクスの制御機構の解明。
いくつかの光学的手法が開発されている細胞1生活のこれらの相互作用を研究します。これらのうち、全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡、1980 年代初頭に開発によりでまたは非常に近い細胞膜2分子間相互作用の研究ができます。細胞内の全反射データから得られる膜タンパク質軌道の動的パラメーターを研究、単一粒子追跡法 (SPT) が必要です。いくつかのアルゴリズムがこれを利用可能な我々 は現在結果のトラックを接続するための連続するフレーム間の粒子をリンクすることにより密な粒子フィールドの粒子運動の不均質性をアドレス Jaqaman ら3の発行するものを使用します。完全な軌道 (一時粒子消失) にセグメント。ソフトウェア キャプチャ粒子凝集・解離のイベント3からその結果を分割します。このソフトウェアの出力データの 1 つは、各フレーム内の X と Y の位置を定義することによって全体の軌道に沿って粒子の検出です。
粒子が検出されると、我々 は短い兼ねた拡散係数 (D1-4)4,5を決定するさまざまなアルゴリズムを適用します。よると粒子も瞬間スケーリング スペクトル (MSS)6,7,8解析を適用することによって、または調整曲線9平均二乗変位 (MSD) の 'アルファ' 値を当てはめによる分類します。軌道の種類。
蛍光画像でスポットの強度の分析は、フィールド10,11の科学者の共通の目的です。使用される最も一般的なアルゴリズムは、いわゆる数と明るさです。このメソッドそれにもかかわらずモバイル画分中の粒子の正しいフレームで強度の検出をできませんは。我々 はしたがって、これら粒子の強度によってフレームを評価して、凝集状態を決定する新しいアルゴリズムを生成しています。U Track2 ソフトウェア3を使用して、各粒子の座標を検出、一度定義その強度各フレームで完全な軌跡を各フレームでセルの背景を考慮します。このソフトウェアは、スポットの強度とセルの背景色を決定するさまざまな可能性を提供していて、粒子の検出 (クラスター サイズ) で蛋白質のおおよその数を計算します、参照として知られている単量体および二量体のタンパク質を使用します。
この資料で述べるこれらの 3 つの手順を実行する注意ガイド: 1) の検出と U-トラックを使用して蛍光顕微鏡のビデオに沿って 1 つの粒子を追跡2) 分析瞬時拡散係数 (D1-4) それらの粒子と MSS; による長い軌道で粒子の運動 (閉じ込められ、無料、フリー、または監督) の種類3) 各スポットに推定される背景の蛍光性によって修正ビデオに沿ってスポットの強度を測定しました。これは、クラスター サイズの推定とフォトブリーチを行なった手順を識別できます。
このプロトコルの使用特別なスキルを必要としない研究室では細胞培養を行うことが、フローサイトメトリー、顕微鏡設備の流れ。プロトコルは、ImageJ やフィジー (ImageJ12分布)、U トラック3、いくつかの広告を作ったホック ルーチン (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) を使用します。U トラックおよびアドホック ルーチンは、任意の互換性のあるコンピューターにインストールすることができます Matlab 上実行します。
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Protocol
1. 生物学的試料の調製
- 成長 10% FCS RPMI 1640 培 Jurkat 細胞 NaPyr、L-グルタミン (完全な RPMI)。Electroporate Jurkat 細胞 (20 x 106セル/400 μ 10 %fcs と RPMI 1640) 単量体 GFP 標識ケモカイン受容体ベクトル (CXCR4-AcGFP、20 μ g) 蛍光顕微鏡を用いた検出を許可するとします。
注:MCherry、mScarlet など他の単量体の蛍光タンパク質を使用することが可能です。 - トランスフェクション後 24 時間は、細胞生存率と CXCR4 AcGFP 式の両方を決定する流れの cytometer 細胞を分析します。
- Transfected 受容体の発現は低下は個々 のトレースの単一粒子追跡を保障するために観察実験に必要な細胞が GFP低陽性細胞 (図 1) の選別による低 CXCR4 AcGFP レベルを表現するセルを選択します軌道9。
- 細胞表面の受容体の数を定量化します。
注:例として13〜 8,500 22,000 AcGFP ラベル受容体/セル、〜 2 4.5 μ m2に対応します。 -
完全に RPMI で並べ替えられた細胞を再懸濁し、37 ° C、5% CO2で少なくとも 2 時間インキュベートします。(300 × g, 5 min)、細胞を遠心し、全反射のバッファー (HBSS、25 mM HEPES、2% の FCS、pH 7.3) でそれらを再停止されます。
- 適切な配位子 (すなわち、cxcl 12、100 nM、1 h、37 ° C) の有無でフィブロネクチン (20 μ g/mL, 1 h, 37 ° C) でコーティング プレート 35 mm ガラス底マイクロウェル皿 (105セル/料理 x 2-3)。画像の取得前に細胞 (37 ° C、5% CO2で 20 分) を孵化させなさい。
- 油浸対物レンズ × 100、EM CCD カメラを搭載した全反射顕微鏡を用いた実験を行う (HCX PL APO 100 x 1.46/NA) 488 nm のダイオード レーザー。顕微鏡では、温度制御と CO2の孵化をことができます。検索し、フォトブリーチング効果を最小限に抑えるために明るいフィールドを使用して粗・微動フォーカス ノブを持つセルをフォーカスします。全反射モードで細かいフォーカス調整のため単一粒子検出または退色効果 (5% レーザパワー, 28 μ W) を誘導するためには不十分な低レーザー強度を使用します。
- 約 50 の映画 (映像) を取得 s フレーム間の時間間隔を最小限に抑えます。エバネッ セント場侵入は 70-90 nm の深さにする必要があります。「.Lif」(video.lif) として、実験条件ごとに取得した映画を保存します。
注:記述例では映画はレーザー パワーで 49% で買収された (2 mW) 90 ms の露光時間と 49 の 98 ms の間隔 s (500 フレーム)。選択したエバネッ セント波の侵入は 90 nm。
2. 画像とマスクの作成の選択
- (Video.lif) 実験条件ごとに、すべてのシリーズの別のフォルダーを含める必要があります新しいフォルダー (VideoName) を作成します。各フォルダーは、ビデオ画像の"videoSeq"フォルダーと分析の結果の「結果」フォルダーに格納されます。現時点でファイル構造は次のとおりであることを確認します。
VideoName/video.lif
VideoName/シリーズ1/videoSeq
VideoName/Series1/結果
注:顕微鏡から別の .lif ファイルはすべての治療条件 (FN、FN + 自衛隊) のいくつかのビデオが取得されます。"video.lif"は、すべて全反射映画買収 (シリーズ) と input.lif ビデオ ファイル、顕微鏡で実行に対応します。"videoSeq"フォルダーは、我々 が分析しているムービーの 500 フレームが格納されます。「結果」フォルダー実行分析で得られたすべてのファイルが含まれます。正確な名称と異なるフォルダーのローカライズは、アルゴリズムの正しい機能に不可欠です。太字の名前上記のリストでは固定されます (すなわち、彼らは名は、スクリプトによって求められているのでこの方法で呼び出される必要がある)。太字ではない名前は、実験の実行を反映するように変更できます。 - ドラッグ アンド フィジー メニュー バーと[ok]を BioFormats (補足図 1) を使用して lif ファイルをインポートするをクリックしてのファイルをドロップして、フィジーや ImageJ で観察ビデオ (.lif ファイル) を開きます。
- 処理OK (補足図 2 a) をクリックして系列を選択します。このビデオの分析用マスクを設計、インポートも異なる発色団とマルチ チャンネル画像 (例では、シリーズ 1 はマルチ チャンネル画像と対応するビデオ シリーズ 2)。ビデオ (およびマルチ チャンネル画像) は、ImageJ スタックとして開く必要があります。(補足図 2 b) の例では左側に画像とビデオは右側。
注:ビデオのマスクの作成が必要でない場合は、ステップ 2.5 に移動します。 - マスクを作成します。マスクの設計に有効なチャンネルと単一のイメージを作成します。この場合、興味深いチャネル、赤、緑、灰色のものです。
- マルチ チャンネル画像 (補足図 3 a) からチャンネルを分割: バーでイメージを選択] メニューのとクリック色 |チャンネルを分割。別のチャネルは、(補足図 3B) の別々 の画像として表示されます。
- 単一のイメージ (補足図 4 a) で再び 3 チャンネルの統合: バーでイメージを選択メニューと選択色 |チャンネルの統合。適切なチャネルを選択して[ok] (補足図 4 b) を押します。新しい非積み上げイメージになります (補足図 4) を生成します。
- Windows の同期ツール (補足図 5 a) を使用して 2 つのウィンドウを同期: バーの分析を選択メニュー |ツール |同期の窓。(補足図 5B) 同期画像の可能性を持つ新しいウィンドウが現れます。
- Windows では、2 つ同期 (だけビデオがないマルチ チャンネル画像が関連付けられている場合)、両方のウィンドウで同じ領域をトリミングできます。ImageJ フローティング メニューの長方形選択ツールで関心領域を描画します。バーでイメージ選択メニューと選択作物(補足図 6A)。2 つのトリミングされた画像が個別に表示されます (補足図 6 b)。
- Windows 同期マネージャーですべての Unsynchronizeボタンを押して、両方の windows (補足図 6B) を unsynchronize します。
- ステップ 2.4 のようにマスクを作成していない場合は、ImageJ フローティング メニューの長方形選択ツールに関心の領域を描画します。
- (補足図 7A) 対応するビデオ ディレクトリの下のディレクトリvideoSeqにイメージ シーケンスとしてビデオを保存: バーでファイルを選択メニューとクリックしてを付けて保存 |イメージ シーケンスしています... video0000.tif、video0001.tif、...、video0499.tif (補足図 7 b) として映像のラベルの名前を変更: [名] ボックスで、ビデオとして名前を変更し、 [ok]をクリックします。シーケンスは、U トラックによって正常に使用されるディレクトリにだけである必要があります。
注:されていない場合はステップ 2.8 に行くビデオのためのマスクを設計します。 - マスクをデザインします。マルチ チャンネル画像を選択し、セグメンテーション エディターのプラグイン (補足図 8 a) を開きます: バーのプラグインを選択] メニューと [分割 |セグメンテーション エディター。追加し、セグメンテーション エディター (補足図 8 b、C) のラベルを右クリックして必要に応じて、セグメンテーションのラベルの名前を変更します。
- ImageJ フローティング メニューで適切な選択ツールを選択 (ここでは、手書きに使用)、ラベル (緑) を選択し、(補足図 9A) の最も外側のマスクを最初にデザインします。設計されていて、合成ウィンドウの選択、選択したマスクのボタンを押して+はビューアー (補足図 9 a) に表示されます。この手順は、次のラベル (インテリア、赤で) と (補足図 9 b)。
注:グリーンとインテリアのラベルのマスクをデザインした後、外装のマスクは画像の残りの部分を占有します。 - マスクは、領域 0、1、2 とイメージでコーディングが.RGB でラベルの順序に従ってウィンドウをラベルします。すべてのマスクの別のラベルに設計され、保存とマスク名mask.tif (補足図 9) で、動画と同じファイル名を持つ: バーでファイルを選択メニューと選択を付けて保存 |Tiff.。
注:選択したマスクは、(手順 4.2 参照) 軌道の分類と拡散係数の計算に採用されるでしょう。
- ImageJ フローティング メニューで適切な選択ツールを選択 (ここでは、手書きに使用)、ラベル (緑) を選択し、(補足図 9A) の最も外側のマスクを最初にデザインします。設計されていて、合成ウィンドウの選択、選択したマスクのボタンを押して+はビューアー (補足図 9 a) に表示されます。この手順は、次のラベル (インテリア、赤で) と (補足図 9 b)。
- 現時点でファイル構造は次のとおりであることを確認します。
VideoName/video.lif
VideoName/シリーズ1/mask.tif
VideoName/シリーズ 1/ videoSeq/video0000.tif
VideoName/シリーズ 1/ videoSeq/video0001.tif
...
VideoName/シリーズ 1/ videoSeq/video0499.tif
VideoName/Series1/結果
注:手順 2.4、2.7 で、mask.tif はマスクと画像です。ステップ 2.6 で保存すると、video*.tiff は、ビデオです。名前の太字の上記のように、上記のリストに固定されて、すなわち、彼らは名は、スクリプトによって求められているのでこの方法で呼び出されます。太字ではない名前は、実験の実行を反映するように変更できます。
3. 粒子の追跡
- U トラックを使用して選択した動画で見られるすべての粒子を追跡します。
- Matlab を開き、のパスの設定を使用して、U トラック ディレクトリをパスに追加 |追加メニューのサブフォルダー オプションを使用します。将来的に処刑の Matlab U ・ トラックがパスになるようにパスを保存します。このパス設定は一度だけ行う必要があります。
- 作業ディレクトリを分析するシリーズを含むディレクトリに変更します。U トラックを呼び出すコンソール (補足図 10) movieSelectorGUIに入力して、enter キーを押します。映画の選択ウィンドウになります (補足図 11 a) を開いた。
- 新規ムービーのボタンを押すし、映画版ウィンドウ (補足図 11 b) が表示されます。
- 追加チャネルのビデオ (VideoName/Series1/ビデオ) でディレクトリを選択して、映画情報のパラメーターを入力するを押します。結果(videoName/Series1/結果) を U トラックの結果の出力ディレクトリを設定します。
注:映画情報のパラメーターは、顕微鏡と獲得条件から入手できます。 - 高度なチャネルの設定を押し、買収に関連するパラメーターを入力します。(補足図 11) の例で、パラメーターの値を見てください。
- 高度なチャンネル設定ウィンドウで保存し、劇場版ウィンドウに保存を押します。プログラムは、結果ディレクトリにmovieData.matと呼ばれるファイルへの書き込みの確認が要求されます。確認します。
-
作成したムービーは、映画の選択ウィンドウで続行を押します。U トラックは分析対象とするオブジェクトの種類について尋ねます。単一粒子 (補足図 12) を選択します。[コントロール パネル] ウィンドウ (補足図 13A) が表示されます。
- 最初のステップを選択手順 1: 検出設定のキーを押します。設定ガウス混合物モデルのフィッティングウィンドウ (補足図 13B) が表示されます。例では、「ローカルのバック グラウンドとの比較のためアルファ値」は 3 (補足図 13B) 0.001 と「ローリング ウィンドウ時間平均化」に設定されます。
- 適用設定ガウス混合物モデルのフィッティングの] ウィンドウで、コントロール パネルの実行を押します。補足図13] 構成の検出手順のみを実行します。この手順では、(2-5) を数分をかかります。ステップ 1 (検出、補足図 14) の結果ボタンを押して結果を確認します。
注:上図のように、映画は、検出した異物に赤丸を示しています。赤い丸が表示されてない場合、この手順は働いていない正しく。
- トラック、つまり、複数のフレームにまたがるトラックに前の手順で検出された粒子の結合の識別を実行します。これは、ステップ 2: 追跡U トラック設定の補足図 15A Cに示すように定義しなければなりません。例ではフレームにリンクとのギャップを閉じる、マージおよび分割のステップ 2 費用関数の設定はそれぞれ補足図 15 bとCのとおりです。
- ステップ 2 のパラメーターを設定した後コントロール パネルの実行を押して、手順 2 だけを実行 (補足図 16)。
- トラック分析、手順 3 を実行します。補足図 17 (右側のパネル) で示すように、設定を定義します。適用を押して設定運動の解析、および実行コントロール パネル-U-トラックでのパネルに。この手順は、数秒をかかります。
- ステップ 3 の結果ボタンで、プロセスがすべてのトラックを正しく認識しているを確認します。方法については、ビデオ オプションウィンドウのトラック数を表示をクリックし、(補足図 18) を正しく識別されるフレーム単位で各トラックをされていることを確認してください。手動で真の粒子ではないそれらの粒子に注釈を付けます。
注:この手動で選択が行われていない場合、(手順 4 を参照)、拡散係数を計算するときに弱い自動選択を後で実行できます。
4. 軌道区分と拡散係数の計算
- (例では、VideoName/Serie1) で解析されてビデオのディレクトリからすべてのスクリプトが呼び出されたことを確認します。
- Matlab の発行による拡散係数のコンソール コマンドを計算するすべての軌道を読む: trajectories=readTrajectories(0.1)0.1 が 2 つの連続したフレーム (時間間隔、映画のパネルで表示間隔 (秒) 時であります。については、補足図 11 b)。
- 誤って識別されたスポット/軌道に対応する軌道を除外します。除外するスポットのリストを与えます。例えば、4、5、28 スポットを除外するを入力: 軌道 = readTrajectories (0.1、[4, 5, 28])。
- このセルのトラックのそれぞれの瞬時拡散係数を計算します。この場合は、タイムラグの拡散係数を計算 = 4、D1-4と呼ばれます。Matlab コンソールでコマンドを実行、そう: D = calculateDiffusion (113.88e の軌跡-3、0.0015、'アルファ')軌道がステップ 3、113.88e で取得した軌跡を-3 はミクロン単位で取得した画像のピクセル サイズ、0.0015 は、下記のとおり、単位 μ m2/s と 'アルファ' で不動の粒子の拡散係数の上限は装備のモデルです。
注:高速カメラと必要性を使用して拡散パラメーターを計算するより多くのフレーム、例えばに増加 20 でD = calculateDiffusion (113.88e の軌跡-3、0.0015、'アルファ'、'、20)。上記の例では、20 の前に文字列パラメーター '、出力ファイルに追加されるサフィックスです。このサフィックスは、異なる分析を区別するために使用可能性があります。 - 再び別の継ぎ手のモード ('限定'、'自由'、または '監督') で calculateDiffusion 関数を呼び出して別の関数で MSD に合います。この例では、'限定': D = calculateDiffusion (113.88e の軌跡-3、0.0015、'限定')。
- 補足図 20に示すように、監督のモデルの近似の結果を取得します。
- 短期および長期の軌道に軌道を分解します。コマンドを使用します: [shortTrajectories、longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) 50 が長い (例) で考慮する軌道のフレームの最小の長さ。
- ステップ 4.3 に記載されている同じフィッティング処理を用いた短い軌跡の研究: D = calculateDiffusion (shortTrajectories、113.88e-3、0.0015、'監督'、'短い')。コマンドで短いと異常な軌道の分析: D = calculateDiffusion (shortTrajectories、113.88e-3、0.0015、'アルファ'、'短い')。
- その瞬間スケーリング スペクトル (MSS)7を通して動きのタイプを分類する長い軌跡を分析します。コマンド: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories、113.88e-3,0.0015、'Long') 画面の分析を示し、 trajectoryClassification < サフィックス > .txtという名前のファイルを生成する、ディレクトリresults\TrackingPackage\tracks。
5. 粒子密度を介してクラスター s サイズの計算
注:(例では、VideoName/Serie1) 分析されるビデオのディレクトリからすべてのスクリプトが呼び出されたことを確認します。
-
彼らの軌道に沿って各粒子の強度を分析します。そうすることで、Matlab コンソールで入力してスクリプトを呼び出す: analyzeSpotIntensities として受け取る入力最初のセクションの U トラックで計算した軌道。その最も基本的なフォームでは、単に (例では、VideoName/シリーズ 1) 分析されるビデオのディレクトリから引数なしスクリプトを呼び出す analyzeSpotIntensities()。同様にスクリプトへの引数を提供することによってさまざまな方法でこの基本的な動作を構成する: analyzeSpotIntensities ('Arg1´、Value1、' Arg2´、Value2,...)。有効な引数の対応する変数の値 ('ArgN´、ValueN) が一覧表示されます。
- ('spotRadius´、1)
サイズ 3 × 3 スポット ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)) で中心のパッチに対応する (既定) 1 ピクセルの spotRadius を使用して蛍光強度を分析します。
注:スポットを中心とした 5 x 5 のパッチの選択、spotRadius 2、等します。 - ('onlyInitialTrajectories´、1)
この引数 (true の場合、1 の値) を指定、場合は、ビデオの最初のフレームで開始する軌道のみを分析します。これは (既定では 0、false) コントロールの画像を分析すると便利です。 - (' 0 trackTrajectory´)
この引数は、0 (false) に設定されている場合 (これは不動点のため便利です) すべてのフレームの最初のフレームにスポットの座標を維持します。(既定では 1, 真) を 1 に引数を設定される場合スポットが U トラック ビデオ次の座標計算に沿って追跡されます。 - (' [4,5,28] excludeTrajectories´)
(例では、4、5、28) ステップ 4.3 除外それらの軌道の軌道数が含まれます。 - (' 1 extendTrajectory ´)
この引数は、1 (true) に設定されている場合 (軌道は以前停止した) 場合でも、ビデオの最後にパッチの強度を分析します。スポットの座標は (trackTrajectory が true) の場合、軌道上の最後の座標または軌道に最初の座標 (偽 trackTrajectory の場合)。この引数は、既定では false (0)。 - ('subtractBackground´、1)
このパラメーターが設定されている場合、正しい生蛍光測定の各スポットで場所 (下記参照) を背景の蛍光性の推定。この引数は、デフォルトでは true (1)。 - ('meanLength´、フレーム番号)
このパラメーターを設定すると、平均強度スポットを表示された長さで測定します。最初 20 フレームで平均スポット強度を測定するため 20 ' meanLength' を設定します。引数が設定されていない場合スポット強度が (既定では、完全な長さ) 全体の軌道で計算されます。 - ('showIntensityProfiles´、1)
1 としてその背景と同様に、別のフレームに沿って強度分布をプロットする (既定では 0、false)、このパラメーターを設定します。
注:これらのプロットは、補足図 21に示すように退色を識別するために非常に便利です。すべてのパスのルーチンは退色があった可能性がある場合自動的に分析します。これは、パスに沿った最初と最後の N フレームでスチューデントの t の強度の値を比較することによって行われます。既定では、N が 10 が、この値は引数を通じて変更することができます ' Nbleach´。 - ('backgroundMethod´、値)
各スポットの背景を決めるこのパラメーターを設定します。これは、いくつかの方法で行うことができます、使用する選択した変化する「値」をすることができます。- (' 0 backgroundMethod´)
全体のビデオの背景を手動で識別するためにこの値を使用します。ビデオの最初のフレームで 8 ポイントを選択することができます。全体のビデオに沿ってこれらの点の周りのパッチを解析し、すべてのスポットの背景強度として選択するとこれらのすべての強度の 95% 位。 - ('backgroundMethod´、1)
手動で各フレームの背景を識別するためにこの値を使用します。すべてのスポットとフレームごとの 8 ポイントを選択します。これは時間のかかる作業ですが、それはユーザーに多くの制御を与えます。これらのパッチの強度の 95% 位はこのフレームでこのスポットの背景強度として選択されます。 - ('backgroundMethod´、2)
使用引数によって制御される半径の円スポットの周りにある 8 ポイントから推定した各スポットの背景を計算する値。 この ' backgroundRadius´ (デフォルトでは、4 * spotRadius)。 - ('backgroundMethod´、3)
この値を使用して、最初のビデオでセルを検索し、それぞれの枠 (補足図 22) のセルの強度を分析して、各フレームの背景を計算します。
注:この分布の与えられた位でグレー値として背景を選択 (既定値は 0.5 (= 50%)、このパラメーターは引数を介して制御することができますが ' backgroundPercentile´、この値を大きく設定する、例えば、0.9 (= 90%)場合は、背景として考慮されるべき細胞のほとんどをしたいです。セルの識別のために、引数を使用してフレームに沿って期待されて最大のバック グラウンド値であることを示す「(例えば、のすべての分析ビデオ、バック グラウンド値 6000 を超えて通常決して) maxBackground´13。既定では、このオプションは、既定でこのヘルプが使用されないことを意味 0 に設定されます。細胞の検出と背景推定の引数を設定することにより選択領域であるを参照してください ' 1 (停止 ctrl + C を押すことによっていつでも実行) に showImages´。
- (' 0 backgroundMethod´)
- ('spotRadius´、1)
- GatherDiffusion.AndIntensity () を使用して、それぞれの手順 4 で 5.1 計算すべての軌道の拡散と明度の情報を収集します。短い軌道の拡散と強度の情報のみを収集します。そうステップ 4.7 とタイプで使用されているサフィックスを使用: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) 、' Short´ は 4.7 ステップで使用されるサフィックス。
- 瞬間スペクトルのスケーリングと強度情報入力を収集: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') 'Long' サフィックスで使用場所ステップ 4.7。このプロトコルを使用して生成されたすべてのファイルの概要は、図 2の通りです。
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Representative Results
このプロトコルは、使用蛍光顕微鏡映画とその動的特性の解析で検出された粒子の自動追跡です。当初、セルは追跡する蛍光結合タンパク質をトランスフェクトしました。SPT は、ソーティング (図 1) によって得られることができる細胞表面受容体の適切なレベルを示します。選択したセルは、このプロトコル (補足のビデオ 1) で説明されているツールを学ぶことができる形式の動画を生成する全反射型顕微鏡によって分析されます。
生成された動画を直接分析できないし、各ビデオの独立したフレームが必要です。ImageJ の使用は、.tiff 形式またはマスクのビデオ フレームなど Matlab ソフトウェアを使用して解釈することができますファイルを生成します。U トラック選択したビデオで見られる粒子を追跡し、Matlab (.mat) ファイル (movieData.mat Channel_1_detection_result.mat、channel_1.mat、Channel_1_tracking_result.mat) に、情報を保存、図 2を参照してください。
拡散係数の計算と、軌道のコマンドの分類が異なるファイル (diffusionCoefficients.txt、 diffusionCoefficientsMobile.txtを生成する図 2のように、diffusionCoefficientsShort.txt、trajectoryClassificationLong.txt、等)。これらのファイルに含まれる情報は、Excel とプリズムのソフトウェアを使用して管理が最適。この分析から得られる情報は次のとおりです。
- 不動点の割合です。不動粒子の参照として使用できます: D1-4取得した値 (1) (2) 精製された蛍光タンパク質からおよび/または固定細胞における単一粒子からの 95% パーセン タイル (図 3 a) coverslips に接続されています。
- 長い軌道の割合 (> 50 フレーム) (図 3 b)。
- 長い軌跡の動きの種類: 監督、無料、閉じ込められた (図 3)。
- セルの移動粒子の拡散係数 (D1-4) は、異なる刺激 (図 4 a) と扱われます。
プロトコルの手順 5 では、軌道に沿って各粒子の強度を分析します。スクリプトanalyzeSpotIntensitiesは、分析したすべての情報を画面に印刷されます。各スポットに示し、フレーム、スクリプト、フレーム (x, y) の点の座標ピクセル単位で、背景の蛍光性 (k0) 3 x 3 パッチ、修正された強度で生スポット強度の推定 (マイナス生強度として計算その背景)、このスポットがパッチとマスク内の領域番号で強度の最大値はこのフレームにあります。生成される出力の種類の例です。
スポット 43 フレームを = = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
k0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2
このすべての情報は、ログ ファイル (results/TrackingPackage/tracks/log.txt)、Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt) から読むことができますテーブルに格納されます。各スポットを分析した後、スクリプト出力する軌道とマスク内 majoritarian 領域に沿って平均強度
スポット = 43
フレームに沿って meanCorrectedSpotIntensity = 4762.303
majoritarian 地域 = 3
この情報は、上記のログ ファイル、スプレッドシート (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt) から読むことができますテーブルに格納されます。例として、図 4 bに別の条件刺激の彼らの軌道に沿ってすべての粒子の平均スポット強度 (msi) を示します。今、蛍光のクラスターのサイズを概算するのにこの情報を使用可能性があります。スポットの平均として修正された強度蛍光タンパク質であるこの場所の数と関連しているとモノマーの蛍光は似ていますが、独立した実験によって測定することができます、パーティクルごと受容体の数を直接計算。受容体参照する同じセルで表される単量体蛋白質の強度を用いた微粒子数の頻度分布を図 4に示します。
収集拡散と強度コマンド 2 つファイルを作成: 1 つのと呼ばれるdiffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtとディレクトリに別のと呼ばれるlog_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtの結果/TrackingPackage/トラック。両方のファイルには、1) スポット インデックス、2) 拡散係数、3)、強度、4) マスク内の地域番号が含まれています。これらのファイルは、スプレッドシートから読むことができます。
同様に、収集軌道分類と強度コマンドによって作成されます 2 つのファイル 1 と呼ばれるtrajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txtと別のlog_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txtで、ディレクトリの結果/TrackingPackage/トラック。最初の 1 つには、1) スポット インデックス、移動タイプ: 2)、3)、スポット最初の瞬間、4) 強度、5) D1-4および 6) マスク内の地域番号が含まれます。このファイルは、Excel から読み取ることができます。
このプロトコルを使用して生成されたすべてのファイルの概要は、図 2の通りです。他の分析には、このプロトコルを使用して実行することができます小さな対大きなスポット、すなわちモノマー対オリゴマー、配位子、阻害剤、膜組成によるこれらの動的パラメーターの変動の動的なパラメーターの比較が含まれていますシグナリング経路、等の改ざん。異なる実験条件下でそのリガンド cxcl 12 への応答における CXCR4 挙動の完全な分析は、このプロトコルの13を使用して行われています。
図 1: セルソートします。Jurkat 細胞における GFP の発現を細胞選別の前後に CXCR4 AcGFP トランスフェクトしました。GFP (GFP低) の低レベルを表現するセルを選択し、全反射実験を採用します。
図 2: 生成されたファイル概要。図は、記載されている Matlab ルーチンを使用して生成されたすべてのファイルを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 軌道の分類。さまざまな刺激を細胞に対応する軌道の種類の数です。不動点の長い軌跡の (C) タイプの長い軌跡の動き (B) 割合 (A) の割合。
図 4: 拡散係数の平均スポット強度と粒子あたり受容体数。(A) (I、II、II、IV) さまざまな刺激への応答内の各スポットの短い拡散係数 (D1-4) の値の分布。赤い線は、D1-4の中央値を表します。(B) (I、II、II、IV) さまざまな刺激への応答で最初 20 フレームに沿って各スポットの平均スポット強度 (msi) 値。赤い線は、平均強度値 (SD) を表します。箱幅として単量体蛋白質の輝度値を取って個々 の粒子の強度分布から抽出として受容体/粒子の割合を (C)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1:フィジーや ImageJ で観察ファイルを開きます。ドラッグ アンド ドロップ .lif ビデオにバイオ形式のウィンドウに表示されるオプションです。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 2:系列を選択します。画像は、.lif ビデオで提示します。マルチ チャンネル画像を含む、分析するシリーズの選択を許可する (A) ウィンドウ。(B) のシリーズ選択などマルチ チャンネル画像 (左) とビデオ (右) 対応する結果の例。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 3:チャンネルに分割します。(A) ウィンドウの分割のマルチ チャンネル画像と (B) の結果例でチャネルのチャネルを分割するための ImageJ コマンドのキャプチャに必要な。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 4:チャンネルを統合。(A) 1 つの画像で異なるチャンネルを統合します。(B) チャンネルのマージを選択します。(C) チャネル結合の結果例。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 5:Windows を同期します。(A) と (B) 結果ウィンドウのイメージの同期に必要なコマンド ImageJ メニューの局在の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 6:関心の領域を選択します。(A) の長方形選択ツール、画像トリミングの (B) の結果を使用して興味のウィンドウを選択します。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 7:ビデオを保存します。イメージ シーケンス ウィンドウとしてイメージ シーケンスおよびパラメーターとして保存のための関心領域を保存します。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 8:セグメンテーション。(A) オープン ImageJ のプラグイン メニューでセグメンテーション エディターのプラグイン。(B) ラベル/セグメンテーションのための材料を追加します。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 9:マスク デザイン。(A) 適切なラベルと緑のマスクの定義を選択します。(B) 赤のマスクの選択。2 つのラベルに対応する 2 つのマスクの例です。(C) マスクを .tiff ファイルとして保存します。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 10:Matlab の作業ディレクトリ。分析するシリーズを含む適切なディレクトリの選択。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 11:U トラックのメイン メニューです。(A) (C)、(B) 劇場版映画の選択チャネルの設定メニュー。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 12:追跡するオブジェクトの種類を選択します。単一粒子の追跡を選択します。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 13:粒子の検出。(A) U トラック コントロール パネル(B) 粒子の検出のための設定の例です。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 14:粒子の検出の結果の例です。映画と映画のオプション メニュー ビューア メニューを含む別のウィンドウ。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 15:追跡メニュー。設定の例です。追跡 (A)、(B) の設定 - フレーム リンク及び (C) ギャップを閉じる、マージと分割のメニュー。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 16:粒子追跡の結果の例です。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 17:トラック分析メニュー。設定の例です。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 18:トラック分析を検証します。トラック分析、検出粒子を示すビデオ ウィンドウの対応するトラックなどの後に表示される画面。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 19:拡散係数の計算。拡散係数のヒストグラム計算 (左) と平均二乗変位 (MSD、右)。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 20:別の継ぎ手のモードを含む拡散係数の計算。拡散係数のヒストグラム計算 (左) と平均二乗変位 (MSD、右) 限られたモデル。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 21:強度プロファイル。その軌道 (青線) と背景 (赤い線) に沿ってスポット強度の例です。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 22:各フレームの背景。左: サンプル セル画像。中央: 自動的にセルを検出しました。右: 領域は、背景として自動的に選択します。の図をダウンロードするここをクリックしてください。
補足ビデオ 1:強度の異なる運動の種類と粒子の存在を示す典型的な全反射顕微鏡の例です。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足資料 1:クラスター サイズの軌道の分類および解析の採用アドホックルーチンで採用されているすべてのプロトコル スクリプトを含むファイル。材料をダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、Matlab の使用経験がなくても実行する簡単です。しかし、Matlab ルーチンは非常に、さまざまなコマンドの名称とプログラムで採用されている別のフォルダーのローカライズ精度必要があります。追跡解析ルーチン (ステップ 3)、複数のパラメーターを変更することができます。「設定ガウス混合物モデルふさわしい」ウィンドウ (手順 3.8) U トラックがビデオの単一粒子を検出する方法を制御します。これは、3で説明したように、ガウス混合物モデル当てはめによる。このフィッティングの重要なパラメーターの 1 つは、極大を識別するためのフィルターを定義します。この操作の成功は、画像のコントラストとノイズ画像の存在に依存します。最初のパラメーター (ローカル バック グラウンドとの比較のアルファ値) は、スポットの識別中にノイズを低減する 2 番目の支援中の実際の場所をされているマキシマの自信を制御します。「追跡」の手順 (3.9) で重要なパラメーターはギャップを閉じるするフレームの数 (つまり、トラックは粒子は実際に見られないそれはこれらフレーム前に、これらのフレーム後; 0 の例で見られるフレームにまたがる可能性があります)、および巧妙なトラックとして考慮するためにトラックにまたがる必要がありますフレーム数 (例では、20; このパラメーターはカメラ取り込み速度に関連し、拡散 co の計算を許可するように、トラックの数フレームがある必要があります効率的な)。また、マージし、(例ではこれら 2 つの可能性が選ばれた) セグメントを分割するかどうかを決定することが重要です。その後、(フレームごとにリンク) コスト関数でステップ 1 のパラメーターを設定する必要があります。この関数は、フレームに沿っての粒子の追跡方法を制御します。最も重要なパラメーターは、どのコントロールに各スポットが次のフレームにする予定ですどの程度までブラウン検索半径の選択をこの時点でです。私たちの例では、下限と上限、としての 0 と 5 をそれぞれ選んだ我々。これらのパラメーターは、追跡されている粒子の性質に非常に特定、彼らがそれぞれの特定のケースでチューニングする必要がありますに注意してください。特に重要なは、ブラウン運動のスケール パワーとリニアは、半径を検索します。力のスケーリング (無料か限られた拡散) 粒子の動きの種類によって決まります。例では、値 (0.5, 0.01) が無料の拡散を選ばれました。これらのパラメーターの特定のドキュメント、3を参照してください。
拡散係数コマンド (ステップ 4.4) の計算の場合は、以前の実験から、または不動の別プロジェクトで calculateDiffusion 関数を実行してに、不動粒子の拡散係数の上限を知ることができます。粒子 (精製単量体蛍光タンパク質) と拡散係数を見て報告します。この関数は、2 つの余分なパラメーターを受け取ります: 'を出力ファイル名に追加され、既定では空の値を受け取り、outputSuffix´ と' plotLength´ で既定では、13 をされ拡散計算を行うは、遅れ時間 (秒) の番号。フィッティング モード 'α' を意味するカーブに MSD の調整
つまり、オフセット (MSD0) とは、時間の電源機能ラグします。この関数の指数
、動きが限定されているかどうかを決定します (0 < α < 0.6)、異常 (0.6 < α < 0.9)、無料 (0.9 < α < 1.1)、または (α > 1.1) を指示します。この種の分析のレビュー読者 Manzo ら9を呼びます
拡散係数4の計算には、2 つの出力図 (補足図 19を参照) が生成されます。最初の 1 つは、拡散係数計算 (注この時点は各軌道の独立した拡散係数) のヒストグラムを示しています。平均値とこれらの係数の 95% パーセン タイルは、Matlab のコンソールに表示されます。2 番目のプロットは、MSD (赤いカーブ) とモバイルと見なされますそれらの軌道の時間差の関数として計算すると見なされます (それらが拡散係数は、コマンド ・ ラインで指定されたしきい値を超えている) ステップの数を示します。平均およびモバイルの軌跡の標準偏差が計算されます (これらは 1 つのセル内の軌道の値です)。例では、指数部は動きが限られている 0.59 の意味です。このカーブ フィット プログラムは、(完璧にフィットがゼロに達すると思います) (それぞれの標準偏差として表示) パラメーターのそれぞれの 1 つ、フィット感の良さに関連付けられた不確実性を報告します。この時点で、アルファの値を確認した後で別の関数 MSD に合わせて場合もあります。
0 の場合 < α < 0.6 (限定)
場合は 0.9 < α < 1.1 (無料)
場合 α > 1.1 (監督)
異常な軌道は、別の関数により装着できません。閉じ込められた粒子の場合可能性がありますサイズを計算する閉じ込め (ミクロン) で Destainville らのように14
正しいフィッティングの目安は適合度が最終的なフィッティングにふさわしいアルファから減らす必要があります (例では、フィットの良さ 0.30474 からに落ちる 0.15749、補足図 19-20)。シリーズ ディレクトリ内の"results\TrackingPackage\tracks"で calculateDiffusioncreates の 2 つのファイルでは、"diffusionCoefficients.txt"と"diffusionCoefficientsMobile.txt"と呼ばれます。これらのファイルには 3 つの列が含まれている: 1) それぞれのインデックス入力軌道、2) 対応する拡散係数、3) このトラックに属するマスク majoritarian 地域 (地域は「mask.tif」の手順で作成したファイルから取得されます2.7;このファイルが存在しない場合、この列が存在しない) です。同様の実験条件下でのセルのセットに対して拡散係数の分布を分析するのにこのファイルと他のセルに対して生成された類似のファイルを使用可能性があります。
短い軌道 (手順 4.7 4.8) の拡散係数の計算に '短い' の最後のパラメーターは、を上書きすることがなく軌道の異なるサブセットを分析することがありますので、出力ファイル名に追加するサフィックスdiffusionCoefficients.txtファイル。出力ファイルの実際の名前は、"diffusionCoefficients < サフィックス > .txt"、"diffusionCoefficientsMobile < サフィックス > .txt"です。サフィックスを指定しない場合、上記の一般的な分析のように、空の拡張子が使用されます。モデルのパラメーター (MSD、v、D0) はすべて軌道に取り付けられたものを異なる場合があります。最も驚くべきことに、パラメーターとして適合度の標準偏差は通常増加します。理由は、短い軌道がより安定した、信頼性の高い継ぎ手がより困難です。
長い軌道 (ステップ 4.9) の分析分類それら限られた (1) 無料 (2)、またはその最初の瞬間と 500 のランダムなパスの最初の瞬間の 2.5%、97.5% パーセン タイルに関してその場所に応じて、同じブラウン運動を利用した監督 (3)拡散係数と分析して、モンテカルロ法によるシミュレーションの軌跡としての長さ。分析対象パスの最初の瞬間は、シミュレーションで観測された最初の瞬間の 2.5% 以下は場合、検討されているパスは限定として分類されます。監督; として分類されるシミュレーションの最初の瞬間の 97.5% 以上の場合それ以外の場合、パスは、ブラウン運動として分類されます。コマンドで採用されている、113.88e-3 μ m のピクセル サイズ、0.0015 μ m2/s と '長い' を測定した不動のスポットの拡散係数の上限は出力ファイル名のサフィックス。軌道数は、このファイル ("trajectoryClassificationLong.txt") の最初の列、2 番目はその分類 (1 = 限定、2 = 無料、3 = 監督)、3 番目は軌道の最初の瞬間。
各パーティクル (ステップ 5.1) の強度を計算するスクリプトは非常に柔軟なとさまざまな方法で蛍光強度を追跡できます (コントロール実験の不動点の追跡のようなさまざまな状況に適しています各 1 つまたは追跡高可動スポット可変蛍光背景とセルの上)。スクリプトは、すべてのフレームに沿ってすべての軌道を分析します。各フレームで各スポットのそれは (既定ではサイズ 3 × 3 ピクセルの分析、スポットの周りの正方形パッチ) スポット周辺ピクセルの輝度を測定、スポットの背景し、スポットの蛍光差を計算を推定し、背景。フォトブリーチング粒子および単一の場所として見られて、1 つのクラスター内の蛍光粒子の数の割合をこの方法で推定できます。
この自動化されたメソッド (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) を生成スポット サイズとその動的基底条件での関係を研究することができます、複数のパラメーター (スポットの強度、水平拡散、モーションのタイプ) に関する情報とどのさまざまな治療法は、これらのパラメーターを変更できます。
メソッドの主な制限は、追跡する蛍光タンパク質を持つ細胞トランスフェクションを必要とすることです。通常トランスフェクションは、蛋白過剰発現、タンパク質 1 分子追跡を妨げることにつながります。ステップの並べ替えセルは、セルの検出を許可する受容体の数を表現し、SPT 全反射型顕微鏡による単一粒子の追跡を選択する含める必要があります。このメソッドは、生体分子の量子ドットで標識を追跡するため採用される可能性があります。 または Fab フラグメントします。記述されていたプロトコル分析から結論が正しいことを確認するために以前に解析しなければならないコントロールの数が必要です。まず、単一の粒子の検出と追跡を許可する適切な式の条件を決めることが大事です。密度の映画 〜 4.5 μ m2、8,500 22,000 受容体/セルに対応する細胞膜受容体13の時空間的組織を分析する使用されました。
浄化された単量体 AcGFP 蛋白質または固定セルを使用して最小検出可能な拡散係数を確立することが重要です。両方のケースで、拡散がない、したがって推定分析これらの条件で粒子の拡散値が固定化粒子に対応し、モバイルと不動の軌跡13の間で区別するために使用されます。
ここで提案した解析は標準顕微鏡による超解像による受容体の拡散の解析、回折限界画像の解析、細胞運動の解析に適用できる一般的な軌道解析ツール.他の数と明るさの11の分析など、前に説明した、この方法の主な利点は、考慮の時間を割いて、その軌道に沿って、個々 の現場の平均輝度値の評価できます。退色する前に AcGFP の単量体蛋白質の生存。退色する前に分子の生存期間は強く励起条件によって異なります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は拡散係数解析のヘルプとソース コード カルロ Manzo とマリア ・ ガルシア ・ Parajo に感謝しています。この作品は一部スペイン語科学省、イノベーションや大学 (SAF 2017-82940-R) からの助成金によって支えられた、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス 3 世 (RD12/0009/009 と RD16/0012/0006; の RETICS プログラムRIER)。LMM との JV は、フンダシオン一般 CSIC の COMFUTURO プログラムによってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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