Summary
Здесь мы представляем собой протокол для одной частицы, отслеживания анализа изображений, что позволяет дать количественную оценку коэффициентов диффузии, типы движения и кластер размеров одной частицы, обнаруженных микроскопии флуоресцирования.
Abstract
Отслеживание на видео последовательности и задняя анализ их траекторий частиц в настоящее время является общей операцией во многих биологических исследованиях. С помощью анализа рецептор клеточной мембраны кластеры как модель, мы представляем подробный протокол для этой задачи анализа изображений, с помощью Matlab процедуры и Фиджи (ImageJ): 1) определить регионы интереса и дизайн масок, адаптированных для этих регионов; 2) отслеживать частицы в видео микроскопии флуоресцирования; 3) проанализируйте характеристики распространения и интенсивности выбранных треков. Количественный анализ коэффициентов диффузии, типы движения и размер кластера получены микроскопии флуоресцирования и обработки изображений обеспечивает ценный инструмент для объективно определить динамику частиц и последствия изменения условия окружающей среды. В этой статье мы представляем подробные протоколы для анализа этих функций. Метод, описанный здесь не только позволяет одной молекулы отслеживания обнаружения, но также автоматизирует Оценка параметров поперечной диффузии на клеточные мембраны, классифицирует тип траектории и позволяет полный анализ таким образом преодолеть трудности в количественном определении размера пятна по всей траектории в клеточной мембраны.
Introduction
Мембранных белков, встроенных в липидный бислой находятся в постоянном движении, за счет диффузии тепловой. Их динамика необходимо регулировать клеток ответов, как межмолекулярные взаимодействия позволяют образование комплексов, которые варьируются в размерах от мономеров олигомеров и повлиять на стабильность сигнализации комплексов. Таким образом, изучение механизмов контроля динамики белков является новый вызов в клеточной биологии, необходимо понять сигнальных путей и определить функции непредвиденные клеток.
Были разработаны некоторые оптические методы для изучения этих взаимодействий в живых клетках1. Среди них полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF), разработанная в начале 1980-х годов, позволяет изучения молекулярных взаимодействий на или вблизи мембраны клетки2. Для изучения динамических параметров мембранных белков траекторий полученных данных TIRF в живых клетках, требуется одна частица отслеживания метод (SPT). Хотя некоторые алгоритмы доступны для этого, мы в настоящее время использовать тех, опубликованной3 Jaqaman et al., что адрес неоднородности движения частиц в поле плотные частицы, связывая частицы между последовательными кадрами для подключения в результате трек сегменты в полной траектории (временные частиц исчезновение). Программное обеспечение захватывает частицы, объединение и разбиение что результат агрегации и диссоциации события3. Один из выходных данных этого программного обеспечения является обнаружение частиц по всей траектории, определяя их X и Y позиции в каждом кадре.
После обнаружения частиц, мы применяем различные алгоритмы для определения короткий слаборазвитость диффузии коэффициент (D1-4)4,5. Применяя анализ8 момент расширения спектра (MSS)6,7,или путем установки значения «альфа» регулировка среднеквадратичной перемещения (MSD) на кривой9мы также классифицировать частицы согласно Тип траектории.
Анализ пятно интенсивности флуоресценции изображения является общей целью для ученых в области10,11. Наиболее распространенными алгоритм, используемый является так называемый номер и яркость. Этот метод тем не менее не позволяет правильно по кадрам интенсивности обнаружения частиц в мобильных фракции. Таким образом, мы породили новый алгоритм для оценки этих частиц света--кадра и определить состояние их агрегирования. Как только координаты каждой частицы определяются с помощью программного обеспечения U-Track23, мы определяем его интенсивность в каждом фрейме над полным траектории, принимая также во внимание фона ячейки в каждом кадре. Это программное обеспечение предлагает различные возможности для определения интенсивности пятно и фона ячейки и, используя известные мономерные и димерной белков в качестве ссылки, вычисляет приблизительное количество белков в обнаруженных частиц (размер кластера).
В этой статье мы опишем тщательное руководство выполнение этих трех шагов: 1) обнаружения и отслеживания одной частицы вдоль видео микроскопии флуоресцирования, с помощью U-трек; 2) анализ коэффициент мгновенной диффузии (D1-4) из этих частиц и типа движения (замкнутых, бесплатно или режиссер) частиц с длиной траекторий по УВО; 3) измерения интенсивность пятно вдоль видео исправить предполагаемое фон флуоресценции для каждого пятна. Это позволяет Оценка размера кластера и определение Фотообесцвечивание шагов.
Использование этого протокола не требует специальных навыков и может быть выполнена в любой лаборатории с клеточной культуры, поток цитометрии и микроскопии. Протокол использует ImageJ или Фиджи (распределение ImageJ12), U-track3и некоторые ad hoc сделал процедуры (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-трек и специальных процедур пробегают Matlab, который может быть установлен в любой совместимый компьютер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка биологических образцов
- Расти Jurkat клеток в среде RPMI 1640 с 10% FCS, NaPyr и L-глютамин (полная RPMI). Electroporate Jurkat клетки (20 x 106 клеток/400 мкл RPMI 1640 с 10% FCS) с вектором мономерных GFP-помечены хемокиновых рецепторов (CXCR4-AcGFP, 20 мкг) чтобы разрешить ее обнаружения, с помощью микроскопии флуоресцирования.
Примечание: Это позволяет использовать другие мономерных флуоресцентных белков, таких как mCherry, mScarlet и др. - 24 ч после трансфекции анализа клеток в проточный цитометр определить жизнеспособность клеток и CXCR4-AcGFP выражение.
- Выделите ячейки, выражая низкий уровень CXCR4-AcGFP путем сортировки клеток GFPнизких положительных клеток (рис. 1), как низкая выражение transfected рецептора требуется в TIRFM эксперименты для того, чтобы обеспечить отслеживание одной частицы для отслеживания отдельных траекторий9.
- Подсчитать количество рецепторов на поверхности клетки.
Примечание: Как пример13, AcGFP меченых рецепторов ~ 8500-22000/клетки, соответствуют ~ 2-4.5 частиц/мкм2. -
Ресуспензируйте сортируются клеток в полной RPMI и проинкубируйте по крайней мере 2 ч при 37 ° C, 5% CO2. Центрифуга клетки (300 x g, 5 минут) и высокомобильна их в буфере TIRF (HBSS, 25 мм HEPES, 2% FCS, рН 7.3).
- Плита на 35 мм прозрачным дном микрорезервуар блюда (2-3 x 105 клеток/блюдо) покрытая фибронектина (20 мкг/мл, 1 ч., 37 ° C) в присутствии или отсутствии надлежащих лиганда (то есть, CXCL12, 100 Нм, 1 ч., 37 ° C). Инкубируйте клетки (20 мин при 37 ° C, 5% CO2) до приобретения изображений.
- Эксперименты с помощью микроскопа TIRF, оснащены EM-ПЗС, 100 x нефти погружение цель (HCX PL АПО 100 x / 1,46 NA) и 488 нм Лазер диода. Микроскоп позволяет контроля температуры и инкубации с CO2. Найдите и фокус ячейки с грубой и тонкой фокус ручки, используя яркие поля для сведения к минимуму эффекты Фотообесцвечивание. Для регулировки тонкой фокус в режиме TIRF используйте низкий лазерной интенсивности, недостаточно для обнаружения сингл частиц или побудить Фотообесцвечивание эффекты (мощность лазера 5%, 28 мкВт).
- Приобрести фильмы (последовательности изображений) приблизительно 50 s, минимизации временной интервал между кадрами. Проникновение затухающих поля должна быть 70-90 Нм глубины. Сохраните приобретенные фильмы для каждого экспериментальные условия как «.lif» (video.lif).
Примечание: Фильмы в описываемом примере были приобретены на 49% при мощности лазера (2 МВт) с временем экспозиции 90 мс и интервал времени 98 МС, 49 s (500 кадров). Проникновение выбранного затухающих волн был 90 Нм.
2. Выбор изображений и создания масок
- Для каждого экспериментальные условия (video.lif) создайте новую папку (VideoName), который должен содержать разные папки для каждой серии. Каждая папка будет содержать папку «videoSeq» для изображений, видео и папку «результаты» для результатов анализа. Убедитесь, что структура файла на данный момент является следующее:
VideoName/video.lif
VideoName/Ряд1/videoSeq
VideoName/Ряд1/результаты
Примечание: От Микроскоп различных .lif файлы получаются с несколькими видео для каждого лечения состояние (т.е. FN, FN + SDF). «video.lif» соответствует input.lif видео файл со всеми TIRF фильмы поглощения (серия) в Микроскоп. «videoSeq» папка будет содержать 500 кадров фильма, который мы анализируем. «Результаты» папка будет содержать все файлы, в результате проведенного анализа. Точная номенклатуры и локализация различных папок необходимы для правильного функционирования алгоритмы. Имена полужирным шрифтом в списке выше являются фиксированными (то есть, они должны называться таким образом, потому что эти имена, разыскивается скрипты). Имена не жирным можно изменить для отражения эксперимент выполняется. - Откройте TIRFM видео (файл .lif) с Фиджи или ImageJ, перетаскивая файл на Фиджи меню и нажмите на кнопку ОК для импорта файл lif с помощью BioFormats (дополнительный рис. 1).
- Выберите серию для обработки и нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок 2A). Чтобы создать маску для анализа видео, импорт также многоканальное изображение с различных хромофоры (в примере, серии 1-многоканальное изображение и серии 2 соответствующего видео). Видео (и многоканальное изображение) следует открыть как ImageJ стека. В этом примере (дополнительный рисунок 2B) изображение находится на левой стороне и видео находится на правой.
Примечание: Если не требуется создание маски для видео, перейдите к шагу 2.5. - Создание маски. Создайте единый образ с каналами, полезных для разработки маски. В этом случае интересные каналы являются те, красный, зеленый и серый.
- Разделение каналов многоканального изображения (дополнительный рисунок 3а): выберите изображение в панели меню и нажмите Цвет | Разделение каналов. Различные каналы будут отображаться как отдельные изображения (дополнительный рисунок 3B).
- Слияние снова трех каналов в один образ (дополнительный рисунок 4A): выберите изображение в строке меню и выберите Цвет | Объединение каналов. Выберите соответствующие каналы и нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок 4B). Новый-штабелироваться образ будет создан (дополнительная цифра 4 c).
- Синхронизировать два окна, используя средство Синхронизации Windows (Дополнительные рисунок 5A): выберите анализировать в строке меню | Инструменты | Синхронизация Windows. Новое окно с возможности синхронизировать изображение будет показан (дополнительный рисунок 5B).
- С двумя окнами синхронизированы (только видео, если есть многоканальное изображение не связанных) могут быть подрезаны того же региона в обеих окнах. Нарисуйте региона интерес с инструментом прямоугольного выделения ImageJ плавающего меню. Выберите изображение в строке меню и выберите культур (дополнительный рисунок 6A). Два обрезанного изображения будут показаны индивидуально (дополнительный рисунок 6B).
- Unsynchronize оба окна (дополнительный рисунок 6B), нажав кнопку Unsynchronize все в диспетчере Синхронизации Windows .
- Если маска не был создан как шаг 2.4, нарисуйте региона интерес с инструментом прямоугольного выделения ImageJ плавающего меню.
- Сохранить видео как последовательность изображений в каталоге videoSeq в каталоге соответствующего видео (дополнительная цифра 7A): выберите файл в строке меню и нажмите Сохранить как | Изображения последовательности... переименовать этикетки для видео последовательности как video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (дополнительный рисунок 7B): в диалоговом окне имя переименовать как видео и нажмите кнопку ОК. Последовательность должна быть в одиночестве в своей директории успешно использоваться U-трек.
Примечание: Если не проектирование маску для видео, перейдите к шагу 2.8. - Дизайн маски. Выберите многоканальное изображение и откройте редактор сегментации плагин (дополнительная цифра 8A): выберите плагины в строке меню и выберите сегментации | Сегментация редактор. Добавление и переименовать ярлыки сегментации при необходимости щелкнув правой кнопкой мыши на этикетках сегментации редактора (дополнительный рисунок 8B, C).
- Выберите инструмент выбор в ImageJ плавающего меню (здесь, использовать руки), выберите метку (зеленый) и сначала дизайн внешней маске (дополнительная цифра 9A). После того, как дизайн, нажмите + в параметр выбора составного окна и выбранный маска будет отображаться в средстве просмотра (дополнительная цифра 9A). Повторите этот шаг с следующей метки (интерьер, в красном) (дополнительный рисунок 9B).
Примечание: После разработки маска для меток зеленый и интерьер, экстерьер маска будет занимать остальную часть изображения. - Маски закодированы в изображении как регионы 0, 1, 2... Согласно приказу метки в окне метки RGB. Когда все маски для различных меток предназначены, сохранить маску с тем же именем файла как видео, с именем mask.tif (дополнительная цифра 9C): выберите файл в строке меню и выберите Сохранить как | TIFF....
Примечание: Выбранной маски будут использоваться в расчет коэффициентов диффузии и классификации траекторий (см. шаг 4.2).
- Выберите инструмент выбор в ImageJ плавающего меню (здесь, использовать руки), выберите метку (зеленый) и сначала дизайн внешней маске (дополнительная цифра 9A). После того, как дизайн, нажмите + в параметр выбора составного окна и выбранный маска будет отображаться в средстве просмотра (дополнительная цифра 9A). Повторите этот шаг с следующей метки (интерьер, в красном) (дополнительный рисунок 9B).
- Проверьте, что структуру файлов на данный момент заключается в следующем:
VideoName/video.lif
VideoName/Ряд1/mask.tif
VideoName/Ряд1/ videoSeq / video0000.tif
VideoName/Ряд1/ videoSeq / video0001.tif
...
VideoName/Ряд1/ videoSeq / video0499.tif
VideoName/Ряд1/результаты
Примечание: Mask.tif — это изображение с маской в шаги 2.4 и 2.7. Video*.tiff это видео как сохраненные в 2.6 шаг. Как указано выше, имена в жирным шрифтом в списке выше являются фиксированными, т.е., они должны называться таким образом, потому что эти имена, разыскивается скрипты. Имена не жирным можно изменить для отражения эксперимент выполняется.
3. Отслеживание частицы
- Отслеживайте все частицы, видели в выбранного видео с помощью U-трек.
- Откройте Matlab и добавить U-трек каталог в путь с помощью задать путь | Добавить с опцией подпапки в меню. Сохраните путь, так что в будущем казней, Matlab U-трек в пути. Этот параметр путь необходимо сделать только один раз.
- Измените рабочую папку на каталог, содержащий серии для анализа. Вызова U-трек, набрав в консоли (дополнительный рисунок 10) movieSelectorGUI и нажмите клавишу ВВОД. Окно выбора фильма будет открыт (дополнительная цифра 11А).
- Нажмите на кнопку Новый фильм и фильм издание окно (Дополнительные рис. 11B).
- Нажмите на Добавить канал , чтобы выбрать каталог с видео (VideoName/Ряд1/видео) и заполнить параметры информации фильма. Задайте выходной каталог для результаты U-трек результаты (videoName/Ряд1/результаты).
Примечание: Фильм информации параметров можно получить от условий приобретения и Микроскоп. - Нажмите на настройки дополнительных каналов и заполните параметры, связанные с приобретением. Посмотрите значения параметров в этом примере (дополнительный рисунок 11C).
- Нажмите кнопку сохранить в окне настройки дополнительных каналов и сэкономить на окне фильма издание . Программа запросит подтверждение записи в файл под названием movieData.mat на каталог результатов . Подтверждения.
-
После создания фильма, нажмите на продолжить в окне выбора фильма. U-трек будет просить о типе объекта для анализа. Выберите Single частиц (дополнительный рисунок 12). (Дополнительные рис. 13A) появится окно панели управления.
- Выберите первый шаг Шаг 1: определение и нажмите на параметр. (Дополнительные рис. 13B) появится окно Установки параметр Гаусса смесь-модель . В этом примере «альфа для сравнения с местными фон» значение 0,001 и «Rolling-окно времени усреднения» 3 (дополнительный рис. 13B).
- Нажмите на Применить в окне Параметры Гаусса смесь-модель установки и запуска на панели управления. С конфигурацией в дополнительном рисунок 13только шаг обнаружения запускается. Этот шаг занимает несколько минут (2-5). Проверьте результаты, нажав на кнопку результат шага 1 (обнаружение, Дополнительные рис. 14).
Примечание: Как показано выше, фильм показывает красные круги на обнаруженных частиц. Если не красный круг, то этот шаг не работал правильно.
- Выполняйте определение треков, то есть, слияния частиц, обнаруженные на предыдущем шаге на треки, которые охватывают несколько кадров. Это Шаг 2: отслеживание U-трек, параметры которого должны быть определены, как показано на Рис. Дополнительные 15A-C. Параметры функции стоимости шаг 2 для увязки кадра к кадру и разрыв закрытия, слияния и разделения в примере показаны Дополнительные деятель 15B и C, соответственно.
- После установки параметров для шага 2, нажмите кнопку Запуск на панели управления и только шаг 2 работает (дополнительный рисунок 16).
- Выполните анализ трек, шаг 3. Задайте параметры, как показано в дополнительном рисунок 17 (правая панель). Нажмите кнопку Применить на панели настройки-движение анализа, и запустить в элемент управления панели-U-Track. Этот шаг занимает несколько секунд.
- С кнопкой результат шага 3 Убедитесь, что процесс правильно определил все треки. Для этого, нажмите на Показать трек номер окна Параметры фильма и проверьте, кадр за кадром, что каждый трек был правильно определил (дополнительный рисунок 18). Вручную добавлять аннотации те частицы, которые не являются действительно частиц.
Примечание: Если этот ручной выбор не делается, слабее автоматический выбор может выполняться позднее при расчете коэффициента диффузии (см. шаг 4).
4. Расчет коэффициентов диффузии и классификации траекторий
- Будьте уверены, что все сценарии вызываются из каталога видео, анализируются (в примере, VideoName/Serie1).
- Читать все траектории для вычисления коэффициентов диффузии путем выпуска в Matlab консоли команду: trajectories=readTrajectories(0.1), где 0,1 представляет время в секундах между двумя последовательными кадрами (интервал времени, отображаемые в панели кино Информация, Дополнительные рис. 11B).
- Исключить траекторий, соответствующий неправильно определили пятна/траекторий. Дать список мест для исключения. Например, чтобы исключить пятна, 4, 5 и 28, введите: траекторий = readTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
- Вычислите мгновенного распространения Коэффициенты для каждого из треков этой ячейки. В этом случае, рассчитать коэффициент диффузии для временной лаг = 4, называется D1-4. Для этого выполните в консоли Matlab команду: D = calculateDiffusion (траектории, 113.88e-3, 0.0015, 'Альфа') где траекториях являются траекторий, полученные на шаге 3, 113.88e-3 является размер пикселя изображения полученные со сканера в мкм, 0.0015 Верхняя граница для коэффициентов диффузии неподвижной частиц, измеряется в мкм2/s и «альфа» является встроенная модель, как объяснено ниже.
Примечание: При использовании быстрее камеры и необходимости больше кадров для вычисления параметра диффузии увеличить его, например до 20, по D = calculateDiffusion (траектории, 113.88e-3, 0.0015, 'Альфа', '', 20). Параметр string до 20, в примере выше, '', это суффикс добавляется выходных файлов. Этот суффикс может использоваться для различения различных анализов. - Соответствовать MSD с другой функцией путем вызова функции calculateDiffusion снова с другой установки режим («лишь», «свободный» или «режиссер»). В этом примере, «лишь»: D = calculateDiffusion (траектории, 113.88e-3, 0.0015, 'лишь').
- Получите результаты установки для направленного модели, как показано на рисунке 20 дополнительных.
- Разложить траекторий на краткосрочной и долгосрочной траектории. Используйте команду: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) где 50-минимальная длина в кадрах траектории может считаться долго (в примере).
- Изучение короткие траектории, используя ту же процедуру установки, описанной в шаге 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'режиссер', 'Короткий'). Анализ коротких и аномальных траектории с помощью команды: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'Альфа', «Короткая»).
- Анализ долгосрочной траектории классифицировать тип движения через их момент расширения спектра (MSS)7. Команда: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'длинный') показывает анализ в экране и генерирует файл с названием trajectoryClassification < суффикс > .txt каталог results\TrackingPackage\tracks.
5. Расчет Ssize кластера через плотность частиц
Примечание: Будьте уверены, что все сценарии вызываются из каталога видео, анализируются (в примере, VideoName/Serie1).
-
Анализ интенсивности каждой частицы вдоль их траектории. Для этого, вызовите сценарий, набрав в консоли Matlab: analyzeSpotIntensities, который принимает в качестве входных траекторий, вычисляемая U-трек в первом разделе. В своей самой основной форме, просто вызовите сценарий без каких-либо аргументов из каталога видео, анализируются (в примере, VideoName/Ряд1) analyzeSpotIntensities(). Настроить это базовое поведение различными способами, предоставляя аргументы в сценарий как: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Значение1, ' Arg2´, значение2,...). Допустимые аргументы с соответствующими значениями переменной ('ArgN´, ValueN) перечислены.
- ('spotRadius´, 1)
Анализ интенсивности флуоресценции, используя spotRadius 1 пиксель (по умолчанию), что соответствует участок размером 3 x 3 центрируется в точке ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
Примечание: Для патч 5 x 5, сосредоточены на месте, выберите spotRadius 2, и т.д. - ('onlyInitialTrajectories´, 1)
Если этот аргумент (true, значение 1), анализировать только траектории, которые начинаются в первый кадр видео. Это полезно для анализа изображений управления (по умолчанию 0, false). - ('trackTrajectory´, 0)
Если этот аргумент имеет значение 0 (false), а затем сохраните координаты места в его первый кадр для всех фреймов (это полезно для неподвижных точек). Если аргумент имеет значение 1 (по умолчанию 1, значение true), то пятно вдоль видео следующие координаты рассчитаны отслеживается U-трек. - ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
Включать траектории количество этих траекторий, исключены в шаге 4.3 (в примере 4, 5, 28). - ('extendTrajectory ´, 1)
Если этот аргумент имеет значение 1 (true), затем проанализируйте интенсивность в патч до конца видео (даже если траектория останавливается ранее). Координата точки является Последнее координат в траектории (если trackTrajectory имеет значение true) или первая координата в траектории (если trackTrajectory имеет значение false). Этот аргумент имеет значение false (0) по умолчанию. - ('subtractBackground´, 1)
Если этот параметр установлен, затем правильным сырье флуоресценции измеряется в каждом месте оценку флуоресценции фон для этого месте (см. ниже). Этот аргумент имеет значение true (1), по умолчанию. - ('meanLength´, номер кадра)
Если этот параметр установлен, средней интенсивности месте измеряется в длину указали. Набор «meanLength», 20 измерить интенсивность средняя спот на первых 20 кадров. Если аргумент не задан, то пятно света рассчитывается на всей траектории (по умолчанию, полная длина). - ('showIntensityProfiles´, 1)
Установите этот параметр как 1 (по умолчанию 0, false), для построения профиля интенсивности вдоль различных кадров, а также их происхождения.
Примечание: Эти участки являются очень полезными для выявления Фотообесцвечивание, как показано в дополнительном рисунок 21. Для каждого пути процедура автоматически анализирует, если это возможно, что был Фотообесцвечивание. Это делается путем сравнения значений интенсивности с t студента в первый и последний кадры N вдоль пути. По умолчанию, N 10, но это значение может быть изменено через аргумент ' Nbleach´. - ('backgroundMethod´, значение)
Установите этот параметр для определения фона в каждом месте. Это можно сделать несколькими способами, и какой из них использовать может быть выбранные изменения «значение»:- ('backgroundMethod´, 0)
Это значение используется, чтобы вручную определить фон для всего видео. Позволяют выбрать 8 очков в первый кадр видео. Патч вокруг этих точек анализируется вдоль всего видео, и 95% квантиль всех этих интенсивностей выбирается в качестве фона интенсивности для всех мест. - ('backgroundMethod´, 1)
Это значение используется, чтобы вручную определить фон для каждого кадра. Выберите 8 очков за каждое пятно и каждый кадр. Эта задача требует много времени, но он дает много управления для пользователя. 95% квантиль интенсивностей в эти патчи выбирается в качестве интенсивности фон для этого месте в данном фрейме. - ('backgroundMethod´, 2)
Используйте это значение для вычисления на фоне каждое пятно оценкам из 8 пунктов, расположенных в круг вокруг месте с радиусом контролируемых аргумент ' backgroundRadius´ (по умолчанию 4 * spotRadius). - ('backgroundMethod´, 3)
Используйте это значение для вычисления фона для каждого кадра, сначала найдите ячейку в видео и затем анализа интенсивности ячейки в каждом кадре (дополнительный рисунок 22).
Примечание: Фон выбирается в качестве значение серого в данной квантиль распределения (по умолчанию 0.5 (= 50%), хотя этот параметр может управляться через аргумент ' backgroundPercentile´, это значение может быть задано выше, например, 0,9 (= 90%) Если желающих большую часть клетки следует рассматривать как фон. Чтобы помочь в идентификации ячейки, указывают значение Максимальная фон ожидается вдоль рамы, используя аргумент ' maxBackground´ (например, во всех проанализированных видео, значение background обычно никогда не выходит за рамки 6000)13. По умолчанию этот параметр имеет значение 0, что означает, что эта помощь не используется по умолчанию. Увидеть, что обнаружение клеток и района, выбранного для оценки фон, задав аргумент ' showImages´ 1 (остановка выполнения в любое время, нажав CTRL-C).
- ('backgroundMethod´, 0)
- ('spotRadius´, 1)
- Соберите информацию распространения и интенсивности для всех траекторий, рассчитывается в шагах 4 и 5.1, соответственно, (gatherDiffusion.AndIntensity). Соберите только распространения и интенсивности информацию для короткой траектории. Для этого, использовать суффиксов в шаге 4.7 и введите: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) где ' Short´ является суффикс, используемый в шаге 4.7.
- Собрать момент расширения спектра и интенсивности ввода informationby: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') , где «Долго» суффикс используется в шаге 4.7. Резюме всех файлов, созданных с использованием этого протокола, показано на рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование этого протокола позволяет автоматизированного отслеживания частиц, обнаруженной в микроскопии флуоресцирования фильмы и анализ их динамических характеристик. Первоначально клетки являются transfected с белком дневно в сочетании отслеживаться. Соответствующий уровень рецепторов представляет на поверхности клетки, что позволяет SPT получается путем ячейку Сортировка (рис. 1). Выбранные ячейки анализируются TIRF микроскопии, который генерирует видео в формате, который могут быть изучены с помощью инструментов, описанных в настоящем Протоколе (дополнительное видео 1).
Генерируется видео не могут быть проанализированы непосредственно, и требуются независимые рамки каждого видео. Использование ImageJ создает файлы, которые могут быть интерпретированы с помощью Matlab программного обеспечения таких как видео кадры в формате .tiff или масках. U-трек отслеживает частицы, видели в выбранное видео и сохраняет информацию в файлах Matlab (.mat) (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), см. Рисунок 2.
Как показано на рисунке 2, расчет коэффициентов диффузии и классификации траекторий команд, генерирует различные файлы (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, и т.д.). Информация, содержащаяся в этих файлах лучше всего осуществляется с помощью Excel и Призма программного обеспечения. Информация, которая может быть получена из этого анализа включает в себя:
- Процент от неподвижных точек. Вы можете использовать как Справочник неподвижной частиц: 95% процентиль D1-4 полученные значения (1) от одной частицы в стационарных клетках и/или (2) из очищенного флуоресцентный белок придает coverslips (рис. 3A).
- Процент длинные траекторий (> 50 кадров) (рис. 3B).
- Тип движения длинные траекторий: режиссер, бесплатно, замкнутые (рис. 3 c).
- Коэффициент диффузии (D1-4) мобильных частиц в ячейках лечить с помощью различных стимулов (рис. 4A).
Шаг 5 протокола анализирует интенсивность каждой частицы вдоль траектории. Сценарий analyzeSpotIntensities будет печатать на экране всю информацию проанализированы. Для каждого пятна и рамы, сценарий показывает координаты места в этом кадре (x, y) в пиксельных единицах, оценка фон флюоресценция (k0), сырые пятна интенсивность в 3 x 3 патч, исправленные интенсивности (рассчитывается как сырье интенсивности минус его фон), максимальное значение интенсивности наблюдается в патч и номер региона в маске, где это место находится на этот кадр. Пример такого рода результаты
место = 43 кадр = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2
Вся эта информация хранится в файле журнала (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) и таблица, которая может быть прочитана из Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). После анализа каждое пятно, сценарий выводит средней интенсивности вдоль траектории и мажоритарный региона в пределах маски
место = 43
meanCorrectedSpotIntensity вдоль рамы = 4762.303
мажоритарные региона = 3
Эта информация хранится в файле журнала выше и таблицу, которая может быть прочитана из электронной таблицы (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Например среднее пятно света (msi) для каждой частицы вдоль траектории в клетках стимулируется с разными условиями показан на рисунке 4В. Теперь мы можем использовать эту информацию для приблизительно оценить размер флуоресцентные кластера. Как пятно означает исправленный интенсивности связано с количество флуоресцентных белков, присутствующих в этом месте, и флуоресценции мономера может быть измерена через аналогичные, но независимые эксперимент, непосредственно рассчитать количество рецепторов на частицы. Частотное распределение числа рецепторов на частицы с помощью ссылок интенсивность мономерных белка, выраженная в тех же ячейках показано в рисунке 4 c.
Собрать распространения и интенсивности команда создать два файла: один называется diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtи другой называется log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt в каталоге результаты / TrackingPackage/треков. Оба файла содержат 1) пятно индекс, 2) коэффициент диффузии, 3) интенсивность и номер 4 региона в пределах маски. Эти файлы можно читать из электронной таблицы.
Аналогично, собираются траектории классификации и интенсивности команда создаст два файла один называется trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt и другой log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt в каталог результаты/TrackingPackage/треков. Первая содержит 1) пятно индекс, тип 2 движения, 3 пятно первый момент, 4) интенсивность, 5) D1-4 и 6 номер региона в пределах маски. Этот файл может быть прочитан из Excel.
Резюме всех файлов, созданных с использованием этого протокола, показано на рисунке 2. Другие анализа, которые могут быть выполнены с использованием этого протокола включает в себя сравнение динамических параметров малых против больших пятен, т.е. против олигомеров мономеров, вариации на эти динамических параметров, вызванных лигандов, ингибиторы, состав мембраны, изменения сигнальные пути, и т.д. Полный анализ CXCR4 поведения в ответ на его лиганда CXCL12 различных экспериментальных условиях была выполнена с использованием этого протокола13.
Рисунок 1 : Сортировки клеток. Выражение гена GFP в Jurkat клетках transfected с CXCR4-AcGFP до и после сортировки клеток. Ячейка, выражая низкий уровень GFP (GFPнизкий) отбираются и используемых для TIRF экспериментов.
Рисунок 2 : Резюме созданные файлы. На рисунке показаны все файлы, созданные с помощью Matlab процедуры описано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Классификация траекторий. Количество различных типов траекторий в соответствующих клетках, обработанных с различных раздражителей. (A) доля неподвижной пятна, (Б) процент длинные траекторий и (C) тип движения длинные траекторий.
Рисунок 4 : Коэффициент диффузии, среднее пятно света и количество рецепторов на частицу. (A) распространение короткого диффузионного значения коэффициентов (D1-4) для каждого пятна в ответ на различные стимулы, (I, II, II и IV). Красная линия представляет собой среднее значение D1-4. Значения среднее пятно света (msi), (B) для каждого пятна вдоль его первые 20 кадров в ответ на различные стимулы, (I, II, II и IV). Красная линия представляет значение средней интенсивности (SD). (C) процент рецепторов/частиц как извлеченные из распределения интенсивности отдельных частиц, принимая как Бен ширина значение интенсивности мономерных белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: Открытие файла TIRFM в Фиджи или ImageJ. Варианты, которые появляются в окне био форматы после перетаскивания .lif видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 2: Выберите серии. Изображения представлены в .lif видео. (A) окно, которое позволяет выбор серии для анализа, включая многоканальные изображения. (B) результат примера серии отбора, включая многоканальное изображение (слева) и соответствующие видео (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительная цифра 3: Разделение каналов. (A) окно захвата ImageJ команды необходимые для разделения каналов многоканального изображения и (B) результат примера канала раскол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 4: Объединить каналы. (A) слияние различных каналов в единый образ. (B) выбор для слияния канала. (C) пример результат слияния канала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительная цифра 5: Синхронизируйте windows. (A) локализации в ImageJ меню команд, необходимых для синхронизации изображения и (B) в появившемся окне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 6: Выберите регион, интерес. (A) Выбор окна интерес, используя инструмент прямоугольного выделения и (B) результат урожая изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительная цифра 7: Сохраните видео. Сохраните область интереса как последовательность изображений и параметры для сохранения как окно последовательности изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительная цифра 8: Сегментации. (A) открытое сегментации редактор плагина в меню плагинов ImageJ. (B) добавить метки/материалы для сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 9: Маска-дизайн. (A) выбор соответствующие ярлыки и определения зеленой маски. (B) выбор красная маска. Пример двух масок, соответствующий две метки. (C) сохранить маски в формате .tiff. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 10: MATLAB рабочий каталог. Выбор правильный каталог, содержащий серии для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 11: U-трек главное меню. (A) фильм выбор, издание фильма (B) и (C) канала настройки меню. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 12: Выберите тип объекта для отслеживания. Выберите Отслеживание одного частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 13: Обнаружение частиц. (A) U-трек, панель управления. (B) пример настройки для обнаружения частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 14: Пример результатов для обнаружения частиц. Различные окна, которые включают просмотра меню, меню Параметры фильма и кино. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 15: Отслеживание меню. Пример настроек. Отслеживание (A), (B) параметр - Связывание кадра к кадру и (C) разрыв закрытия, слияния и разделения меню. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 16: Пример результатов для отслеживания частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 17: Трек анализ меню. Пример настроек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 18: Проверка пути анализа. На экране выводится после анализа дорожки, включая видео окно обнаружено частиц и их соответствующих треков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 19: Расчет коэффициентов диффузии. Гистограммы коэффициентов диффузии рассчитывается (слева) и среднего квадрата смещения (MSD, право). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 20: Расчет коэффициентов диффузии, включая установку различных режимов. Гистограммы коэффициентов диффузии рассчитывается (слева) и среднего квадрата перемещения (MSD, право) для замкнутых модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительная цифра 21: Интенсивность профили. Пример пятно света вдоль траектории (синяя линия) и фон (красная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Дополнительные рисунок 22: Фон для каждого кадра. Слева: Образец клеток изображение. Средний: Автоматически ячейку. Справа: Области автоматически выбирается в качестве фона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.
Справочная видео 1: Пример типичного TIRF видео микроскопии, показаны присутствие частиц с различной интенсивности и виды движений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.
Дополнительный материал 1: Файлы, содержащие все сценарии протокол, работающих в специальных процедур, используемых для классификации траекторий и анализа размера кластера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать материалы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описан метод легко выполнять даже без каких-либо предыдущий опыт работы с Matlab. Однако Matlab процедуры требуют чрезвычайно точность с номенклатуры различных команд и локализация различных папок, используемых программой. В деле отслеживания процедура анализа (шаг 3), несколько параметров могут быть изменены. Окно «Настройка Гаусса-смесь модель арматура» (шаг 3,8) контролирует, как U-трек будет обнаруживать одной частицы на видео. Это делается путем установки Гаусса смесь модель, как описано в разделе3. Одним из ключевых параметров для этой установки определяет фильтр для выявления местных максимумов. Успех этой операции зависит от шума, присутствует в образы и контрастность изображения. Первый параметр (альфа значение для сравнения с местными фоном) управляет доверия Максима, будучи реальным пятно, а второй помогает уменьшить шум при идентификации пятна. Важные параметры «Отслеживание» шаге (3.9) являются количество кадров для заполнения пробелов (то есть трек может охватывать кадры, в которых частица фактически не видел, но он видел перед эти кадры и после этих кадров; в этом примере, 0) и количество кадров, которые должны охватывают трек для того, чтобы рассматриваться как успешный трек (в нашем примере, 20; этот параметр связан с приобретением скорость камеры и число кадров в трек должен быть таким образом, что она позволяет вычисление диффузии co эффективное). Важно также решить, следует ли объединить и разделить сегменты (в примере, который эти две возможности были выбраны). Затем необходимо задать параметры для шага 1 в функции затрат (компоновки кадра к кадру). Эта функция управляет, как частицы отслеживаются вдоль рамы. Наиболее важные параметры на данный момент является выбор Радиус броуновская поиска, которые контролируют, как далеко, как ожидается, каждое пятно в следующий кадр. В нашем примере мы выбрали 0 и 5 в нижней и верхней границами, соответственно. Обратите внимание, что эти параметры очень специфичны для природы частиц отслеживается, и что они могут настраиваться в каждом конкретном случае. Особенно важными являются масштабирования власть в броуновского и линейный поиск радиусов. Эти расширения полномочий зависит от вида движения частиц (бесплатные или замкнутых диффузии). В этом примере значения (0,5, 0.01) были выбраны для свободного диффузии. Конкретной документации этих параметров см.
В расчете команду коэффициенты диффузии (шаг 4.4) Верхняя граница коэффициента диффузии неподвижной частиц может быть известно из предыдущих экспериментов или запустив функцию calculateDiffusion на отдельный проект с неподвижным частицы (очищенная мономерных флуоресцентный белок) и видя коэффициенты диффузии сообщили. Эта функция принимает два дополнительных параметра: ' outputSuffix´, который добавляется к имена выходных файлов и по умолчанию принимает значение empty, и ' plotLength´, который по умолчанию 13 и является количество времени (в секундах), в которой выполняется вычисление диффузии. Режим установки «альфа» предполагает корректировку Урс к кривой
то есть смещение (0MSD) и функцией времени запаздывания. Экспоненты эта функция power, 
, определяет ли движение ограничено (0 < α < 0,6), аномальных (0,6 < α < 0,9), свободный (0,9 < α < 1.1), или направлены (α > 1.1). Для рассмотрения такого рода анализа читатель отсылался к Мандзо et al.9
Расчет коэффициентов диффузии4 производит две фигуры вывода (см. дополнительный рисунок 19). Первый показывает гистограмму диффузии коэффициенты вычисляемый (Обратите внимание, что на данный момент, есть независимый диффузии коэффициент для каждой траектории). Среднее значение и 95% процентиль этих коэффициентов отображаются в консоли Matlab. Второй график показывает MSD (красная кривая) и количество шагов, считается вычислить его как функцию времени запаздывания для этих траекторий, считается мобильных (те, чьи коэффициент диффузии превышает порог, в командной строке). Вычисляется среднее и стандартное отклонение мобильных траекторий (эти значения для траекторий в одну ячейку). В этом примере экспоненты — 0,59 означает, что движение ограничено. Для этой кривой, программа сообщает неопределенности для каждого из параметров (показано как стандартное отклонение каждого из них) и добра подходят (идеально подходят достигнет нуля). На данный момент и после проверки значения альфа мы может принять решение в соответствии с МСД с другой функцией:
Если 0 < α < 0,6 (замкнутые)
Если 0.9 < α < 1.1 (бесплатно)
Если α > 1.1 (режиссер)
Аномальные траекторий не могут быть установлены с другой функцией. В случае замкнутых частиц может вычислить размер родов (в микронах) как в Destainville et al.14
Хорошим показателем правильную установку является, что добра fit должна уменьшаться от Альфа, подходящая для окончательной установки (в этом примере добра подходят падает от 0.30474 до 0.15749, дополнительный рисунок 19-20). calculateDiffusioncreates двух файлов в «results\TrackingPackage\tracks» внутри директории серии под названием «diffusionCoefficients.txt» и «diffusionCoefficientsMobile.txt». Эти файлы содержат три колонки: 1) индекс каждого ввода траектории, 2) их соответствующий коэффициент диффузии, 3) мажоритарные региона в маске, которой принадлежит этот трек (регионы получаются из файла «mask.tif», созданный в шагах 2.7; Если этот файл не существует, то этот столбец отсутствует). Вы можете использовать этот файл и аналогичные файлы, созданные для других ячеек для анализа распределения коэффициента диффузии для набора клеток подобных экспериментальных условиях.
В расчет коэффициента диффузии для короткой траектории (шаги 4.7-4,8) последний параметр «Короткие» является суффикс добавляется имя выходного файла, так что вы может анализировать различные подмножества траекторий без перезаписи diffusionCoefficients.txt файлов. Фактическое имя выходных файлов является «diffusionCoefficients < суффикс > .txt» и «diffusionCoefficientsMobile < суффикс > .txt». Пустой суффикс предполагается, если не суффикс, как показано выше, общего анализа. Параметры модели (0D, v и MSD) могут отличаться от тех, которые установлены для всех траекторий. Наиболее удивительно стандартное отклонение параметров, а также добра fit обычно увеличивают. Причина что короткие траектории более неустойчивы и надежную установку является более сложным.
Анализ траекторий длинные (шаг 4.9) классифицировать их в ограниченном (1), бесплатно (2), или режиссер (3) согласно их первый момент и его расположение в отношении 2,5% и % 97,5 процентилей первого момента 500 случайных путей с броуновского движения, то же самое коэффициент диффузии и длину траектории, проанализированы и имитации Монте-Карло. Если первый момент путь анализируемого ниже 2,5% от первых моментов, наблюдаемые в симуляции, изучаются пути классифицируется как ограничены. Если она превышает 97,5% имитируемых первых моментов, он классифицируется как направлено; в противном случае путь классифицируется как броуновского. В команде работают, 113.88e-3 является размер пикселя в мкм, 0.0015 верхняя граница коэффициента диффузии неподвижных точек, измеряется в мкм2/s и «Длинная» — суффикс для имени выходного файла. Первый столбец файла («trajectoryClassificationLong.txt») является номером траектории, второй — его классификации (1 = ограничивается, 2 = бесплатно, 3 = направлены), и третий — траектории первый момент.
Сценарий для расчета интенсивности каждой частицы (шаг 5.1) является очень гибким и позволяет отслеживать интенсивностью флюоресценции различными способами (каждый из них хорошо подходит для различных ситуаций, как отслеживание неподвижные места управления эксперимента или Отслеживание высоко подвижные пятна на ячейку с переменной флюоресцентный фон). Сценарий будет анализировать все траектории вдоль всех фреймов. Для каждого места на каждом кадре она будет измерить интенсивности пикселей вокруг месте (он анализирует квадратный патч вокруг месте, по умолчанию размером 3 x 3 пикселей), оценить место фона и вычислить флуоресценции разницу между местом и фона. Процент Фотообесцвечивание частиц и количество флуоресцентные частицы в одном кластере, как в одном месте, может быть оценена таким образом.
Этот автоматизированный метод (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) производит информацию о нескольких параметров (пятно света, боковые диффузии, тип движения), которые могут помочь изучить связь между размер пятна и его динамики в базальных условиях, и как различные виды лечения могут изменять эти параметры.
Основным ограничением метода является, что она требует transfection клетки с флуоресцентный белок отслеживаться. Обычно трансфекции приводит к гиперэкспрессия белка, тот факт, что затрудняет отслеживание одного белка. Ячейку Сортировка шага должны быть включены для выбора ячейки, выражая количество рецепторов, которые позволяют обнаружение и отслеживание одного частиц SPT-TIRF микроскопии. Этот метод также может использоваться для отслеживания биомолекул, помечены квантовых точек или Fab фрагментов. Описывается протокол требует ряд элементов управления, которые ранее должны быть проанализированы для того, чтобы обеспечить правильные выводы из анализа. Во-первых важно определить соответствующее выражение условия, которые позволяют обнаружения и отслеживания одной частицы. Фильмы с плотностью ~ 4,5 частиц/мкм2, соответствует 8500-22,000 рецепторов/клетки, были использованы для анализа пространственно временной организации рецептор клеточной мембраны13.
Важно установить коэффициент минимальной обнаружению диффузии с помощью очищенного мономерных AcGFP белки или фиксированные клетки. В обоих случаях предполагается, что существует не диффузии, и поэтому мы оцениваем, что значения диффузия частиц, анализируются в этих условиях соответствуют подвижности частиц и использоваться для проведения различий между мобильной и неподвижным траекторий13.
Анализ, который мы представили здесь — это средство анализа общего траектории, который может быть применен к анализу диффузии рецепторов, сверхразрешение, анализа дифракции ограниченный изображений и анализ клеточного движения стандартных микроскопия . Основным преимуществом данного метода с другими ранее описанных, такие как анализ числа и яркость11, является, что она позволяет оценить значения средней интенсивности каждого индивидуального пятно вдоль траектории, принимая во внимание время выживание мономерных белка AcGFP перед Фотообесцвечивание. Выживание время молекулы до Фотообесцвечивание будет сильно зависеть от условий возбуждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны Карло Manzo и Мария Гарсия Parajo за их помощь и исходный код анализа коэффициент диффузии. Эта работа частично поддержали грантов от испанского министерства науки, инноваций и университетов (SAF 2017-82940-R) и программа RETICS Instituto de salud Карлоса III (RD12/0009/009 и RD16/0012/0006; МОЛО). COMFUTURO программы Фонд Генеральной CSIC поддерживаются LMM и СП.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
