Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Bir video serisi ve onların yörüngeleri posterior analizi üzerinde izleme parçacık günümüzde birçok biyolojik çalışmalarda ortak bir işlemdir. Hücre membran reseptör analizini kullanarak kümeleri bir model olarak, biz bu görüntü analiz görevi, Fiji (ImageJ) ve Matlab rutinleri için kullanarak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut: 1) bölgeleri ilgi tanımlamak ve tasarım bu bölgelere; adapte maskeleri 2) parçacıklar Floresans mikroskobu videoları izlemek; 3) seçili parça Difüzyon ve yoğunluk özellikleri analiz. Kantitatif analiz Difüzyon katsayıları, hareket ve küme boyutu Floresans mikroskobu tarafından elde edilen ve görüntü işleme objektif parçacık dinamiği ve bunun sonuçları belirlemek için değerli bir araç sağlar çevre koşulları. Bu makalede biz bu özellikler analizi için detaylı protokolleri mevcut. Açıklanan yöntemi burada sadece tek molekül izleme algılama, ama aynı zamanda hücre zarı, yanal Difüzyon parametrelerinin tahmini otomatikleştirir, yörünge türünü sınıflandırır ve tam analiz böylece üstesinden sağlar Tüm yörüngesini, hücre zarının üzerinde nokta boyutu miktarının zorluklar.

Introduction

Termal Difüzyon nedeniyle sürekli hareket membran proteinlerinin lipid bilayer gömülü bulunmaktadır. Cins etkileşimleri reaksiyonlar monomerleri boyutu değişir ve kompleksleri sinyal istikrar etkisi kompleksleri oluşumu izin olarak kendi dinamikleri hücre yanıtları, düzenlenmesi için gereklidir. Protein dynamics kontrol mekanizmaları elucidating böylece yeni bir meydan okuma olarak hücre biyolojisi, sinyal iletim yolları anlamaya ve önceden tahmin edilemeyen hücre işlevleri tanımlamak için gerekli olduğunu.

Optik bazı yöntemler geliştirdik bu etkileşimler yaşayan çalışmaya1hücreleri. Bunlar arasında toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, 1980'lerin başında geliştirilen moleküler etkileşim veya hücre zarı2çok yakınındaki bir çalışma sağlar. Membran protein yörüngeleri yaşayan hücrelerde TIRF veri elde edilen dinamik parametreleri çalışma için tek bir parçacık izleme yöntemini (SPT) gereklidir. Çeşitli algoritmalar bunun için mevcut olmasına rağmen şu anda bu parçacık hareket heterojenite yoğun parçacık alanındaki parçacıklar elde edilen parça bağlanmak için ardışık çerçeveler arasında bağlantı kurarak ele Jaqaman ve ark.3 Yayınevi kullanın kesimleri içine tam yörüngeler (geçici parçacık ortadan kalkması). Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı birleştirme ve bölme sonucunda toplama ve ayrışma olayları3parçacık yakalar. Bu yazılımın çıkış veri algılama tüm yörünge boyunca parçacıkların X ve Y konumlarını her çerçevede tanımlayarak biridir.

Bir kez parçacıkları tespit edilir, kısa timelag Difüzyon katsayısı (D1-4)4,5belirlemek için farklı algoritmaları uygulamak. An ölçekleme spektrum (MSS)6,7,8 analizi uygulayabilir veya 'Alfa' değeri ayarlama, ortalama kare deplasman (MSD) eğrisi9tarafından uygun, ayrıca parçacıklar göre sınıflandırmak yörünge türü.

Floresans görüntülerde nokta yoğunluğunu analiz bilim adamları alan10,11' deki yönergeleri için paylaşılan bir hedefidir. Parlaklık ve sözde numarası kullanılan en yaygın algoritmasıdır. Bu yöntem yine de doğru kare kare yoğunluğu algılama mobil kesir parçacıklar içinde izin vermez. Böylece, yeni bir algoritma bu parçacık yoğunluklarda çerçevelemek-yanında-çerçevelemek değerlendirmek için ve onların toplama durumu belirlemek için oluşturmuş. Bir kez her parçacık koordinatlarını U-Track2 yazılım3kullanarak tespit edilir, biz şiddeti her çerçevede tam yörünge üzerinde Ayrıca her çerçeve içinde hücre arka planı dikkate alarak tanımlar. Bu yazılım nokta yoğunluğu ve hücre arka planı belirlemek için farklı seçenek sunuyor ve referans olarak bilinen monomeric ve dimerik proteinleri kullanarak tespit parçacık (küme boyutu) proteinler yaklaşık sayısını hesaplar.

Bu makalede, aşağıdaki üç adımı gerçekleştirmek için dikkatli bir rehber tarif: 1) tespit ve floresan mikroskopi U-parça; kullanarak bir video boyunca tek parçacıklar izleme 2) bu parçacıklar ve MSS tarafından uzun yörüngeleri ile parçacıkların hareketi (sınırlı, ücretsiz veya yönlendirilmiş) tip anlık Difüzyon katsayısı (D1-4) analiz; 3) Çeviri: her yer için tahmini arka plan Floresans video boyunca nokta yoğunluğu ölçme. Bu küme boyutu tahmin ve kimlik photobleaching adımları sağlar.

Bu Protokolü'nün kullanılmasına özel beceri gerektirmez ve hücre kültürü ile herhangi bir laboratuarda gerçekleştirilen, Akış Sitometresi ve mikroskopi İmkanları. ImageJ veya Fiji (ImageJ12dağıtım), U-track3ve bazı reklam hoc yapılan rutinleri (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) iletişim kuralını kullanır. U-track ve geçici yordamları uyumlu herhangi bir bilgisayarda yüklü Matlab üzerinden çalışacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. biyolojik örnekler hazırlanması

  1. Jurkat hücrelerin % 10 FCS ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamda büyümesine NaPyr ve L-glutamin (tam RPMI). Bir monomeric GFP etiketli Kemokin reseptör vektör (CXCR4-onun algılama Floresans mikroskobu kullanarak izin vermek için AcGFP, 20 μg) Electroporate Jurkat hücrelerle (20 x 106 hücreler/400 µL % 10 FCS ile RPMI 1640,).
    Not: MCherry, mScarlet, vb gibi diğer monomeric floresan proteinler kullanmak mümkündür.
  2. transfection sonra 24 h hücre canlılığı ve CXCR4-AcGFP ifade belirlemek için bir Akış Sitometresi hücrelerde analiz.
  3. Transfected reseptör düşük ifade TIRFM deneylerde tek parçacık izleme izleme bireysel için sağlamak için gerektiği şekilde hücre GFPdüşük pozitif hücreleri (şekil 1), sıralama tarafından CXCR4-AcGFP düzeyi düşük ifade hücreleri seçin Yörüngeler9.
  4. Reseptörleri hücre yüzeyine sayısını ölçmek.
    Not: Bir örnek13, ~ 8500-22 000 AcGFP etiketli reseptörleri/hücre, ~ 2-4.5 parçacıklar/μm kalınlığında2' ye karşılık gelir.
  5. Resuspend tam RPMI hücrelerde sıralanmış ve en az 2 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya. Santrifüj kapasitesi hücreler (300 x g, 5 dk) ve onları TIRF arabellek (HBSS, 25 mM HEPES, % 2 FCS, pH 7.3) resuspended.
    1. 35 mm cam popolu microwell yemekler (2-3 x 105 hücre/çanak) uygun ligand (yani, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C) ve (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) fibronektin ile kaplı tabakta. Hücreleri (20 dk 37 ° c, % 5 CO2) resim alma önce kuluçkaya.
  6. Bir EM-CCD kamera, bir 100 x petrol-daldırma amacı ile donatılmış bir TIRF mikroskop kullanarak deneyler gerçekleştirmek (HCX PL APO 100 x / 1,46 NA) ve 488 nm diode lazer. Mikroskop sıcaklık kontrolü ve kuluçka CO2sağlar. Bulun ve photobleaching etkileri en aza indirmek için parlak alanını kullanarak kaba ve ince odak topuzlar, hücrelerle odaklanmak. TIRF modunda iyi odak ayarı için düşük lazer şiddeti, yetersiz tek-parçacık algılama için veya photobleaching etkileri (%5 lazer gücü, 28 μW) ikna etmek için kullanın.
  7. Filmler (görüntü sıralarını) yaklaşık 50 kazanmak çerçeveler arasındaki zaman aralığını en aza s. Fani alanının penetrasyon derinliği 70-90 nm olmalıdır. Deneysel her koşul için alınan Filmler ".lif" (video.lif) kaydedin.
    Not: Açıklanan örnek filmlerde %49 lazer güç satın aldı (2 mW) bir çekim hızı 90 MS ve 98 ms, 49 için bir zaman aralığı ile s (500 kare). Seçili fani dalgasının penetrasyon olduğunu 90 nm.

2. çeşitli görüntüleri ve maskeleri oluşturulması

  1. Deneysel her koşul (video.lif) için her serisi için farklı klasörler içermesi gerekir yeni bir klasör (VideoName) oluşturun. Her klasör için video görüntülerinin bir "videoSeq" klasör ve çözümleme sonuçlarını bir "sonuçlar" klasörünü içerir. Şu anda dosya yapısı aşağıda olduğundan emin olun:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Seri1/videoSeq
    VideoName/Seri1/sonuçlar
    Not: Mikroskop--dan farklı .lif dosyaları her tedavi durumu (FN, FN + SDF) için birkaç video ile elde edilir. "video.lif" mikroskop gerçekleştirilen input.lif video dosyası tüm TIRF film satın almalar (serisi) ile karşılık gelir. "videoSeq" klasör biz analiz film 500 çerçeveleri içerir. "Sonuçlar" klasör gerçekleştirilen çözümlemesinden tüm dosyaları içerir. Doğru isimlendirme ve yerelleştirme farklı klasörlerin algoritmalar doğru işlev için gereklidir. Adları kalın yukarıdaki listede sabit (yani, onlar çünkü komut dosyaları tarafından aranan isimler bunlar bu şekilde çağrılacak var). Adlarında değil kalın deneme gerçekleştirilen yansıtacak şekilde değiştirebilirsiniz.
  2. TIRFM video (.lif dosya) Fiji menü çubuğu ve BioFormats (tamamlayıcı şekil 1) kullanarak LIF dosyasını içe aktarmak için Tamam tıklayın dosyada bırakarak Fiji veya ImageJ ile açın.
  3. İşleme ve Tamam (tamamlayıcı şekil 2A)'ı tıklatın seriyi seçin. Bir maske bu video analizi için tasarlamak için aynı zamanda farklı kromofor ile çok kanallı bir görüntü alma (örneğin, serisi 1 Serisi 2 ilgili video ve çok kanallı görüntü'dir). Video (ve çok kanallı görüntü) bir ImageJ yığını olarak açılmalıdır. Örnekte (tamamlayıcı şekil 2B), görüntünün sol tarafta ve video sağ tarafta.
    Not: Video için bir maske oluşturulmasını gerekli değildir, adım 2.5 için gidin.
  4. Bir maske oluşturun. Tek bir görüntü ile kanalları maske tasarımı için yararlı oluşturun. Bu durumda, ilginç Kanallar kırmızı, yeşil ve gri olanlar vardır.
    1. Çok kanallı görüntü (ek şekil 3A) kanallardan bölünmüş: görüntü barda seçin menü ve tıkırtı renk | Kanalları bölmek. Farklı kanalları ayrı görüntüler (ek şekil 3B) olarak gösterir.
    2. Yine üç kanal (tamamlayıcı şekil 4A) tek bir görüntüde Birleştir: görüntü barda seçin menü ve Seç renk | Kanalları birleştirme. Uygun kanallar'ý seçin ve Tamam (tamamlayıcı şekil 4B) tuşuna basın. Yeni bir sigara yığılmış görüntü olacak (tamamlayıcı şekil 4 c) oluşturulur.
    3. İki windows Windows Eşitleme aracı (tamamlayıcı şekil 5A) kullanarak eşitleme: analiz barda seçin menü | Araçlar | Senkronize Windows. Eşitle görüntü olanakları ile yeni bir pencere (tamamlayıcı şekil 5B) gösterilecek.
    4. Senkronize iki pencere ile (çok kanallı görüntü ilişkili yok ise sadece video), her iki windows aynı bölgede kırpılmış olabilir. Faiz bölge ImageJ kayan menü dikdörtgen seçim aracı ile çizin. Barda görüntü seçin menü ve Seç kırpma (tamamlayıcı şekil 6A). İki kırpılmış görüntü tek tek gösterilir (tamamlayıcı şekil 6B).
    5. Her iki windows (tamamlayıcı şekil 6B) Windows Eşitleme Yöneticisi'nde Unsynchronize tüm düğmesine basarak unsynchronize.
  5. Bir maske gibi adım 2.4 oluşturduysanız, faiz bölge ImageJ kayan menü dikdörtgen seçim aracı ile çizin.
  6. Karşılık gelen video Rehberi (tamamlayıcı şekil 7A) altında dizin videoSeq bir Resim Silsilesi video Kaydet: çubuğunda dosya seçin menü ve Kaydet'i tıklatın olarak | Görüntü sırası..... video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (tamamlayıcı şekil 7B) olarak video sıra etiketlerini yeniden adlandırma: adı kutusuna video yeniden adlandırın ve Tamam' ı tıklatın. Sıra yalnız başarıyla U-track tarafından kullanılmak üzere kendi dizininde olması gerekir.
    Not: Video için bir maske tasarlama adım 2.8 için gitmek değilse.
  7. Bir maske tasarlayın. Çok kanallı görüntü seçin ve segmentasyon yayıncı tapa (tamamlayıcı şekil 8A) açın: eklentileri barda seçin menü ve Seç segmentasyon | Segmentasyon editörü. Eklemek ve segmentasyon Düzenleyicisi (ek resim 8B, C) etiketlerin üzerinde sağ tıklayarak ayrılmasını gerektiği gibi etiketleri yeniden adlandırın.
    1. ImageJ kayan menüsünde uygun seçim aracını seçin (burada, freehand kullanın), bir etiket (yeşil) seçin ve önce en dıştaki maskesi (tamamlayıcı Þekil 9A) Tasarla. Tasarlanmış sonra seçim seçeneği Bileşik penceresinin ve seçilen maske düğmesine basın + ekrana (tamamlayıcı Þekil 9A) görüntülenir. Sonraki etiketleri (iç, kırmızı) ile bu işlemi tekrarlayın (tamamlayıcı şekil 9B).
      Not: Yeşil ve iç etiketleri için maske tasarladıktan sonra dış maskesi görüntünün geri kalanı yer alacak.
    2. Maskeleri resimdeki bölgeleri olarak 0, 1, 2 kodlanmış... RGB etiketleri penceresi etiketlerinde sıraya göre. Maske farklı Etiketler tasarlanmıştır için kaydettiğiniz zaman maske adı mask.tif (tamamlayıcı şekil 9C) ile video olarak aynı dosya adıyla: çubuğunda dosya seçin menü ve Seç Farklı Kaydet | TIFF....
      Not: Seçili maskeleri Difüzyon katsayıları hesaplanması ve sınıflandırılması (bkz. Adım 4.2) yörüngeleri istihdam edilecektir.
  8. Şu anda dosya yapısı aşağıda olup olmadığını kontrol edin:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Seri1/mask.tif
    VideoName/Seri1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Seri1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Seri1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Seri1/sonuçlar
    Not: Mask.tif adımları 2.4 ve 2.7 tasarlandığı gibi maskeli bir görüntüdür. Video*.tiff video adım 2,6 kaydedilen gibidir. Yukarıda da belirtildiği gibi adları kalın olarak yukarıdaki listede sabit, yani, onlar çünkü komut dosyaları tarafından aranan isimler bunlar bu şekilde çağrılacak. Adlarında değil kalın deneme gerçekleştirilen yansıtacak şekilde değiştirebilirsiniz.

3. izleme parçacıklar

  1. U-parça kullanarak seçili filmlerinde görülen tüm parçacıklar izlemek.
  2. Matlab açıp U-track dizin yolunu yolu kullanarak ekleyebilirsiniz | Eklemek menüsünde alt klasörleri seçeneği ile. Gelecekte infaz Matlab U-parça olması yolundaki yolunu kaydedin. Bu yol ayarı yalnızca bir kez yapılması gerekir.
  3. Çalışma dizini analiz edilecek serisi içeren dizini değiştirin. U-parça içinde konsol (tamamlayıcı şekil 10) movieSelectorGUI yazarak çağırmak ve enter tuşuna basın. Film seçimi penceresi olacak (tamamlayıcı şekil 11A) açıldı.
  4. Yeni film butonuna basın ve film baskı pencere-ecek gözükmek (tamamlayıcı şekil 11B).
  5. Kanal Ekle (VideoName/Seri1/video) video ile dizin seçin ve film bilgileri parametreleri doldurmak için tuşuna basın. Belgili tanımlık verim müdür için U-track sonuçlarını sonuçlar için (videoName/Seri1/sonuçları) ayarlayın.
    Not: Film bilgi parametreleri mikroskop ve edinme koşulları elde edilebilir.
  6. Üzerinde Gelişmiş kanal ayarları düğmesine basın ve satın alma için ilgili parametreleri doldurun. Parametrelerin değerlerini (tamamlayıcı şekil 11C) örneğe.
  7. Gelişmiş kanal ayarları penceresinde kaydetmek ve film baskı penceresinde Kaydet tuşuna basın. Program ve sonuçları dizininde movieData.mat adlı dosyaya yazma onay isteyecektir. Onaylayın.
  8. Film oluşturduktan sonra Continue (devam) film Seçimi penceresi basın. U-track nesne türü hakkında çözümlenmesi için soracaktır. Tek-parçacıklar (tamamlayıcı şekil 12) seçin. Denetim Masası penceresi (tamamlayıcı şekil 13A) görünür.
    1. İlk adım seçin Adım 1: algılama ve ayartuşuna basın. Ayar Gauss karışım modeli uygun pencere-ecek gözükmek (tamamlayıcı şekil 13B). Örnekte, "Yerel arka plan ile karşılaştırma için alfa değeri" 3 (ek şekil 13B) 0,001 ve "Rolling-pencere saat ortalama" için ayarlanır.
    2. Uygula Ayarları Gauss karışım modeli uygun penceresinde ve Denetim Masası'nda çalıştırın basarsınız. Tamamlayıcı şekil 13yapılandırmada ile sadece algılama adım çalıştırır. Bu adımı birkaç (2-5) dakika sürer. Sonuçları (algılama, tamamlayıcı Şekil 14) adım 1 sonuç düğmesine basarak denetleyebilirsiniz.
      Not: Yukarıda gösterildiği gibi film kırmızı daireler algılanan parçacıklar gösterir. Kırmızı bir daire gösteriliyorsa, o zaman bu adımı doğru çalıştı değil.
  9. Parça, diğer bir deyişle, birleştirme alanına birden çok kare parça içine önceki adımda tespit parçacıklar tanımlaması gerçekleştirin. Bu Adım 2: izleme U-parça ayarlarını Tamamlayıcı şekil 15A-Ciçinde gösterildiği gibi tanımlanması gerekiyor. Örneğin kare kare bağlama ve boşluğu kapatma, birleştirme ve bölme için adım 2 maliyet işlev ayarları ek şekil 15B ve C, sırasıyla gösterilir.
  10. Adım 2 için parametreleri ayarlamanın sonra Denetim Masası ' ndaki basın çalıştırmak ve yalnızca adım 2 (tamamlayıcı şekil 16) çalışır.
  11. İzleme çözümlemesi, adım 3. Ayarlarýný da tamamlayıcı şekil 17 ' (doğru kapı aynası) gösterildiği gibi. Sonra Uygula ayarı-hareket analiz ve kontrol paneli-U-Track çalıştırmak panelinde tuşuna basın. Bu adımı birkaç saniye sürer.
  12. Adım 3 sonuç düğmesi ile işlemi doğru bir şekilde tüm parçalar belirlemiştir doğrulayın. Bunu yaparken, parça numarasını göster film seçenekleri penceresinin üzerinde tıklatın ve kare kare her parça oldu doğru (tamamlayıcı Şekil 18) tespit denetleyin. El ile gerçek parçacıklar değildir bu parçacıklar açıklama ekleyin.
    Not: Bu manuel seçim yapılmazsa, difüzyon katsayısı (bkz. Adım 4) hesaplandığında zayıf bir otomatik seçim daha sonra gerçekleştirilebilir.

4. Difüzyon katsayıları ve yörüngeler sınıflandırılması hesaplanması

  1. Tüm komut dosyalarını (örneğin, VideoName/Serie1) analiz ediliyor video Directory'den çağrılır emin olun.
  2. MATLAB'de veren tarafından Difüzyon katsayıları konsol komutu hesaplamak için tüm yörüngeleri okuyun: 0,1 saniye arasında iki ardışık kareyi (panel film gösterilen zaman aralığını, zamanında nerede trajectories=readTrajectories(0.1), Bilgi, tamamlayıcı şekil 11B).
  3. Hatalı belirlendi noktalar/yörüngeleri için karşılık gelen yörüngeler hariç. Dışlamak için noktalar bir listesini verebilir. Örneğin, 4, 5 ve 28 noktalar dışlamak için yazın: yörüngeleri readTrajectories (0,1, [4, 5, 28]) =.
  4. Bu hücrenin parçaların her biri için anlık Difüzyon katsayıları hesaplayın. Bu durumda, bir süre gecikme Difüzyon katsayısını hesaplar = 4, D1-4denir. Bunu yapmak, Matlab konsol koşmak belgili tanımlık buyurmak: D calculateDiffusion = (yörüngeler, 113.88e-3, 0.0015, 'Alfa') yörüngeleri adım 3'te, 113.88e elde edilen yörüngeleri nerede-3 mikron elde edilen görüntülerde piksel boyutunu, 0.0015 bir üst sınır Difüzyon katsayıları hareketsiz parçacıkların µm2/s, 'Alfa' ölçtüğü için aşağıda açıklandığı gibi donanımlı modelidir.
    Not: Bir daha hızlı kamera ve ihtiyaç kullanırken Difüzyon parametre hesaplamak için daha fazla kare, örneğin 20'ye, tarafından artırmak D calculateDiffusion = (yörüngeler, 113.88e-3, 0.0015, 'Alfa', '', 20). Dize parametresi 20, yukarıdaki, önce '', çıktı dosyasına eklenen sonek. Bu soneki farklı analizler ayırt etmek için kullanılabilir.
  5. MSD farklı bir işlevi ile daha bir farklı uygun modu ('sınırlı', 'ücretsiz' veya 'Yönetmen') ile calculateDiffusion işlevini çağırarak uygun. Örneğin, 'sınırlı': D calculateDiffusion = (yörüngeler, 113.88e-3, 0.0015, 'sınırlı').
  6. Yönlendirilmiş modeli için uygun sonuçlar elde etmek gibi ek şekil 20' de gösterilen.
  7. Yörüngeler kısa ve uzun yörüngeleri ayrıştırmak. Komutunu kullanın: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) 50 (gösterilen uzun örnekte) dikkate alınması gereken bir yörünge en az uzunluğunu çerçevelerinde nerede.
  8. Kısa yörüngeleri adım 4,3 açıklanan aynı uygun yordamı kullanarak çalışma: D calculateDiffusion = (shortTrajectories, 113.88e-3, 'Yönetmen', 0.0015, 'Kısa'). Kısa ve anormal yörüngeleri komutu ile analiz: D calculateDiffusion = (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'Alfa', 'Kısa').
  9. Onların an ölçekleme spektrum (MSS)7üzerinden hareket türünü sınıflandırmak için uzun yörüngeleri analiz. Komut: trajectoriesClassification classifyLongTrajectories = (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'uzun') analizi ekranda gösterir ve trajectoryClassification < sonek > .txt adlı bir dosya oluşturur dizin results\TrackingPackage\tracks.

5. küme Ssize parçacık yoğunluğu üzerinden hesaplanması

Not: Tüm komut dosyalarını (örnek gösterilen, VideoName/Serie1) analiz ediliyor video Directory'den çağrılır emin olun.

  1. Onların yörünge boyunca her parçacık yoğunluğunu analiz. Bunu yapmak, komut dosyasını çağırmak Matlab konsol yazarak: U-track ilk bölümünde tarafından hesaplanan yörüngeleri giriş olarak alır analyzeSpotIntensities. En basit haliyle, sadece herhangi bir bağımsız değişken olmadan komut dosyası (gösterilen, VideoName/Seri1 örnekte) analiz ediliyor video Directory'den çağrı analyzeSpotIntensities(). Bağımsız değişkenler komut dosyasında olarak için sağlayarak çok farklı şekillerde bu temel davranışını yapılandırın: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Değer1, ' Arg2´, değer2,...). Karşılık gelen değişken değerleriyle birlikte geçerli argümanlar ('ArgN´, deðerN) listelenir.
    1. ('spotRadius´, 1)
      SpotRadius karşılık gelen boyut 3 x 3 noktada ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)). merkezli bir yama 1 piksel (varsayılan olarak) kullanarak floresan yoğunluğu analiz
      Not: 5 x 5 noktada merkezli bir yama için bir spotRadius seçin 2, vs.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      (True, 1 değeri) bu bağımsız değişken belirtilmezse, yalnızca videonun ilk karesi başlatmak yörüngeleri analiz. Bu denetim görüntüler (varsayılan olarak 0, false) çözümlemek yararlıdır.
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Bu bağımsız değişken 0 (yanlış) olarak ayarlarsanız, noktanın koordinatı tüm çerçeveleri (hareketsiz noktalar için kullanışlıdır) için ilk çerçevesi içinde tutun. Bağımsız değişken 1'e (varsayılan 1, doğru) olarak ayarlarsanız, noktanın koordinatlarını hesapladım birlikte video aşağıdaki U-track tarafından izlenir.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Adım 4,3 (örnekte 4, 5, 28) hariç bu yörüngeler yörünge sayısını içerir.
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Bu değer 1 (doğru) ayarlarsanız, videonun sonunda yama yoğunluğu (yörünge daha önce bıraksa bile) kadar analiz edin. (TrackTrajectory yanlış olması durumunda) noktanın koordinatı yörünge (trackTrajectory doğruysa) son koordinatıyla veya yörünge ilk koordinatıyla değil. Bu bağımsız değişken ise false (0) varsayılan olarak.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Bu parametre ayarlanmışsa, o zaman doğru ham Floresans her noktada orayı (aşağıya bakın) için arka plan Floresans tahmininin tarafından ölçüldü. Bu bağımsız değişken ise, varsayılan olarak true (1).
    7. ('meanLength´, çerçeve numarası)
      Bu parametre ayarlanmışsa, ortalama yoğunluğu nokta Belirtilen uzunluğun ölçülür. 'MeanLength', 20 ilk 20 kare ortalama nokta yoğunluğunu ölçmek için ayarlayın. Bağımsız değişkeni ayarlarsanız, nokta yoğunluğu bütün yörünge (varsayılan olarak, tam uzunlukta) hesaplanır.
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Bu parametre yanı sıra kendi arka plan farklı çerçeveler boyunca yoğunluk profil çizmek için (varsayılan olarak 0, false), 1 ayarlayın.
      Not: Bu araziler tamamlayıcı şekil 21' de gösterilen photobleaching tanımlamak çok yararlıdır. Photobleaching oldu mümkünse her yolu için rutin otomatik olarak analiz eder. Bu ilk ve son N Çerçeveler yol boyunca öğrenci'nin t ile yoğunluk değerleri karşılaştırarak yapılır. Varsayılan olarak, N 10, ama bu değer bağımsız değişkeni değiştirilebilir ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, değer)
      Her spot arka plan belirlemek için bu parametreyi ayarlayın. Bu çeşitli şekillerde yapılabilir ve hangisinin kullanılacağını seçili değişen "değeri" olabilir:
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Arka planı tüm video için el ile belirlemek için bu değeri kullanın. 8 puan video ilk karesini seçmek için izin verir. Bu noktalar etrafında bir yama tüm video analiz edilir ve bu yoğunluklarını % 95 parametreli tüm noktalar için arka plan yoğunluk olarak seçilir.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Her çerçeve için arka planı el ile belirlemek için bu değeri kullanın. Her yer ve her çerçeve için 8 puan seçin. Bu zaman alıcı bir görev ama kontrolü bir çok kullanıcıya verir. Bu yamaları yoğunluklarını % 95 parametreli bu noktada bu çerçevedeki arka plan yoğunluk olarak seçilir.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Her spot arka plan hesaplamak için bu değeri tahmini 8 nokta etrafında bağımsız değişkeni tarafından kontrollü bir RADIUS ile yer alan dairesel puan üzerinden kullanımı ' backgroundRadius´ (varsayılan olarak, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Tarafından ilk hücrenin video bulmak ve her çerçevede (tamamlayıcı şekil 22) hücreye yoğunluklarda analiz her çerçeve için arka plan hesaplamak için bu değeri kullanın.
        Not: Arka plan gri değeri belirli bir parametreli Bu dağılım, olarak seçilir (varsayılan olarak 0.5 (= % 50), her ne kadar bu parametre bağımsız değişkeni denetlenebilir ' backgroundPercentile´, bu değer ayarlanabilir daha yüksek, örneğin, 0,9 (= %90) hücrenin arka plan olarak dikkate alınması gereken isteyen varsa. Hücre kimliği yardımcı olmak için hangi bağımsız değişken kullanarak çerçeveler beklenen en fazla arka plan değeri belirtmek ' maxBackground´ (örneğin, içinde tüm analiz videoları, arka plan değeri normalde hiç gider 6000)13. Varsayılan olarak, bu seçenek 0 bu yardım varsayılan olarak kullanılmaz anlamı, ayarlanır. Hücre algılama ve arka plan tahmini için bağımsız değişkeni ayarlayarak seçili alanı olan görmek ' showImages´ 1 (Durdur CTRL-C tuşlarına basarak istediğiniz zaman yürütme).
  2. Adımları 4 ve 5. 1, sırasıyla, kullanarak gatherDiffusion.AndIntensity () hesaplanan yörüngeleri Difüzyon ve yoğunluğu bilgi toplamak. Sadece kısa yörüngeleri Difüzyon ve yoğunluğu bilgi toplamak. Bunu yapmak, adım 4.7 ve türü kullanılan soneklerini kullanan: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) nerede ' Short´ olduğunu adım 4.7 içinde kullanılan soneki.
  3. An spektrum ölçekleme ve yoğunluk InformationBy yazarak toplamak: nereye 'Uzun' soneki kullanılır adım 4.7 gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') . Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan tüm dosyaların Şekil 2' de görüntülenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu Protokolü'nün kullanılmasına Floresans mikroskobu film ve dinamik özellikleri analiz tespit parçacıklar otomatik izleme sağlar. Başlangıçta, hücreleri izlenmesi gereken fluorescently birleştiğinde protein ile transfected. SPT (şekil 1) sıralama hücre tarafından elde edilir sağlar hücre yüzeyi reseptörleri uygun seviyede sunuyor. Seçili hücrelerin bu Protokolü (tamamlayıcı Video 1) açıklanan araçları ile okudu bir biçimde videolar oluşturur TIRF mikroskobu tarafından incelenir.

Oluşturulan videoları doğrudan analiz edemez ve her video bağımsız çerçeveler gereklidir. ImageJ kullanımı video kareleri .tiff biçiminde veya maskeler gibi Matlab yazılımlar kullanarak yorumlanabilir dosyaları oluşturur. U-track seçili video görülen parçacıklar izler ve Matlab (.mat) dosyalarında (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat) bilgileri kaydeder, bkz: Şekil 2.

Şekil 2' de gösterildiği gibi Difüzyon katsayıları hesaplanması ve yörüngeler komutları, sınıflandırılması oluşturur farklı dosyaları (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, vb). Bu dosyalarda yer alan bilgiler en iyi Excel ve prizma yazılımı kullanılarak yönetilir. Bu analiz elde edilebilir bilgiler aşağıdakileri içerir:

  1. Hareketsiz noktalar yüzdesi. Hareketsiz parçacıklar başvuru olarak kullanabilirsiniz: % 95 persentil değerlerden elde edilen D1-4 (1) sabit hücrelerdeki saçılan tek ve/veya (2) gelen arıtılmış floresan protein bağlı coverslips (şekil 3A).
  2. Uzun yörüngeleri yüzdesi (> 50 çerçeve) (şekil 3B).
  3. Uzun yörüngeleri hareketi türü: Yönetmen, ücretsiz, (şekil 3 c) sınırlı.
  4. Difüzyon katsayısı (D1-4) hücrelerdeki mobil parçacıkların farklı uyarıcı (şekil 4A) ile tedavi.

Adım 5 Protokolü'nün her parçacık yörünge boyunca yoğunluklarda analiz eder. Komut dosyası analyzeSpotIntensities ekranda analiz tüm bilgileri yazdırır. Her nokta için ve çerçeve, komut dosyası gösterir (x, y) Bu çerçevede noktanın koordinatı piksel birimleri, arka plan floresan (k0), ham nokta yoğunluğu içinde 3 x 3 yama, düzeltilmiş yoğunluk tahmini (ham yoğunluk olarak hesaplanan, arka plan), yoğunluğu bu nokta nerede yama ve bölge numarası maske içinde gözlenen en büyük değerini bu çerçeve yer alır. Üretilen çıktı tür bir örnektir

Spot = 43 kare 184 =
x 78.0397 =
y = 72.5395
k0 1571 =
spotRawIntensity 5550.1111 =
spotCorrectedIntensity 3979.1111 =
maxCorrectedSpotIntensity 6243 =
maskRegion = 2

Tüm bu bilgileri bir günlük dosyası (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) ve (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt) Excel okunabilir bir tabloda depolanır. Her spot çözümledikten sonra komut dosyası yörünge ve maske içinde majoritarian bölge boyunca ortalama yoğunluğu yazdırır

Spot 43 =
çerçeveler boyunca meanCorrectedSpotIntensity 4762.303 =
majoritarian bölge = 3

Bu bilgiler günlük dosyasının yukarıda ve bir elektronik tablodan (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt) okunabilir bir tablo depolanır. Örneğin, ortalama spot yoğunluklarda (MSI) hücrelerde farklı koşullar ile uyarılan onların yörünge boyunca her parçacık için şekil 4B' gösterilir. Biz şimdi kabaca floresan küme boyutunu tahmin etmek için bu bilgileri kullanabilirsiniz. Bir spot's ortalama düzeltilmiş yoğunluğu floresan proteinler bu noktada mevcut sayısı ile ilgili ve bir monomer Floresans benzer ancak birbirinden bağımsız deney ölçülebilir, doğrudan reseptörleri parçacık başına sayısını hesaplayın. Parçacık yoğunluğu aynı hücrelerde ifade monomeric protein referans olarak kullanarak başına reseptör sayının frekans dağılımı şekil 4 cgösterilir.

Toplamak Difüzyon ve yoğunluk komut iki dosyaları oluşturur: bir denilen diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtve başka bir seslenmek log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt dizinindeki sonuçları / TrackingPackage/parça. Her iki dosya 1) spot dizin, 2) Difüzyon katsayısı, 3) yoğunluğu ve maske içinde 4) bölge numarası içerir. Bu dosyalar bir elektronik tablodan okuyabilirsiniz.

Benzer şekilde, toplamak yörünge sınıflandırma ve yoğunluğu komut iki dosya bir denilen trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt ve başka bir log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt içinde oluşturur dizin sonuçları/TrackingPackage/parça. İlki 1) spot dizin, 2) hareket tipi, 3) spot ilk an, 4) yoğunluğu, 5) D1-4 ve 6) bölge sayısı maske içinde içerir. Bu dosya Excel okuyabilirsiniz.

Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan tüm dosyaların Şekil 2' de görüntülenir. Bu iletişim kuralını kullanan gerçekleştirilebilir diğer analiz küçük vs daha büyük noktalar, yani monomerleri vs reaksiyonlar, bu dinamik parametreler indüklenen ligandlar, inhibitörleri, membran kompozisyon çeşitleri dinamik parametrelerin karşılaştırılması içerir, sinyal yolları, vb değişiklik. Yanıt-e doğru onun ligand CXCL12 çeşitli deneysel koşullarda CXCR4 davranış tam bir analiz bu protokolü13kullanılarak yapılmıştır.

Figure 1
Resim 1 : Hücre sıralama. GFP Jurkat hücrelerdeki ifade önce ve sonra hücre sıralama CXCR4-AcGFP ile transfected. GFP (GFPdüşük) seviyesinin düşük ifade hücre seçilir ve TIRF deneyler için istihdam.

Figure 2
Resim 2 : Özet oluşturulan dosyaların. Şekil açıklanan Matlab rutin kullanılarak oluşturulan tüm dosyaları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Yörüngeleri sınıflandırılması. Yörüngeler hücrelere karşılık gelen farklı türde dizi farklı uyaranlara ile tedavi. (A)hareketsiz lekeler, uzun yörüngeler ve uzun yörüngeleri hareketi (C) tipi (B) yüzdesi yüzdesi.

Figure 4
Şekil 4 : Difüzyon katsayısı, ortalama spot yoğunluklarda ve reseptörleri başına parçacık sayısı. (A)dağıtım için her yerde farklı bizi canlı tutan (ı, II, II ve IV) kısa Difüzyon katsayıları (D1-4) değerler. Kırmızı çizgi D1-4için medyan değeri temsil eder. (B) ortalama spot yoğunluklarda (MSI) değerleri farklı bizi canlı tutan (ı, II, II ve IV) onun ilk 20 kare boyunca her yer için. Kırmızı çizgi ortalama yoğunluk değeri (SD) temsil eder. Depo gözü genişlikte monomeric protein yoğunluk değeri alarak (C) yüzdesi reseptörleri/parçacık olarak bireysel parçacıkların yoğunluğu dağılımından ayıklanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 1: Fiji veya ImageJ TIRFM dosya açma. Bir .lif video bırakarak üzerine biyo-biçimleri penceresinde görüntülenen seçenekleri. Rakam indirmek için buraya tıklayınız. 

Tamamlayıcı Resim 2: Seriyi seçin. .Lif video görüntüleri mevcut. Çok kanallı görüntüler de dahil olmak üzere seçim serisinin olmak analiz etmek için izin verir(a)pencere. (B) serisi seçimi, çok kanallı görüntü (solda) da dahil olmak üzere ve (sağda) video karşılık gelen sonuç örneği. Rakam indirmek için buraya tıklayınız. 

Tamamlayıcı şekil 3: Kanalları bölün. (A)pencere yakalama ImageJ komut bir çok kanallı görüntü ve (B) sonuç örnek kanal kanal bölmek için Böl. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 4: Kanalları Birleştir. (A)tek bir görüntüde farklı kanalları birleştirme. (B) kanal seçimi birleştirmek için. (C) kanal birleştirme örneği sonuç. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 5: Windows Eşitleme. Görüntü eşitleme ve (B) elde edilen pencere için gerekli komutları(a)lokalizasyonu ImageJ menüsünden. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 6: Faiz bölgeyi seçin. (A)seçimi pencerenin dikdörtgen seçim aracı ve görüntü kırpma sonucu (B) kullanarak ilgi. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 7: Video kaydetmek. Bölgenin ilgi için Kaydet görüntü sırası ve parametreleri görüntü sırası pencere olarak kaydedin. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 8: Segmentasyon. (A)açık ImageJ'ın eklentileri menüsünde segmentasyon yayıncı tapa. (B) etiketleri/malzemeleri ayrılmasını için ekleyin. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 9: Maske tasarım. (A)seçimi uygun etiketleri ve yeşil maske tanımı. Kırmızı maske (B) seçimi. İki etiketlerine karşılık gelen iki maske örneği. (C) maskeler .tiff dosyası olarak kaydedin. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 10: MATLAB çalışma dizini. Analiz edilecek serisi içeren doğru dizin seçimi. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 11: U-track ana menü. (A)film seçimi, (B) film baskı ve (C) kanal Ayarlar menüleri. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 12: İzlemek için nesnenin türünü seçin. İzleme tek parçacıkların seçin. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 13: Parçacıklar olarak algılanması. (A)U-track, Denetim Masası. (B) ayarları parçacıklar tespiti için örneği. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 14: Örnek sonuçları parçacık algılama için. Bir Görüntüleyici menü, film seçenekleri menü ve film içeren farklı windows. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 15: İzleme menüsü. Ayarları örneği. Ayarlama - kare-kare bağlama(a)izleme, (B) ve (C) boşluk kapatma, birleştirme ve bölme menüler. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 16: Örnek izleme parçacık için sonuçlar. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 17: Parça analizi menü. Ayarları örneği. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 18: Doğrulama parça analizi. Tespit parçacıklar gösteren bir video penceresi ve karşılık gelen izlerini de dahil olmak üzere parça analiz sonra görüntülenen ekran. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 19: Difüzyon katsayıları hesaplanması. Histogramlar Difüzyon katsayıları (solda) hesaplanır ve deplasman (MSD, sağ) ortalama kare. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 20: Difüzyon katsayıları farklı uygun modları dahil olmak üzere hesaplanması. Histogramlar Difüzyon katsayıları (solda) hesaplanır ve deplasman (MSD, sağ) kapalı modeli için ortalama kare. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 21: Yoğunluk profilleri. Nokta yoğunluğu onun yörünge (mavi çizgi) ve arka plan (kırmızı çizgi) boyunca örneği. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 22: Her çerçeve için arka plan. Sol: Örnek hücre görüntü. Orta: Otomatik olarak hücre algıladı. Sağ: Seçili alanı otomatik olarak arka plan olarak. Rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Video 1: Parçacıklar farklı şiddetlerde ve hareketlerin türleri ile varlığını gösteren tipik TIRF video mikroskobu örneği. Video indirmek için buraya tıklayınız.

Ek malzeme 1: Geçici yordamlar yörüngeleri sınıflandırılması ve küme boyutu analizi için istihdam istihdam tüm iletişim kuralı komut dosyalarını içeren dosyaları. Malzeme indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan yöntemi bile Matlab ile çalışan herhangi bir önceki deneyimi kalmadan gerçekleştirmek kolaydır. Ancak, Matlab rutinleri son derece farklı komutlar isimlendirme ve program tarafından istihdam farklı klasörler lokalizasyonu ile doğruluk gerektirir. İzleme çözümlemesi rutin (Adım 3), birden çok parametre değiştirilebilir. "Ayarı Gauss karışım modeli uygun" pencere (Adım 3.8) U-parça videoda tek parçacıkların nasıl algılar denetler. Bu3' te açıklandığı gibi bir Gauss karışım modeli yaklaştırarak yapılır. Bu montaj için önemli parametrelerden biri yerel maxima tanımlama yardımcı olması için bir filtre tanımlar. Görüntü kontrastı ve gürültü görüntüleri mevcut bu operasyonun başarısı bağlıdır. İlk parametre (alfa değeri yerel arka plan ile karşılaştırma için) bir maxima noktalar tanımlaması sırasında gürültü azaltmak için ikinci yardımcı olur ise gerçek bir nokta olmak güven denetler. (Yani bir parça parçacık aslında görmedim ama gördüm bu kareler önce ve sonra bu kareler; Örneğin, 0 çerçeve üzerinde yayılabilir) boşlukları kapatmak için çerçeve sayısına "İzleme" adım (3,9) önemli parametreleridir ve bir parça başarılı bir parça olarak dikkate alınması için yayılan gerekir kare sayısı (örneğimizde, fotoğraf makinesi satın alma hızı 20; bu parametre ilgilidir ve Difüzyon co hesaplama sağlar öyle ki parça sayı kare olmalıdır verimli). Birleştirme ve kesimleri (örnekte bu iki olasılık seçilmiştir) split karar vermek önemlidir. Sonra adım 1 (kare kare bağlama) maliyet işlevleri için parametreleri ayarlamanız gerekir. Bu işlev parçacıklar çerçeveler nasıl izleneceğini kontrol eder. En önemli parametreler bu noktada hangi ne kadar her spot sonraki çerçevede olması bekleniyor kontrol Brown ara RADIUS seçim olduğunu. Bizim örnekte 0 ve 5 alt ve üst sınırların, sırasıyla seçtik. Not Bu parametreler çok izlenen parçacıklar doğaya özgü ve onlar her özel durumda şekilde ayarlanmış olabilir. Özellikle önemli olan Albert ölçekleme iktidarda ve lineer yarıçapı arayın. Bunlar güçler ölçekleme (ücretsiz ya da sınırlı Difüzyon) parçacıkların hareketi türüne bağlıdır. Örnek, değerler (0.5, 0.01) ücretsiz Difüzyon seçilmiştir. Bu parametreler belirli belgeler için3' e bakın.

Difüzyon katsayıları komut (Adım 4.4) hesaplamada, hareketsiz parçacıklar Difüzyon katsayısı üst sınır önceki deneyler veya calculateDiffusion işlevi ile hareketsiz ayrı bir proje üzerinde çalışan tarafından bilinen olabilir parçacıklar (saf monomeric floresan protein) ve Difüzyon katsayıları görme bildirdi. Bu işlev iki ilave parametre alır: ' outputSuffix´, çıktı dosya adları eklenir ve varsayılan olarak boş değer alır, ve ' plotLength´, bu varsayılan 13 ve Difüzyon hesaplama yapıldığı içinde gecikme süresi (saniye) sayısıdır. Uygun modu 'Alfa' eğri için MSK bir ayarlama anlamına gelir.

Equation 1

diğer bir deyişle, bir uzaklık (MSD0) ve kuvvet işlevini zaman lag. Bu güç işlevi, üs Equation 2 , hareketi sınırlı olup olmadığını belirler (0 < α < 0,6), anormal (0,6 < α < 0,9), özgür (0,9 < α < 1.1), veya (α > 1.1) Yönetmen. Bu tür analiz için bir inceleme Manzo vd.9 ' a okuyucu denir

Difüzyon katsayıları4 hesaplanması iki çıkış rakamları (bkz. ek şekil 19) üretir. İlki (Bu noktada, orada olduğunu her yörünge için bağımsız Difüzyon katsayısı Difüzyon katsayıları hesaplanan unutmayın) histogramını gösterir. Ortalama ve % 95 persentil bu katsayılarının Matlab konsol gösterilir. İkinci çizimin MSD (kırmızı eğri) ve mobil olarak kabul Bu yörüngeleri için gecikme süresi bir fonksiyonu olarak hesaplamak için kabul adımları (Bu komut satırında verilen eşik olan Difüzyon katsayısı üzerindedir) sayısını gösterir. Ortalama ve standart sapması mobil yörüngeleri hesaplanan (bunlar için tek bir hücrede yörüngeleri değerlerdir). Örnekte, üs hareketi sınırlı 0,59 anlamıdır. Bu eğri uydurma için program (mükemmel bir uyum sıfır ulaşmak) her biri (her biri standart sapması gösterilen) parametreler ve uyum iyiliği için ilgili belirsizlik raporları. Bu noktada ve alfa değerini kontrol ettikten sonra farklı bir işlevi ile MSD sığacak şekilde karar verebilir:

Equation 3    If 0 < α < 0.6 (sınırlı)

Equation 4Eğer 0.9 < α < 1.1 (ücretsiz)

Equation 5Eğer α > 1.1 (yönetmen)

Anormal yörüngeleri farklı bir işlevi ile donatılmış değil. Sınırlı parçacıklar halinde Destainville et al.olduğu gibi doğumdan boyutu (mikron) hesaplayabilir14

Equation 6

Oturan iyilik son prova için uygun alpha üzerinden azaltmak gerekir uygun bir doğru güzel şekilde göstergesidir (örneğin, uygun iyilik 0.30474 0.15749, tamamlayıcı şekil 19-20düşer). calculateDiffusioncreates iki eğe iç belgili tanımlık serisi müdür "results\TrackingPackage\tracks" içinde "diffusionCoefficients.txt" ve "diffusionCoefficientsMobile.txt" denir. Bu dosyalar üç sütun içerir: 1) her dizin girişi yörünge, 2) onların karşılık gelen Difüzyon katsayısı, 3) majoritarian bölgede bu parça ait olduğu için maske (bölgeler "Biz adımda oluşturulan mask.tif" dosyasından alınır 2.7; Bu dosya yoksa, o zaman bu sütun mevcut değil). Difüzyon katsayısı benzer deneysel koşullar altında hücre kümesi için dağıtım analiz etmek için bu dosyayı ve diğer hücreler için oluşturulan benzer dosyaları kullanabilirsiniz.

Kısa yörüngeler (adımları 4,7-4,8), difüzyon katsayısı hesaplamasında son parametre 'Kısa' yazmadan yörüngeler, farklı alt kümelerini analiz edebiliriz çıktı dosya adı eklenerek bir ekidir diffusionCoefficients.txt dosyaları. Çıkış dosyalarının gerçek adı "diffusionCoefficients < sonek > .txt" ve "diffusionCoefficientsMobile < sonek > .txt" dir. Eğer olduğu gibi yukarıda, gerçekleştirilen genel analiz sonek verilmezse boş bir soneki kabul edilir. Modeli parametreler (D, v ve MSD0) olanlar için tüm yörüngeleri donatılmış farklı olabilir. En dikkat çekici, parametreleri hem de iyilik uygun standart sapması normal artırın. Sebebi kısa yörüngeleri daha kararsız ve güvenilir uygun bir daha zordur.

Uzun yörüngeler (Adım 4,9) analizini sınıflandırmak onları kapalı (1), özgür (2), veya yönlendirilmiş (3) onların ilk anda ve % 2.5 ve % 97.5 testlerinde açısından konumu 500 rasgele yollarının ilk anın göre Albert hareket, aynı Difüzyon katsayısı ve analiz ve tarafından Monte Carlo simülasyonu yörünge olarak uzunluğu. Analiz ediliyor yolun ilk an simülasyonlar içinde gözlenen ilk anlarda %2.5 altındaysa, okudu yolu sınırlı olarak sınıflandırılır. Benzetim yapılmış ilk anlarda % 97.5 ise, yönetmen olarak sınıflandırılır; Aksi takdirde, yolun Brown olarak sınıflandırılır. Belgili tanımlık buyurmak içinde istihdam, 113.88e-3 µm piksel boyutunda, 0.0015 hareketsiz noktalar µm2/s ve 'Uzun' ölçülen Difüzyon katsayısı üst sınır olduğu çıktı dosya adı soneki. Yörünge sayısı ("trajectoryClassificationLong.txt") bu dosyasının ilk sütundur, ikinci onun sınıflandırmadır (1 = sınırlı, 2 ücretsiz, = 3 = yönetmen), ve Üçüncü merminin ilk an.

Her parçacığı (adımı 5.1) yoğunluğunu hesaplamak için komut dosyası son derece esnektir ve çok farklı şekillerde Floresans yoğunluklarda izleme sağlar (her biri uygun bir denetim deney hareketsiz noktalar izleme gibi farklı durumlar için veya değişken floresan arka plan ile bir hücre üzerinde son derece hareketli noktalar izleme). Komut dosyası tüm kareler boyunca tüm yörüngeleri analiz eder. Her noktada her çerçeve için bu-pikselleri (Bu bir boyutu 3 x 3 piksel varsayılan spot, etrafında kare bir yama çözümler) nokta yoğunluğunu ölçmek, spot arka plan ve spot Floresans farkı hesaplar tahmin ve arka plan. Photobleaching parçacıklar ve floresan parçacıklar tek bir nokta görülen, tek bir küme sayısı yüzdesi bu şekilde tahmin edilebilir.

Bu otomatik yöntemi (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) Bazal koşullar, onun dinamik ve nokta boyutu arasındaki ilişkiyi incelemek için yardımcı olabilir birden çok parametre (nokta yoğunluğu, yanal difüzyon, hareket türü), bilgi üreten, ve nasıl farklı tedaviler bu parametrelerde değişiklik yapabilirsiniz.

Yöntemin ana sınırlama hücre transfection izlenmesi gereken floresan protein ile gerektirmesidir. Genellikle transfection protein overexpression, tek protein izleme engel bir gerçek yol açar. Adım sıralama bir hücre bir sayı algılama izin reseptörlerinin ifade ve tek parçacıkların SPT-TIRF mikroskobu tarafından izleme hücreleri seçmek için dahil edilmelidir. Bu yöntem aynı zamanda kuantum nokta ile etiketli biomolecules izlemek için istihdam olabilir veya Fab parçaları. Açıklanan protokol bir dizi daha önce analiz tahrikli sonuçlar doğru olduğundan emin olmak için analiz gerekir denetim gerektirir. İlk olarak, algılama ve izleme tek parçacıkların izin uygun ifade koşulları belirlemek için önemlidir. Yoğunlukları ile Filmler ~ 8500-22.000 reseptörleri/hücreye karşılık gelen 4,5 parçacıklar/µm2, hücre membran reseptör13spatio-temporal organizasyonu analiz etmek için kullanılmıştır.

Minimum algılanabilir Difüzyon katsayısı saf monomeric AcGFP proteinler veya sabit hücreleri kullanarak kurmak önemlidir. Her iki durumda da bu yok Difüzyon ve bu nedenle tahmin ettiğimiz bu şartlarda analiz parçacıkların Difüzyon değerleri için immobilize parçacıklar karşılık gelen ve mobil ve hareketsiz yörüngeleri13arasında ayırımcılık için kullanılan kabul edilir.

Difüzyon superresolution tarafından reseptörlerinin analizi, sınırlı kırınım görüntüleri analiz ve hücresel hareket analizi tarafından standart mikroskobu uygulanabilir genel yörünge analiz aracı, biz burada sundu analiz olduğunu . Diğerleri daha önce açıklandığı gibi sayı ve parlaklık11, analiz bu yöntemle en büyük avantajı her zaman dikkate alarak onun yörünge boyunca bir spot ortalama yoğunluk değerleri değerlendirilmesi sağlanmıştır hayatta kalma AcGFP monomeric protein photobleaching önce. Yaşam süresi bir molekülün photobleaching önce şiddetle uyarma koşullara bağlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz Carlo Manzo ve Maria García Parajo Difüzyon katsayısı analiz onların yardım ve kaynak kodu için müteşekkiriz. Bu eser kısmen İspanyol bilim Bakanlığı, yenilik ve üniversiteler (SAF 2017-82940-R) gelen hibe tarafından desteklenen ve Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 ve RD16/0012/0006; RETICS programı RIER). LMM ve JV Fundación genel CSIC COMFUTURO program tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 146 SPT Kemokin reseptör takip kümeler difüzyon analiz yazılımı
Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sorzano, C. O. S.,… More

Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter