Summary
עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.
Abstract
הדג הוא אורגניזם בשימוש נרחב בעלי חוליות מודל עבור המחלה והפניטיפ מבוססי גילוי סמים. הדגים מייצרים צאצאים רבים, יש עוברים שקופים ופיתוח חיצוני מהיר. עוברי הדגים מסוגלים, לפיכך, לשמש גם להערכה מהירה של רעילות של תרופות יקרות וזמינות בכמויות קטנות. במאמר הנוכחי, שיטה להקרנה יעילה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות העוברים הפריה יום 1-5 לאחר הימים מתואר. העוברים מנוטרים על ידי הstereomicroscope כדי לחקור את הפגמים פנוטיפקס הנגרמים על ידי החשיפה לריכוזים שונים של תרכובות. ריכוזים קטלניים חצי מקסימלית (LC50) של תרכובות נקבעות גם. המחקר הנוכחי נדרש 3-6 מ"ג של תרכובת מעכב, ואת הניסוי כולו לוקח כ 8-10 h להסתיים על ידי אדם במעבדה שיש מתקנים בסיסיים. הפרוטוקול הנוכחי מתאים לבדיקת כל תרכובת לזיהוי השפעות רעילות בלתי נסבלת או מחוץ למטרה של התרכובת בשלב המוקדם של גילוי הסמים ולגילוי אפקטים רעילים עדינים שעלולים להחמיץ בתרבות התאית או בדגמי בעלי חיים אחרים. השיטה מפחיתה עיכובים פרוצדורליים ועלויות של פיתוח סמים.
Introduction
פיתוח הסמים הוא תהליך יקר. לפני מתחם כימי יחיד אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) והסוכנות האירופית תרופות (EMA) כמה אלפי תרכובות מוקרנים בעלות של מעל 1,000,000,000 דולר1. במהלך הפיתוח הקדם-קליני, החלק הגדול ביותר של עלות זו נדרש עבור בדיקת החיות2. כדי להגביל את העלויות, חוקרים בתחום פיתוח התרופה זקוקים למודלים חלופיים להקרנה בטיחות של תרכובות כימיות3. לכן, בשלב המוקדם של התפתחות התרופה, זה יהיה מאוד מועיל להשתמש בשיטה שיכולה להעריך במהירות את הבטיחות והרעילות של תרכובות במודל מתאים. ישנם מספר פרוטוקולים ששימשו להקרנה רעילות של תרכובות כימיות מעורבים בעלי חיים ומודלים של תרבות התא, אבל אין פרוטוקול אחד כי הוא מאומת והוא בשימוש משותף4,5. פרוטוקולים קיימים באמצעות דג זברה להשתנות באורך ושימשו על ידי חוקרים בודדים אשר העריכו את רעילות לפי דרישת הנוחות שלהם6,7,8,9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה
בעבר האחרון, דג דג זברה התפתחה כמודל נוח להערכת רעילות של תרכובות כימיות במהלך התפתחות עובריים6,7. לדג יש יתרונות רבים ומובנים להערכת תרכובות כימיות13. אפילו ניסויים בקנה מידה גדול הם קלה, כמו נקבה דג זברה יכול להטיל אצוות של 200-300 ביצים, אשר לפתח במהירות ex vivo, לא צריך האכלה חיצונית עד שבוע והם שקופים. את התרכובות ניתן להוסיף ישירות לתוך המים, שם הם יכולים (בהתאם לאופי המתחם) לפזר דרך chorion, ואחרי הבקיעה, דרך העור, זימים והפה של הזחלים. הניסויים אינם דורשים כמויות שפע של תרכובות כימיות14 בשל הגודל הקטן של העובר. פיתוח העוברים ומבטאים את רוב החלבונים הדרושים כדי להשיג את התוצאה ההתפתחותית נורמלית. לכן, עובר דג הוא מודל רגיש כדי להעריך אם תרופה פוטנציאלית יכול להפריע לתפקוד של חלבון או מולקולה איתות כי הוא משמעותי בפיתוח. האיברים של דג דג זברה להיות פונקציונלי בין 2-5 dpf15, ותרכובות רעילים במהלך תקופה זו רגיש של ההתפתחות העובריים לגרום למומים פנוטילים בזחלים דג זברה. שינויים אלה גמישות פנוטיפית ניתן לזהות בקלות באמצעות מיקרוסקופ פשוט ללא טכניקות פולשני11. עוברי הדגים משמשים רבות במחקר רעילות בגלל המורכבות הביולוגית הרבה יותר שלהם בהשוואה לסינון סמים מחוץ לתחום באמצעות מודלים של תרבות התאים16,17. כמו בעלי חוליות, האיפור הגנטי הפיזיולוגי של דג דג זברה הוא דומה לבני אדם ולכן רעלים של תרכובות כימיות דומים בין דג זברה ובני אדם8,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , 22. zebrafish הוא, לפיכך, כלי חשוב בשלב מוקדם של גילוי סמים להערכת רעילות ובטיחות של תרכובות כימיות.
במאמר הנוכחי, אנו מספקים תיאור מפורט של השיטה המשמשת להערכת הבטיחות והרעילות של תרכובות המעכב (CA) מעכב פחמניים באמצעות 1-5 היום הפריה הפוסט (dpf) דג זברה העוברים על ידי חוקר יחיד. הפרוטוקול כולל חשיפת עוברי דגים בריכוזים שונים של תרכובות מעכבי כימיים ללמוד את התמותה ואת השינויים פנוטיפקס במהלך ההתפתחות העוברית. בסוף החשיפה לתרכובות כימיות, מינון LC50 של הכימיקל נקבע. השיטה מאפשרת לאדם לבצע הקרנה יעילה של 1-5 תרכובות בדיקה ולוקח כ 8-10 h בהתאם לניסיון של האדם עם השיטה (איור 1). כל אחד מהצעדים הנדרשים להערכת רעילות התרכובות מתואר באיור 2. הערכת רעילות של מעכבי CA דורש 8 ימים, כולל הגדרת זוגות ההזדווגות (יום 1); איסוף העוברים ממיכלי הרבייה, ניקוי והעברתו לאינקובטור 28.5 ° c (יום 2); התפלגות העוברים לבארות של הצלחת 24-באר ותוספת של תרכובות המעכב מדולל CA (יום 3); הניתוח פנוטימית והדמיה של הזחלים (יום 4-8), וקביעת מינון LC50 (day8). שיטה זו מהירה ויעילה, מחייבת כמות קטנה של תרכובת כימית ורק מתקנים בסיסיים של המעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מתקן הליבה דג זברה באוניברסיטת טמפרה יש אישור מוסד שניתנו על ידי הלוח הלאומי ניסוי בעלי חיים (esavi/7975/04.10.05/2016). כל הניסויים באמצעות העוברים דג זברה בוצעו על פי ממשלת מחוזי של פינלנד המזרחית, המחלקה החברתית והבריאות של שירות אזורית טמפרה פרוטוקול השירות האזורי lslh-2007-7254/Ym-23.
1. הקמת מיכלי הזדווגות לילה
- מקום 2-5 בוגר זכר דג זברה ו 3-5 נקבה מבוגרת הדגים לתוך מיכלי הזדווגות לילה. (הרבייה מושרה בבוקר על ידי מחזור כהה אוטומטי ואור בלילה).
- להגדיר כמה צלבים כדי להשיג מספיק עוברים להערכת רעילות של יותר משני תרכובות כימיות. להערכת רעילות, כל ריכוז זקוק למינימום של 20 עוברים23.
- כדי להימנע מטיפול בלחצים לבעלי חיים, הניחו לחיות לנוח למשך שבועיים לפני השימוש באותם אנשים לצורך הרבייה.
2. אוסף העוברים והכנת צלחות לחשיפה לתרכובות כימיות
- לאסוף את העוברים, יום למחרת לפני הצהריים, באמצעות מסננת בסדר שינוי ולהעביר אותם על צלחת פטרי המכיל E3 העובר בינוני [5.0 mM הנאקל, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 Mm MgSO4, ו 0.1% w/v מתילן Blue].
- הסרת פסולת באמצעות פיפטה מפלסטיק של פסטר (למשל, מזון ופסולת מוצקה). בחנו כל קבוצה של עוברים תחת הstereomicroscope כדי להסיר את העוברים הבלתי מופרות/מתים (המזוהים באמצעות המראה האטום שלהם).
- לשמור על העוברים ב 28.5 ° c בחממה. לבחון את העוברים, בבוקר שלמחרת, תחת stereomicroscope ולהסיר עוברים בריאים או מתים. כמו כן, החלף את המדיום E3 הישן עם מדיום E3 טרי.
הערה: עוברי הדגים מתוחזקים תמיד ב-28.5 ° c בתנאי מעבדה. - העבר בזהירות 1 העובר לתוך כל טוב של הצלחת 24-באר המכיל מספיק E3 בינוני כדי לכסות את העוברים.
3. ההכנות של פתרון המניה של תרכובות כימיות והפצה של תרכובת מדוללת בבארות
- קחו את הבקבוקונים המכילים תרכובות מעכבי המאוחסנות ב -4 ° c.
הערה: בהתאם למאפיינים של התרכובת, אלה מאוחסנים בטמפרטורות שונות. - שוקלים את התרכובת באמצעות איזון אנליטי שיכול לשקול כמה מיליגרם (mg) של המתחם במדויק.
- הכינו לפחות 250 μL (100 מ"מ) של פתרון מניות עבור כל תרכובת בממס מתאים (למשל, E3 מים או Diמתיל סולפוקסיד (DMSO), מבוסס על מאפייני מסיסות של תרכובות.
הערה: ניתן לבצע את השלבים לעיל יום לפני תחילת הניסוי בזמן נוח ומאוחסן ב -4 ° c. - הפוך את הדילול הסידורי של פתרונות המניה (e. g., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM ו-500 μM) באמצעות E3 מים ב 15 שפופרות צנטריפוגה mL.
הערה: ריכוזי ומספר הדילול הסדרתי משתנים מתרכובת אחת לתרכובת אחרת, בהתאם לרמת הרעילות שלהם. - מצלחת 24 היטב המכיל עוברים, להסיר E3 מים מן הבארות באמצעות הפיפטה פסטר ופיפטה 1 mL (המכיל אחד עוברי dpf) שורה אחת בכל פעם.
- פזר 1 מ ל של כל מדלל בכל באר (החל מלמטה ומתקדם לריכוז גבוה יותר) לתוך הבארות של הצלחת 24-באר.
- הגדר קבוצת בקרה מאותה קבוצה של עוברים והוסף את הכמות המתאימה של דילול.
- לייבל 24-לוחות עם שם וריכוז של המתחם ולשמור את הצלחות ב 28.5 ° c בחממה.
4. אנליזה פנוטימית והדמיה של העוברים באמצעות Stereomicroscope
- בחנו את העוברים תחת stereomicroscope לפרמטרים 24 שעות לאחר החשיפה לתרכובות הכימיות.
- שימו לב לפרמטרים כגון תמותה, בקיעה, פעימות לב, ניצול שק החלמון, פיתוח שלפוחית השתן, תנועת הדג, בצקת בקרום הלב וצורת הגוף23.
- קח את הזחלים חשופים לכל ריכוז של המתחם ולהניח אותם הצידה בצלחת פטרי קטנה המכילה 3% מטאלי מולקולרי גבוהה מתיל תאית באמצעות לווין מתכת.
הערה: 3% מתיל תאית (מולקולרי גבוה עם) הוא נוזל צמיגי הדרוש להטבעת הדג בכיוון הנדרש לבדיקה מיקרוסקופית. להגיית הדגים בנוזל זה יש צורך בגשוש מתכת. - קח את התמונות באמצעות stereomicroscope מחובר למצלמה. שמור את התמונות בתיקייה נפרדת כל יום עד סוף הניסוי.
- הזן את כל התצפיות בטבלה בכל יום או בטבלה מקוונת או בגיליון מודפס.
- אם תרכובות נוירוטוקסינות, 4 עד 5 הזחלים dpf עשוי להראות דפוס שונה לשחות, לעשות שיא של שינויים כאלה או על ידי לכידת קצר (30 s עד 1 דקות) וידאו של הזחלים המציגות דפוס תנועה נורמלית.
- לאחר 5 ימים של חשיפה לתרכובות הכימיות, שים לב לריכוז שבו מחצית העוברים מתים לחישוב הריכוז המקסימלי הקטלני 50 (LC50) של כל כימיקל.
הערה: LC50 הוא הריכוז שבו 50% מהעוברים מתים בסוף 5 ימים של חשיפה לתרכובת כימית. השתמש לפחות 20 עוברים לבדיקת רעילות של כל ריכוז של מתחם23. - בניית עיקול לתמותה של עוברים עבור כל הריכוזים באמצעות תוכנית מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החלק הקריטי של הערכת רעילות הוא בדיקת ריכוזים שונים של תרכובות כימיות אחד או מספר בניסוי אחד. בתחילת, בחר את תרכובות להערכת רעילות, מספר ריכוזי לבדוק כל תרכובת, ובהתאם, לעשות תרשים (איור 3). השתמשנו בצבע ייחודי לכל תרכובת כדי לארגן את הדגימות (איור 3). השימוש סמן עמידים ממס ותיוג בתחתית או בצדדים של לוחיות חשוב כדי למנוע בלבול מאוחר יותר. אם תרכובות לגרום לפגמים פנוטיתים של הזחלים חשופים ריכוזים שונים של מעכבי, פגמים נרשמים כל 24 שעות על פני תקופה של 1-5 dpf (איור 4A, B, C, D). העוברים שטופלו עם מעכב הידוע CA IX בריכוז של 500 μM לא הראו שום שינויים פנוטיתים גלויים לעין ב 1-5 ימים של חשיפה לתרכובת כימית (איור 4B). איור 4C ואיור 4c מראה את העוברים שטופלו עם מעכבי β-CA כי המושרה מומים פנוטיגים שונים מבלתי מקווקו העוברים אפילו ביום 3 (ראש החץ), מבנה גוף מעוקל (חץ), שק החלמון לא מנוצל בצקת לחייג (ראש החץ) והעדר שקי אוטוקיות בזחלים בחמישה ימים לאחר הטיפול בתרכובת כימית (חץ). במחקר אחר, העוברים שטופלו עם מעכבי CA (איור 4E) מראה את העדר שקי אוטולי ושלפוחית השתן לשחות (ראשי החצים). במחקר שלנו, (איור 4c, D), אנו תיעדו פגמים פנוטיריים (עוברים שבירים והעדר פיגמנטציה) גם לאחר יום 1 של חשיפה למעכבי CA. הבדיקות הפנוטיאיות הראו שחלק מתרכובות המעכב קטלניות ואינן יכולות להתפתח כתרופות לשימוש אנושי (איור 4C, D ושולחן 1).
הניסויים זיהו מתחם מייצג אשר המושרה מינימלי או לא שינויים פנוטיפקס במהלך פיתוח עובריים והראה מינון50 LC גבוהה (איור 5), הרומז כי המתחם הוא בטוח לאפיון נוסף יכול להיות מפותח לתוך מועמד לסמים לשימוש אנושי16. התבוננות בתמונות סטילס של זחלים שנחשפו למתחם לא הראתה פגמים פנופאריים (איור 4ב'). עם זאת, אותו תרכובת נמצאה להיות רעילים נוירואטקסיה המושרה בזחלים לאחר 5-ימים של חשיפה מעכב CA (איור 6). זה פנוטיפ יכול להתגלות רק על ידי התבוננות ישירה התנהגות השחייה של הזחלים דג זברה מתחת למיקרוסקופ. מחקרים אלה הציעו כי ההתפתחות העצבית של הזחלים דג זברה רגיש למתחם16,17.
איור 1: זמן בשעות הנדרש עבור הקרנה מהירה של תרכובות כימיות באמצעות עוברי דג דג זברה: בסדרה אחת של ניסויים, אדם עם ניסיון על הידיים יכול למסך כ 5 תרכובות כימיות (כל תרכובת הדורשת מינימום של 6 מדלל) באמצעות עוברי דגים בלוחות 24-טוב. בסך הכל, זה לוקח כ 8-10 h מן ההגדרה של צלבים לביצוע LC50 הנחישות על פני תקופה של 8 ימים.
איור 2: תרשים המציג את פירוק הערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הקרנת רעילות של תרכובות כימיות דורש 8 ימים, ניתן לשבור לתוך חמישה שלבים. (יום 1) מורכב הגדרת זוגות ההזדווגות של דגים בטנקים. (יום 2) כרוך באיסוף עוברים ממיכלי ההזדווגות לתוך מנות פטרי ולאחריה מחזיקים אותם באינקובטור של 28.5 ° c למשך הלילה. (יום 3) בחינת העוברים בstereomicroscope וניקוי העוברים. חלוקת העוברים לצלחות של 24 שעות והוספת הדילול של תרכובות הבדיקה. (יום 4-8) ניתוחים פנוטיתיים של. זחלים לפגמים התפתחותיים לשחות דפוס לימוד ו-LC50 החלטה בוצעה ביום האחרון של חשיפה לתרכובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הצגת סכמטית של ניסויים המעורבים בהערכת רעילות. הערכת רעילות כוללת הכנת תרשים טבחו המכיל מידע על תרכובות כימיות, דילול של תרכובות ופרמטרים כדי להעריך. הפיכת הדילול של פתרונות מניות לריכוזים הרצויים של 15 מנורות צנטריפוגה mL (הדילול מצינור אחד להתווסף לכל שורה של הצלחת 24-באר). צלחת 24-באר מסומנת עם סמן הוכחה מים עם שם מתחם הבדיקה, ריכוז בכל שורה, ותאריך של חשיפה. בדיקה והדמיה של עוברים על ידי העברת הזחלים על צלחת פטרי קטנה המכילה 3% משקל מולקולרי גבוהה מתיל תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמה לניתוח פנוטימית של הזחלים בשליטה ובדיקה של קבוצות טיפול מורכבות. (א) בדיקות פנוטיטיות של הזחלים של קבוצת הבקרה שלא טופלו בתרכובת כלשהי לא הראו פגם במיקרוסקופ. (ב) הזחלים שטופלו עם 500 μm מעכב-CA (המדכא הידוע של קרבהיט התשיעי מראה לא פגמים פנומין הראו. (ג, ד) הזחלים המתפתחים שטופלו עם β-CA מעכב עם ריכוזים של 250 μΜ ו 125 μM בהתאמה. תרכובות המושרה פגמים פנוטיניים כגון גוף מעוקל, בצקת ביטול הלב, שק חלמון לא מנוצל (חיצים וראשי חץ). לוחות A ו- B השתנו מתוך aspatwar ואח '16. לוחות C, D ו- E הצג תמונות שלא פורסמו בעבר, אשר הושגו באמצעות מיקרוסקופ אחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קביעת הריכוז הקטלני 50 (LC50) באמצעות 1-5 dpf הזחלים דג זברה. הערכת רעילות באמצעות עוברי דג זברה מאפשר לחוקרים לקבוע את הריכוז הקטלני המינימלי של התרכובת הכימית בסוף הניסוי. הריכוז LC50 של המתחם (מעכב CA IX ידוע) היה 3.5 mM. הריכוז הגבוה LC50 מאפשר אפיון נוסף של המתחם. דמות זו שונתה מ-Aspatwar ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמה לניתוח דוגמאות לשחיה בקבוצות של זחלים לא מטופלים (A) ומעכבי (B). הזחלים דג זברה התייחסו בלוח B עם 300 μm בדיקת מתחם מעכבי (מעכב ידוע של האדם הדו הדו הכימי התשיעי) הראה התנועה לא נורמלית (ataxic) דפוס (ראשי חץ), הרומז כי המתחם גורם רעילות נוירוהעוברים המתפתח . ראשי החץ מצביעים על העקמומיות הנורמלית של הזנב במהלך השחייה. בחלונית A החצים מצביעים על העקמומיות הרגילה של הזנב במהלך השחייה. דמות זו שונתה מ-Aspatwar ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מעכבי רשות אישורים (CA) | הקרנת רעילות | LC50 | בvivo | טלפונים רעילים | פניה |
| קרבמאטים | 24 | כל | 1א | 3ב | 24, לא פורסם |
| קוממנס | 10 | כל | - | 2 | שלא פורסמו |
| ניטרוגליצרין | 2 | כל | 2 | 2ג | 16 |
| סולפה | מיכל 5 | כל | - | 3 | 25 |
| כולל | 41 | כל | 3 | 10 | - |
| מהווה בהתבסס על הקרנת רעילות, המעכב שימש לעיכוב של פטרת מרנום במודל דג זברה. ב מדכא קטלני, cנוירורעיל מעל 300 μm ריכוז | |||||
טבלה 1: סיכום הבטיחות והרעילות של תרכובות הוקרן. ניסוי הערכת הרעילות מסייע לחוקר להגיע למסקנה על ביטחונם של תרכובות כימיות שנבדקו. הריכוז LC50 מאפשר להגדיר ריכוז בטוח לאפיון נוסף. חוקר יכול להחליט אם התרכובת קטלנית גם לאחר 24 שעות של חשיפה של עוברים למתחם בחקירה. בדוגמה שלנו, השפעה מעודנת על שחייה בשל רעילות נוירו היא המידע המשמעותי, אשר מועיל להקמת ניסויים נוספים. לפיכך, מבוסס על הקרנת רעילות, הצלחנו להשתמש בריכוזים בטוחים של מעכב CA לאפיון נוסף ב vivo24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במבחן רעילות מחוץ לבית באמצעות תאים מתורבתים יכול לזהות הישרדות מחקרים מורפולוגיים של התאים מתן מידע מוגבל על רעילות הנגרמת על ידי מתחם הבדיקה. היתרון של הקרנת רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי דג זברה הוא גילוי מהיר של שינויים המושרה בכימיקלים פנוטיפקס בעלי חיים שלמים במהלך התפתחות עובריים באורגניזם מודל רלוונטי. כ 70% של חלבונים-קידוד הגנים האנושיים יש אורתולוגים עמיתיהם הגנום דג זברה25. מסלולים גנטיים שליטה התמרה האות ופיתוח הם שנשמרים במידה רבה בין בני אדם ו-דג זברה26, ולכן, תרכובות כימיות צפויים להיות השפעות רעילות דומה בבני אדם25.
Zebrafish נמצאים בחזית של מחקר רעלים והוא כבר שימשו באופן נרחב כדי לזהות רעלים בדגימות מים ללמוד את מנגנון הפעולה של רעלים סביבתיים ואת ההשפעות שלהם על החיה27. במאמר זה, אנו מראים את השימוש בפיתוח עוברי דגים כדי להעריך את רעילות של תרכובות פוטנציאליות בשלב מוקדם של גילוי הסמים. הערכת הרעילות המהירה והרב שלנו מבוססת על 1 שינויים בפנוטיפ של האורגניזם (בקיעה, שקיות אוטואולית, בצקת בדיקת קרום הלב, שימוש בשק החלמון, פיתוח נוטואקורד, פעימות לב, שחייה פיתוח שלפוחית השתן, תנועה) במהלך העובריים פיתוח לאורך תקופה של 5 ימים, ו 2) קביעת הריכוז הקטלני (LC50). שעות סבירות של הידיים על העבודה (8-10 h מחולק על 8 ימים) הוא מספיק כדי לקבוע את פרופיל רעילות של תרכובת באמצעות הליך זה. עבור תרכובות חדשות מסונתז הזמינות בכמויות מוגבלות, רעילות ניתן להעריך באמצעות מינימום של 3 מ ג של המתחם. אין צורך בציוד מיוחד. הנוהל הוא, לפיכך, דרך מהירה וזולה להעריך את ההשפעות הרעילות של כל תרכובת שעלולה להתפתח לתרופה לשימוש אנושי.
לאיכות הקבוצה של העוברים יש השפעה רבה על תוצאות הניסוי. איכות הביצים (כולל שיעור ההפריה) אינה ברורה מיד לאחר איסוף מכלי הרבייה (0-4 hpf). לקבלת רק בדרך כלל לפתח עוברים לניסויים, לפני הוספת תרכובות, אנו מאפשרים לעוברים להישאר ב 28.5 ° c עבור 24 שעות לאחר איסוף ממיכלי הרבייה. לאחר 24 hpf, כל העוברים מתים או לא בריאים נמחקים. בנוסף לכך, מומלץ להיות קבוצה מתייחסת מבוים של עוברים בכל ניסוי כדי לשלוט באיכות של אצווה של הביצים המשמשות את הניסוי, כמו גם לראות את התמותה בסיסית כדי לקבוע במדויק LC50.
קבוצה מטופלת מבוים נדרשת גם כדי לשלוט על רעילות של רכב הבחירה. כימיקלים רבים אינם מסיסים במים, DMSO משמש לעתים קרובות כרכב להעברת תרכובות הבדיקה. DMSO הוא בדרך כלל נסבל היטב על ידי העוברים נמוך (0.1%) ריכוזים28. לפעמים, תרכובות אינן מסיסים לחלוטין גם ב DMSO והפתרון מופיע מעונן ומקשה על הערכת הרעילות. במקרים כאלה, כדי לקבל את הפתרון המניות של המתחם מסיסים לחלוטין וברור, הוספת טיפה של 0.1% NaOH יפתור את הבעיה. יש להגדיר קבוצות שליטה מתאימות להערכת הרעילות של המתחם במדויק. אם נעשה שימוש בכלי רכב אחרים, הרעילות הטבועה בהם עלולה להשפיע על הניסוי.
כל טוב של צלחת 24-באר מכיל 1-10 עוברים שקוע בנפח כולל של 1 mL. אם מתחם הבדיקה זמין רק בכמויות קטנות, ייתכן שיהיה צורך להשתמש עד 10 עוברים לכל טוב להערכת הרעילות שלה. מומלץ מאוד כי רק אחד העובר בכל טוב צריך לשמש עבור כל ניתוח16,24,29. הלוחית מאוחסנת ב-28.5 מעלות בחממה במשך 5 ימים. לפעמים התאיידות משמעותית נצפה גורם שינוי מסומן בריכוז של המתחם בבאר נתון16. על ידי איטום הצלחות 24-היטב עם סרטי פרפין מכל הכיוונים, הצבת עוברים רק בבארות הביניים ומילוי בארות אחרות לאורך החישוקים עם מים, הבעיות הנגרמות על ידי התאיידות ניתן להימנע. במחקרים המוקדמים ביותר שלנו, לא התבוננו כל אידוי של דילול של הכימיקלים מ 24-טוב צלחות24,29. כמו כן, אם התרכובת המדוברת ידועה כבלתי יציבה בטמפרטורות הסביבה, השינויים היומיים של מים עם תרכובת טרייה יהיו נחוצים לתוצאות אמינות.
תבנית השחיה של הזחלים של הזברפיש מנותח לאחר 5 ימי החשיפה למתחם. הבארות של צלחת 24-היטב המכילה 5 הזחלים dpf אינם אידיאליים למטרה בשל הגודל המוגבל של הבאר. לכן, לניתוח מדויק של תבנית השחיה, יש להעביר את הזחלים לצלחת פטרי המכילה 50 מ ל של E3 מים ולהסתפק ב -2 דקות לפני הניתוח. במחקר שלנו, רק שני מעכבי הראו את ההשפעה על לשחות תבנית16 בין 52 α-ca ו-β-ca מעכבי הוקרן לבטיחות רעילות, מבוסס על הניסיון שלנו בדיקה זו יכולה לזהות שינויים עדינים כולל תנועה ataxic קלה של הזחלים.
מחקר זה הוכיח כי המגבלה היחידה לשיטה הנוכחית היא מיומנות פיזית. דאגה זו יכולה להיות להתגבר באמצעות חזרה, כמו המיומנות של אדם משתפר עם תרגול. לאחר המומחיות מושגת הערכה של תרכובות באמצעות העוברים דג זברה הוא אתי, קל, יעיל אינפורמטיבי. אנו, לפיכך, מצפים כי כזה בדיקה מהירה באמצעות עוברי בדגים יהיה כלי פופולרי עבור הקרנת רעילות vivo בשלב מוקדם של פיתוח התרופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא דיווחו על ניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
Acknowledgments
העבודה היה נתמך על ידי מענקים Sigrid Juselius קרן (SP, MP), בקרן התרבות הפינית (AA, MH), האקדמיה של פינלנד (SP, MP), אוריון Farmos קרן (MH), שחפת טמפרה קרן (SP, MH ו-MP) וג ואטוס Erkko קרן (SP ו-MP ). אנו מודים למשתפי-הפעולה האיטלקיים והצרפתיים שלנו, פרופ ' סופורו ופרופ ' וינר, למתן מעכבי אנהיהידרסה בתחום הבטיחות והרעילות למטרות אנטי-TB ופיתוח תרופות נגד סרטן. אנו מודים לאויקקי להמן ולמריאן Kuuslahti על הסיוע הטכני. אנו מודים גם ללינה מנדיסן והאנניאנה פיפו על עזרתם בגידול הדגים ובאיסוף העוברים. בכנות, אנו מודים להארלן בארקר על הערכה קריטית של כתב היד והערות תובנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
