Summary
Здесь, мы представляем протокол для производства растворимых в воде рекомбинантные паук шелка белка решений и материальных форм, которые могут быть сформированы из этих решений.
Abstract
Многие пауки производят семь типов шелка. Шесть из шелка волокна в форме, когда производится пауков. Эти волокна не растворяются в воде. Для того, чтобы воспроизвести замечательные механические свойства паука шелка, они должны быть произведены в гетерологичных хостов, как пауки и территориальных и людоедских. Синтетические аналоги паучьего шелка также имеют тенденцию быть неразрешимыми в водных растворах. Таким образом, большой процент исследований в рекомбинантного паука шелка полагаться на органические растворители, которые наносят ущерб крупномасштабное производство материалов. Метод нашей группы принуждает к золу этих рекомбинантных пауков шелка в воду. Примечательно, что когда эти белки готовятся с помощью этого метода нагрева и давления, можно подготовить широкий спектр материальных форм из одного и того же раствора рекомбинантных белков паука (Рссг), в том числе: пленки, волокна, Губка, гидрогель, лиогель и клей. Эта статья демонстрирует производство сольно-СПО и материальных форм таким образом, что легче понять, чем из письменных материалов и методов в одиночку.
Introduction
Паук шелка получил интерес материальных ученых за их впечатляющее сочетание прочности, эластичности и биосовместимости. Воссоздание волокон традиционно является направлением исследований. Это усилие было затруднено Рекомбинантный белок паука шелка (Рссв) нерастворимость в воде, а также неспособность традиционных методов солевой (хаотического агентов и моющих средств) для достижения водного солнцестояния. Кроме того, методы, разработанные для разсолеющих версий рссг, не работают на всех вариантах рссг, а также требуют существенных манипуляций и времени, что часто приводит к потере белка1,2. В значительной степени это привело к использованию месторождения 1, 1, 1, 3, 3, 3-гексафлуороизопропанол в качестве растворителя, из которого образуются волокна и другие ограниченные материальные формы. Преимуществом является то, что все известные Рссг растворяются в ХМПООН, обеспечивая единообразие данных между каждой исследовательской группой. Недостатком является то, что ХМПООН является токсичным растворителем, который является дорогостоящим и нецелесообразным в масштабе из-за проблем со здоровьем и экологические соображения.
Был разработан новаторский подход к сольвенции РССС, который преодолен технологический разрыв между суровым органическим растворителем и другими методами, которые выборочно работали на сольвенцию рссв. Сочетание конкретных нагрюет и давлений было применено к суспензии Рссв и воды. Результаты были около 100% сольции и восстановления Рссв, а также концентрации высоких белков; различные формы материалов были определены, чтобы быть возможным из этих формулировок, которые не были все достижимы с помощью хмпо или других органических растворителей3,4,5,6. Цель этого подхода состоит в том, чтобы эффективно и легко солить очищенный и высушенный Рекомбинантный белок паука в некоем растворе, который затем может быть использован для производства различных материальных форм.
Волокна, пленки, покрытия, клеи, гидрогели, лиогели, микросферы и губчатые материалы легко осуществимым с помощью этого метода. Продолжение эволюции этого метода, не только с дополнительными Рссг, но с другими белками, может привести к новым формам материала и альтернативного очищения белка и солебилизации проспектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рекомбинантный паук шелковая смесь подготовки из лиофилизированных запасов белка
- Определите необходимую формулировку и объем, необходимые для предназначенных для этого материальных формаций. Типичные формулировки варьируются от 3% (w/v) до 15% (w/v). Используя этот выбор, вычислите соответствующие Рссв, концентрации и коэффициенты.
- Используйте следующие соответствующие формулировки для подготовки каждого материала, описанного в этом протоколе: гидрогели/губки/лиогели, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; пленки/покрытия, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; клей, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; волокна, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
Примечание: Несмотря на то, что большинство составов лучше приспособлены для конкретных форм и материалов, существует широкий диапазон формулировок, которые часто могут пересекаться. Кроме того, окончательные материалы Рссг также могут быть адаптированы во время формирования и обработки для получения желаемых свойств. Как правило, каждый белок потребует расследования в соответствующие или полезные параметры.
- Используйте следующие соответствующие формулировки для подготовки каждого материала, описанного в этом протоколе: гидрогели/губки/лиогели, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; пленки/покрытия, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; клей, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; волокна, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
- Выберите чистый и новый 8 мл autoclavable боросиликатного стекла культуры флакон с резиновой облицованная винт крышкой.
- Снимите крышку и поместите пустую ампулу на аналитический баланс. Тара Масса пустой флакон так, что баланс читает нулевой массы.
- Добавить желаемый лиофилизированный порошок Рссн в пустой флакон для каждого конкретного материала.
- Использование этих специфических масс каждого белка типа для каждого материала, при подготовке 2 мл раствора: гидрогели/губки/lyogels, 60 mg MaSp1 и 60 mg MaSp2; пленки/покрытия, 80 mg MaSp1 и 20 mg MaSp2; клей, 120 мг MaSp1 и 120 мг MaSp2; волокна, 200 mg MaSp1 и 50 mg MaSp2.
- Добавьте нужное количество ультраапертуры воды, не менее 2 мл, в флакон, который уже содержит взвешенные Рссг порошки.
Примечание: минимальный объем 2 мл рекомендуется для всех процедур по Солу. - Печать флакон крышкой и быстро вихрь содержимое для создания дисперсных и однородных, Рссг смесь, которая в настоящее время готова к процедуре солнцестояния. Дополнительные подходы гомогенизации, такие как ультразвука или Смесители для перемешивания можно использовать с, или, Кроме того, вихревое перемешивание.
2. рекомбинантный паук шелка
ВНИМАНИЕ: высокие температуры и давление генерируются во время процедуры солнцестояния. Для этого процесса необходимы надлежащие средства индивидуальной защиты, особенно защитные очки, длинные рукава и перчатки для термостойкой.
- Выполните окончательную проверку флакона, или сосуд, колпачок, чтобы убедиться, что он был твердо и надежно затянуты. Затем перенести приостановило смесь Рссв в обычную микроволновую печь.
Примечание: микроволновые блоки в диапазоне мощности от 700 до 1 500 Вт, обладая меньшими внутренними камерные емкости, и вращающиеся платформы рекомендуются для обеспечения более совершенных условий солнцестояния. - Начало работы микроволновой печи с всплесками 5 s на полную мощность. После каждого всплеска кратко открыть дверь и тщательно перемешать/вихрем флакон для предотвращения урегулирования и поддержания взвешенных смеси.
- Повторите эту микроволновой процесс, пока смесь и/или раствор не получил температуру не менее 130 ° c, при измерении с инфракрасным термометром непосредственно против раствора, содержащего части флакон. Повторите этот процесс, пока все твердые частицы были полностью растворены и больше не видны.
Примечание: это предложил, чтобы флакон и раствор для охлаждения время от времени, особенно если формулировка имеет высокую концентрацию Рссв настоящее время. Температура, превышающая 200 °C, повышает риск отказа от уплотнения флакона. Особое внимание также должно быть дано, чтобы предотвратить перегретую смесь/раствор от прикосновения к уплотнением, которое также приведет к провалу сдерживания флакона. - После успешного солекации смеси Рссг в раствор позволяют температура раствора и флакон крышка для охлаждения ниже 100 ° c (точка кипения) перед открытием.
3. гидрогели
- Подготовьте Гидрогель от раствора после извлечения его из микроволновой печи и позволяет ему остыть и установить. Литые Гидрогель в конкретных геометриях до позволяя ему полностью остыть.
Примечание: для перехода на Гидрогель для различных Рсспс потребуется различное количество раз. Например, MaSp2-подобные последовательности, как правило, образуют гидрогели быстрее по сравнению с MaSp1-подобных последовательностей. Концентрация белка, соленость и рН также непосредственно влияют на скорость перехода к гидрогелю.
4. губки
- Подготовьте губки Рссв, сначала позволив первично разсоленный раствор сформировать Гидрогель.
- Поместите Гидрогель в водяной бане, поместите эту ванну в морозильную камеру при температуре-20 ° c, и ждать, пока Ванна полностью заморожена.
- Завершите процесс формирования губки путем удаления замороженного гидрогеля и водяной ванны из морозильной камеры и оттаивания при температуре 25 °C. Результирующая Губка теперь может быть удалена из талой воды.
5. lyogel
- Подготовьте лиогел, непосредственно замораживая сформированный гидрогель, либо с водяной бане, либо без нее, и перенося замороженный образец гидрогеля на лиофилизатор (сушилка для замораживания).
- Удалите окончательный Лиофилизированный гель из материала сосуда, в котором произошла сублимация влаги.
6. пленки и покрытия
- Используйте один из трех следующих методов: литье решений, распыление раствора или погружные покрытия для производства пленок или покрытий Рссг.
- Литые растворимое шелковое раствор в/на формы PDF желаемой формы.
- Залить и распространить 200 МКН пленки решения и дать этому высохнуть перед пилинг их от субстрата PDF-файлов для тестирования или лечения.
- После позволяет высохнуть, удалить сформированные пленки для механического тестирования или после лечения фильмов для улучшения механических свойств.
- Чтобы подготовить покрытие, или фильм, который не может быть удален из подложки, использовать либо спрей или окунать покрытие для получения тонкого слоя пленки.
Примечание: для распыления пальто, этот протокол нашел успех с мастером аэрографом краска опрыскиватель.- Сформируйте погруёное покрытие, просто погрузив субстрат выбора в растворимое Рссв и повторите после высыхания, чтобы достичь желаемой толщины.
- Выполните первоначальный спрей пальто перед нанесением погружения пальто для повышения согласованности и эффективности конечного покрытия.
7. клей
Примечание: формирование клея достигается через один из следующих методов.
- Непосредственно добавьте растворенное Рссв на подложку и затем нанесите второй субстрат поверх раствора. Плотно зажать куски вместе, а затем высушить образцы в духовке с минимальной температурой 25 ° c, по крайней мере 16 ч.
- Альтернативно, распылите 2 поверхности субстрата с покрытием брызга и после этого зажать субстраты совместно.
- Применение Рссв через провал метод покрытия субстратов и прилипания субстратов также может быть использован для подготовки и клей.
8. влажные-закрученный волокна
- Загрузите растворенное решение допинг в концентрические шприцев с наконечником Luer-Лок через 19 G скользкой иглой. Извлекаем воздушные пузыри, и пусть допинг сидеть на Луэр-Лок конце шприца.
- Вставьте по крайней мере 25 мм пик трубки, внутренний диаметр 0,01 дюйма, в один-кусок пальца трубки быстрый тюбинговые жесткие фитинги для 1/16 дюйма OD и 10/32 конуса. Прикрепите это фитинг к трубке быстрого подключения к женский адаптер Luer-Лок.
- Замените 19 игл калибра с этим набором на загруженный шприц.
- Заполните высокую, чистую стеклянную ванну с 99% чистого изопропанола для использования для коагуляционной ванны.
- Заполните стрейч ванны, расположенные ниже стрейч гоец. Они будут иметь 80:20 изопролинол: дистиллированную воду в первой ванне стрейч, и 20:80 изопропанол: дистиллированной воды во второй ванне стрейч.
- Установить годе стрейч системы, что первый годе после ванны свертывания и первый годе в первой ванне стрейч вращаются с той же скоростью.
- Инициировать первый участок, регулируя скорость окончательного годе в ванне стрейч 1, средний верхний годе, и первый годе в стрейч ванна 2 на той же скорости. Эта скорость будет 2x так быстро, как начальная скорость удаления волокна.
- Инициировать второй участок путем корректировки скоростей окончательного годе в стрейч ванна 2, последний верхний годе, и намотки с той же скоростью. Эта скорость будет 2x так быстро, как скорость, используемая для первого участка или 4X начальной скорости удаления волокон.
- Поместите нитриловые перчатки на внешней стороне промежуточных годец, чтобы сохранить волокно от скольжения.
- Начните медленно выдавде раствор в ванну свертываемости. В автоматизированной системе устанавливается скорость экструзии, которая соответствует скорости удаления 10 мм/с.
- Разрешить экструзии волокна, чтобы стать равномерным, прежде чем вытягивать волокна из ванны, используя тонкий металлический крюк или щипцы. Проверьте удаление волокна из ванны создали петлю между наконечником трубки пик и путь волокна оставляя ванну ванну.
- Руководство извлекаются волокна через ряд годец, такие, что волокно погружен в ванны стрейч, но сушки в воздухе между стрейч ванны и, прежде чем на катушку. Эта сушка достигается за счет более высоких размещенных промежуточных Годей.
Примечание: скорость удаления волокна и/или экструзии ставка должна быть скорректирована на основе концентрации белка, добавок и белка типа, чтобы достаточное время свертывания без объединения волокон в нижней части ванны свертываемости. - Прикрепите полностью растянутую клетчатку к катушке на механизме намотки с помощью ленты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Из описанного метода солилизации Рссг можно достичь различных материальных форм, как видно на рисунке 1. Метод соленизации заключается в применении тепла и давления, генерируемого обычной микроволновой печью, для суспензии Рссг и воды. При критических температурах и давлениях достигается, белок будет растворе. Из этого растворимое решение Рссв, необходимые условия представляются для семи материальных форм: гидрогели, lyogels, Губка, клей, покрытий, пленок и волокон. Гидрогели готовятся, позволяя растворимой Рссв охладелать и естественно самоассоциировать. Lyogel готовят с помощью лиофилизации гидрогеля. Губчатый материал образуется при замораживании гидрогеля во время его погружения в воду. Фильмы могут быть подготовлены путем литья растворимой РССР на поверхности PDF (и других поддаются поверхностей) и сушеные. PDF-файлы позволяет снимать пленку для обработки после лечения или анализа. Покрытия и клея генерируются с использованием либо спрей или провал методы или комбинации спрей и провал. Волокна требуют наиболее обширной обработки экпрессинг в ванну свертываемости, а затем последовательно растяжения сырья волокна в пост-спин стрейч ванны. Волокна могут быть получены путем экпрессования в ванну свертываемости самостоятельно. Однако, лучшие механические способности в волокне требует растяжения в пост-спин стрейч ванны3,7,8,9.
Рисунок 1: материалы для сольной и Рсск. Репрезентативные фотографии материалов, которые были сформулированы с использованием этого метода растворизации тепла и давления с помощью Рссв растворенный в воде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После того как рекомбинантные протеины шелка паука очищаются они должны после этого быть подготовлены в разрешении которое можно использовать для образования материала. Путем смешивания лиофилизированный белок паука шелка с водой и подвергая эту смесь микроволнового облучения, чтобы генерировать тепло и давление, это возможно, чтобы подготовить решение Rspp's. Из этого простого и эффективного метода рассоления Рссн может быть произведено большое разнообразие материальных форм. Каждый материал должен быть однозначно подготовлен и обработан для достижения желаемого результата и свойств. При незначительных изменениях исходных формулировок, условиях формирования и/или параметров обработки каждый материал может быть легко скорректирован с помощью этого метода. Есть больше форм, чем представленные здесь, и через дальнейшие исследования других в этой области, эти материалы будут продолжать развиваться, чтобы исследовать новые формы материала с помощью этой техники.
При условии, что решение состоит в основном из воды и белка (добавки могут быть использованы для задержки гелации и повышения стабильности решений) возможность функционализации с биологически активными компонентами значительно улучшена в сравнению с решениями, основанными на ГМПО. Различные компоненты, но не исчерпывающие сэмплинги были включены в дозаторы и, следовательно, материальные формы, включая: антибиотики, противоклеточные, гепарин, наночастицы серебра и интеглины для клеточной адгезии. В дополнение к добавок, несколько рекомбинантных паучьего шелка белки различных размеров, последовательности, природы, и источники были успешно сольен с этим методом и используется в формировании материалов, описанных в этом протоколе.
Дальнейшее расширение полезности этого метода растворимости для не только Рссг, но и всех белков, растворенный в этом методе, заключается в том, что растворы стерильны при условии, что температура и давление внутри сосуда или камеры достаточно высоки. Эти решения могут быть и были приняты непосредственно к клеточной культуры без загрязнения культур.
Если эти материалы должны быть приняты непосредственно в в системах естественных условиях, эндотоксин уровнях должны быть решены. Тройной метод автоклава, который разрушает эндотоксины, так что их уровни находятся на, или ниже, рекомендуемый 0,25 EU/mL недавно сообщалось10. В то время как автоклав полезен для уничтожения эндотоксина, его давление и температура обычно не достигают критической температуры или давления, необходимого, чтобы полностью солить все образцы Рссг, пытавшихся на сегодняшний день6. Это обусловливает необходимость микроволновой печи или реактора температуры/давления, необходимого для завершения солнцестояния.
Однозначно, удаление эндотоксина и отмены материала с использованием тепла и давления не ухудшает белок или механическую способность результирующей материальной формы4,5,6,7. Оно оценено что правоподобно наклоняя пункт получать слишком высокое давления и/или температуры и слишком много циклов жары и давления которое приводит к в ухудшенного механически способности and/or разрушении протеина. Этот переломный момент, скорее всего, будет варьироваться в зависимости от типа сссг, и, в некоторой степени, от длительности использования Рссг. Однако, с помощью этого базового метода солений, некоторые эксперименты по сольной разведке могут выполняться в короткие сроки, чтобы очертить соответствующую температуру и давление, необходимые для специфических белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы с благодарностью признать, финансирование от Юта науки и технологии исследований (USTAR) инициативу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
