היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מסיסים במים רקומביננטי עכביש משי פתרונות חלבון וצורות חומרים שניתן ליצור מאותם פתרונות.

Abstract

עכבישים רבים מייצרים. שבעה סוגי משי שישה מבדי המשי הם סיבים בצורה כאשר מופק על ידי העכבישים. הסיבים האלה אינם מסיסים במים. על מנת לשכפל את תכונות מכני יוצא דופן של משי עכביש, הם חייבים להיות מיוצר הטרוולוגי מארחים כמו עכבישים הם טריטוריאליים ו קניבאלי. האנלוגיות הסינתטית של משי העכביש נוטות גם הם להיות מסיסים בפתרונות מימית. כך, אחוז גדול של מחקר בדי משי רקומביננטי עכביש להסתמך על ממיסים אורגניים כי הם מזיקים ייצור בקנה מידה גדול של חומרים. שיטת הקבוצה שלנו מאלצת את הרקומביננטי של משי העכביש למים. באופן מדהים, כאשר חלבונים אלה מוכנים באמצעות שיטה זו של חום ולחץ, מגוון רחב של צורות חומר ניתן להכין מאותו פתרון של חלבונים משי רקומביננטי עכביש (rSSp) כולל: סרטים, סיבים, ספוג, הידרוג'ל, lyogel, ו דבקים. מאמר זה מדגים את הייצור של rSSp וצורות חומרים באופן שניתן להבינו בקלות רבה יותר מאשר חומרים כתובים ושיטות בלבד.

Introduction

משי עכביש צברה לטובת מדענים חומריים על השילוב המרשים שלהם של חוזק, אלסטיות, ו biocompatibility. משחזר סיבים היתה באופן מסורתי הדחף של המחקר. מאמץ זה הושפע חלבון רקומביננטי עכביש משי (rSSp) חוסר מסיסות במים, כמו גם חוסר יכולת של טכניקות שימור מסורתי (סוכנים chaotropic וחומרי ניקוי) כדי להשיג שימור מימית. עוד, טכניקות שפותחו עבור גירסאות solvating של rssp לא לעבוד על כל משתני rssp וגם דורשים מניפולציה משמעותית זמן שלעיתים קרובות תוצאות אובדן חלבון^1,2. זה הביא בעיקר בתחום ניצול 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroגנול (HFIP) כממס שממנו ליצור סיבים, וצורות חומרים מוגבלים אחרים. היתרון הוא כי כל rSSp ידוע מסיסים ב HFIP, מתן אחידות נתונים בין כל קבוצת מחקר. החיסרון הוא כי HFIP היא הממס הרעיל כי הוא יקר ומעשי לקנה מידה עקב חששות בריאותיים ושיקולים סביבתיים.

הגישה הרומן של rSSp שימור פותחה כי גישור את הפער הטכנולוגי בין הממס האורגני הקשה HFIP וטכניקות אחרות שעבדו באופן סלקטיבי עבור rSSp שימור. השילוב של מחמם ולחצים ספציפיים הוחל על השעיות של rSSp ומים. התוצאות היו בקרבת 100% שימור והתאוששות של rSSp, כמו גם ריכוזי חלבונים גבוהים; מגוון של צורות חומרים היו נחושים להיות אפשריים מניסוחים אלה שלא היו כל השגה באמצעות hfip או ממיסים אורגניים אחרים^3,4,5,6. המטרה של גישה זו היא ביעילות ובקלות מסיסות מטוהרים ומיובשים רקומביננטי spider חלבונים בפתרון מימית כי יכול להיות מנוצל לייצור של מגוון צורות חומרים.

סיבים, סרטים, ציפויים, דבקים, הידרוג'לים, lyogels, microspheres, וחומרי ספוג הם כל בקלות accomplishable מתוך הפתרון rSSp מימית אותו באמצעות שיטה זו. המשך האבולוציה של שיטה זו, לא רק עם rSSp נוספים אלא עם חלבונים אחרים, יכול להוביל לצורות חומר חדשות ולטיהור חלבון אלטרנטיבי ושדרות מסיסות.

Protocol

1. רקומביננטי עכביש הכנה תערובת מתוך מניות חלבון ליאופ,

1. לקבוע את הניסוח הדרוש ונפח הנדרש עבור תצורות חומרים מיועדים. מגוון ניסוחים טיפוסיים מ-3% (w/v) עד 15% (w/v). באמצעות בחירה זו, חשב את ה-rSSp, הריכוזים והיחס המתאימים.
   1. השתמש בניסוחים המתאימים הבאים כדי להכין כל חומר המתואר בפרוטוקול זה: hydrogels/ספוגים/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; סרטים/ציפויים, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; דבקים, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; סיבים, 12.5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      הערה: למרות שרוב הניסוחים מצוידים טוב יותר עבור טפסים וחומרים ספציפיים, יש מגוון רחב של ניסוחים שיכולים לעתים קרובות חפיפה. בנוסף, ניתן להתאים את חומרי ה-rSSp הסופיים גם במהלך היווצרות ועיבוד כדי להפיק את המאפיינים הרצויים. באופן כללי, כל חלבון ידרוש חקירה בפרמטרים מתאימים או שימושיים.
2. בחר בבקבוקון נקי וחדש של 8 מ ל, בקבוקון של תרבות זכוכית סיליקט עם כובע גומי מרופד.
3. הסר את המכסה ומניחים את הבקבוקון הריק על איזון אנליטי. מסרק את המסה של הבקבוקון הריק כך שהאיזון יקרא מסה אפס.
4. הוסיפו את אבקת ה-Ssp הרצויה לבקבוקון הריק עבור כל חומר ספציפי.
   1. השתמש אלה מיסות ספציפיות של כל סוג חלבון עבור כל חומר, בעת הכנת 2 מ ל של פתרון: הידרוג'לים/ספוגים/lyogels, 60 mg של MaSp1 ו 60 mg של MaSp2; סרטים/ציפויים, 80 מ ג של MaSp1 ו -20 מ"ג של MaSp2; דבקים, 120 מ ג של MaSp1 ו 120 mg של MaSp2; סיבים, 200 מ ג של MaSp1 ו 50 mg של MaSp2.
5. הוסף את הכמות הרצויה של מים באולטרטהורים, לפחות 2 מ ל, לבקבוקון שכבר מכיל את אבקות rSSp משוקלל.
   הערה: כמות מינימלית של 2 מ"ל מומלצת לכל תהליכי השיבציה.
6. אטום את כובע המבחנה ומערבולת בזריזות את התוכן כדי ליצור תערובת מפוזרת, ו הומוגנית, rSSp, כי הוא כעת מוכן הליך שימור. גישות הומוקות נוספות כגון ערבוב sonication או מדחף יכול להיות מועסק עם, או בנוסף, מערבולת ערבוב.

2. רקומביננטי עכביש משי שימור

התראה: מחמם ולחצים גבוהים נוצרים במהלך תהליך הטיפול הסולארי. ציוד הגנה אישי נאות, בעיקר משקפי מגן, שרוולים ארוכים וכפפות עמידות בחום נדרשים לתהליך זה.

1. לבצע בדיקה סופית של המבחנה, או כלי, כובע כדי להבטיח כי היה הידק בחוזקה ובבטחה. ואז להעביר את התערובת rSSp מושעה לתנור מיקרוגל קונבנציונלי.
   הערה: יחידות מיקרוגל בטווח הכוח של 700 עד 1,500 וואט, בעל קיבולות פנימיות קטנות יותר, ופלטפורמות מסתובבות מומלץ לספק תנאי שימור טובים יותר.
2. התחל פעולת המיקרוגל עם התפרצויות של 5 s במלוא העוצמה. אחרי כל התפרצות לפתוח בקצרה את הדלת בזהירות לערבב/מערבולת הבקבוקון כדי למנוע להתיישב ולשמור על התערובת מושעה.
3. חזור על תהליך המיקרוגל עד שהתערובת ו/או התמיסה השיגו טמפרטורה של לפחות 130 ° c, כאשר נמדד עם מדחום אינפרא אדום ישירות כנגד הפתרון המכיל חלקים מהבקבוקון. חזור על תהליך זה עד שכל החלקיקים המוצקים התפרקה לחלוטין ואינם גלויים עוד.
   הערה: הוא הציע לאפשר את המבחנה ואת הפתרון קריר מדי פעם, במיוחד אם הניסוח יש ריכוז גבוה של rSSp הנוכחי. הטמפרטורות מעל 200 ° צ' מגדילות את הסיכון לכשל במבחנה. תשומת לב מיוחדת חייבת להינתן גם כדי למנוע את התערובת המחוממת/פתרון מלגעת בחותם, אשר תגרום גם לכשל בבלימה של בקבוקון.
4. לאחר בהצלחה solvating תערובת rSSp לתוך פתרון לאפשר את הטמפרטורה של הפתרון ואת כובע המבחנה להתקרר מתחת 100 ° צ' (נקודת רתיחה) לפני הפתיחה.

3. הידרו-ג'ל

1. הכינו הידרוג'ל מהפתרון לאחר הסרתם מהמייקרוגל והתרת האפשרות לקרירות ולהגדרה. השליכו את ההידרוג'ל לתוך גיאומטריות מסוימות לפני שהוא מאפשר לו להתקרר באופן מלא.
   הערה: rSSps שונה ידרוש כמויות מגוונות של פעמים למעבר להידרוג'ל. לדוגמה, רצפים כמו MaSp2 נוטים ליצור הידרוג'ל במהירות רבה יותר בהשוואה לרצפים כמו MaSp1. ריכוזי חלבון, מליחות ו-pH משפיעים גם ישירות על שיעור המעבר להידרוג'ל.

4. ספוגים

1. להכין ספוגים rSSp על ידי לראשונה לאפשר את הפתרון הראשוני ליצור הידרוג'ל.
2. מניחים את ההידרוג'ל באמבט מים, מניחים את האמבט במקפיא ב-20 ° c, ומחכים עד שהאמבטיה קפואה לחלוטין.
3. השלימו את תהליך היווצרות הספוג על-ידי הסרת ההידרוג'ל הקפוא ומרחץ המים מהמקפיא והיפנפו ב -25 ° c. הספוג העשוי כעת ניתן להסירו מן המים המופשרים.

5. ליאוג'ל

1. הכן rSSp ליאוג'ל על ידי הקפאת הידרוג'ל באופן ישיר, עם או בלי אמבט מים, והעברת דגימת הידרוג'ל קפואה לליאופליזר (הקפאת מייבש).
2. הסירו את החומר הסופי ג'ל מהספינה כי סובלימציה הלחות התרחשה.

6. סרטים וציפויים

1. השתמש באחת משלוש השיטות הבאות: יציקת תמיסה, ריסוס פתרונות או ציפוי מטבל להפקת סרטים או ציפויים של rSSp.
   1. השליכו את פתרון המשי מסיסות לתוך/אל צורות PDMS של הצורה הרצויה.
   2. יוצקים ולהפיץ 200 μL של פתרון הסרט ולאפשר זאת להתייבש לפני לקלף אותם מתוך המצע PDMS לבדיקה או טיפול.
   3. לאחר שאפשר אלה יבשים, להסיר את הסרטים הקימו לבדיקה מכנית או לאחר לטפל בסרטים כדי לשפר את התכונות המכאניות.
2. כדי להכין ציפוי, או סרט שלא ניתן להסירו מהמצע, השתמשו בתרסיס או בציפוי טבילה כדי ליצור שכבת סרט דקה.
   הערה: כדי לרסס מעיל, פרוטוקול זה מצא הצלחה עם מרסס מאסטר airbrush צביעה מודל.
   1. ליצור ציפוי לטבול על ידי פשוט שוקע יזוג המצע של בחירה אל מסיסות rssp ולחזור לאחר ייבוש כדי להשיג את העובי הרצוי.
   2. לבצע מעיל תרסיס הראשונית לפני החלת מעיל לטבול כדי להגדיל את העקביות ואת האפקטיביות של הציפוי הסופי.

7. דבקים

הערה: היווצרות הדבקים מושגת באמצעות אחת מהשיטות הבאות.

1. ישירות להוסיף את rSSp מסיסות אל מצע ולאחר מכן להחיל מצע שני מעל החלק העליון של הפתרון. מלחציים בחוזקה את החלקים ולאחר מכן מייבשים את הדגימות בתנור בטמפרטורה מינימלית של 25 ° c לפחות 16 שעות.
2. לחלופין, לרסס את שני משטחי המצע עם ציפוי ספריי ולאחר מכן להדק את המצעים יחד.
3. החלת rSSp באמצעות שיטת הטבילה של ציפוי מצעים ולתקוע את מצעים יכול לשמש גם כדי להכין ודבק.

8. סיבים רטובים

1. טען את הפתרון סם מסיסות לתוך מזרק קונצנטריים עם Luer-Lok עצה באמצעות מחט הגלישה 19 G. להוציא בועות אוויר ולתת הסמים לשבת בקצה של Luer-Lok של המזרק.
2. הוסף לפחות 25 מ"מ של אבובים הצצה, פנימי קוטר 0.01 אינץ ', לתוך צינורות מבט אחד האצבעות הדוק של אבובים עבור 1/16 סנטימטר OD ו-10/32 חרוט. הצמד התאמה זו לצינורות הצצה למתאם הנשי Luer-Lok.
   1. החלף את המחט למדוד 19 עם זה להגדיר על המזרק טעון.
3. ממלאים אמבטיה גבוהה, זכוכית ברורה עם 99% האיזופנול טהור לשימוש עבור קרישת דם.
   1. ממלאים את האמבטיות למתוח, הממוקם מתחת godets למתוח. לאלה יהיו 80:20 איזופנול: מים מזוקקים באמבט המתיחה הראשון, ו20:80 איזופנול: מים מזוקקים באמבט המתיחה השני.
4. להגדיר את מערכת למתוח godet כזה כי הראשון לאחר האמבט קרישה הראשון godet באמבטיה למתוח הראשון מסתובבים באותו מהירות.
   1. להתחיל את המתיחה הראשונה על ידי התאמת מהירויות של הgodet הסופי באמבטיה למתוח 1, הגודט העליון באמצע, ואת הראשון באמבטיה למתוח 2 לאותו מהירות. מהירות זו תהיה 2x מהר כמו מהירות הסרת סיבים הראשונית.
   2. להתחיל את המתיחה השנייה על ידי התאמת מהירויות של הgodet הסופי באמבטיה למתוח 2, האחרון העליון, ואת מנחיל באותו מהירות. מהירות זו תהיה 2x מהר כמו המהירות המשמשת למתוח הראשון או 4x הראשונית מהירות ההסרה של הסיבים.
   3. מניחים כפפות מניטריל על החלק החיצוני של הגודטים ביניים כדי לשמור על הסיבים מחליקים.
5. התחל להאט לאט את הפתרון לתוך אמבטיית קרישת הדם. במערכת אוטומטית להגדיר את שיעור ההבלטה כדי להתאים את מהירות ההסרה של 10 מ"מ/s.
   1. אפשר שחול הסיבים להפוך אחיד לפני משיכת סיבים מתוך האמבט באמצעות וו מתכת דק או מלקחיים. הסרת הסיבים מהאמבטיה יצרה לולאה בין הקצה של הצינור הצצה לבין הנתיב של הסיבים העוזבים את האמבטיה.
6. מדריך את הסיבים המאוחזרים דרך הסדרה של godets כגון סיבים שקוע באמבטיות למתוח, אבל ייבוש באוויר בין אמבטיות למתוח לפני לעלות על סליל. ייבוש זה מושגת על ידי godets ביניים גבוה יותר ממוקם.
   הערה: קצב הסרת הסיבים ו/או שיעור ההבלטה יצטרכו להיות מותאמים בהתאם לריכוז החלבון, התוספים וסוג החלבון כדי לאפשר זמן קרישה מספיק ללא הסבת סיבים בתחתית אמבטיית הקרישה.
7. הצמד את הסיבים הנמתחים במלואו לסליל על מנגנון ההדבקה באמצעות הקלטת.

Representative Results

מתוך השיטה המתוארת של מסיסות rSSp, ניתן להשיג מגוון של צורות חומר כפי שנראה באיור 1. שיטת הפתרון היא להחיל חום ולחץ, שנוצר על ידי מיקרוגל קונבנציונאלי, להשעיה של rSSp ומים. כאשר הטמפרטורות והלחצים הקריטיים מושגת, החלבון יהיה מסיסות. מתוך פתרון rSSp מסיסות זה, התנאים הנדרשים מוצגים עבור שבעה צורות חומרים: הידרולים, lyogels, ספוג, דבקים, ציפויים, סרטים, וסיבים. הידרולים מוכנים על ידי מתן rSSp מסיסות כדי מגניב וטבעי שותף עצמי. ליאוג'ל מוכן על ידי ליאופליזינג ההידרוג'ל חומר ספוג נוצר על ידי הקפאת ההידרוג'ל בזמן שהוא שקוע במים. סרטים יכולים להיות מוכנים על ידי השלכת rSSp מסיסות אל משטחי PDMS (ומשטחי הקלה אחרים) ומיובשים. PDMS מאפשר לסרט להיות הוסר בקלות לפוסט טיפולים או ניתוח. ציפויים ודבקים מופקים באמצעות תרסיס או שיטות טבילה או שילובים של ספריי ומטבל. סיבים דורשים את העיבוד הנרחב ביותר על-ידי הבלטת ממד לתוך אמבט קרישה ולאחר מכן מתיחת הסיבים הגולמיים באמבטיות מתיחה שלאחר ספין. סיבים יכולים להיווצר על ידי הבלטת ממד לתוך אמבטיית קרישה לבד. עם זאת, את היכולת המכנית הטובה ביותר בסיבים דורש מתיחות לאחר ספין אמבטיות למתוח^3,7,⁸,⁹.

איור 1: חומרים מימית וחומרי rSSp. תמונות מייצגות של החומרים שגובשה באמצעות שיטת פתרון זה של חום ולחץ עם rSSp solvated במים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

לאחר רקומביננטי החלבונים משי עכביש מטוהרים הם צריכים אז להיות מוכנים בפתרון כי ניתן להשתמש עבור היווצרות חומר. על-ידי ערבוב חלבון המשי של קורי העכביש עם מים וחשיפת תערובת זו להקרנה מיקרוגל, כדי ליצור חום ולחץ, ניתן להכין פתרון rSSp. ניתן להפיק מגוון רחב של צורות חומריות משיטה פשוטה ויעילה זו של פתרונות rSSp. כל חומר צריך להיות מוכן ומעובד באופן ייחודי כדי להשיג את התוצאות והמאפיינים הרצויים. עם שינויים קלים הניסוחים הראשונית, תנאי היווצרות, ו/או מעבד פרמטרים, כל חומר ניתן להתאים בקלות באמצעות שיטה זו. יש יותר צורות מאשר מוצגות כאן ובאמצעות חקירות נוספות על ידי אחרים בתחום, חומרים אלה ימשיכו להתפתח כדי לחקור צורות חומר חדש באמצעות טכניקה זו.

בתנאי שהפתרון מורכב בעיקר ממים וחלבונים (תוספים יכולים להיות מנוצלים לעיכוב הגגנציה ולשיפור יציבות הפתרונות) האפשרות לפונקציונליזציה עם רכיבים פעילים ביולוגית משופרת מאוד ב השוואה לפתרונות rSSp המבוססים על HFIP. מגוון של רכיבים, אך לא samplings ממצה נכללו בדיסקופים ובכך טפסים חומריים כולל: אנטיביוטיקה, antimycotics, הפארין, חלקיקי כסף, ואינטגרציה עבור הדבקה תא. בנוסף תוספים, מרובים רקומביננטי עכביש משי חלבונים של גדלים שונים, רצפים, הטבע, ומקורות בהצלחה solvated עם שיטה זו משמש היווצרות של חומרים המתוארים בפרוטוקול זה.

עוד להרחיב את השימושיות של שיטה זו של מסיסות עבור לא רק rSSp אבל כל החלבונים solvated בשיטה זו, היא כי הפתרונות הם סטריליים סיפק את הטמפרטורה ואת הלחצים בתוך הבקבוקון או החדר הם גבוהים מספיק. פתרונות אלה יכולים להיות ונלקחו ישירות לתרבות התאים מבלי לזהם את התרבויות.

אם יש לקחת את החומרים האלה ישירות לתוך מערכות vivo, יש לטפל ברמות אנדוטוקסין. שיטת אוטוקלב משולשת הורסת אנאוטוקסינים כך שהרמות שלהם הן ב, או להלן, המומלץ 0.25 האיחוד האירופי/mL דווח לאחרונה¹⁰. בעוד החיטוי הוא שימושי עבור השמדת אנדוטוקסין, הלחצים שלה והטמפרטורות בדרך כלל להיכשל להגיע לטמפרטורה קריטית או הלחץ הנדרש כדי לממש את כל הדגימות rSSp ניסה לתאריך⁶. זה מחייב המיקרוגל או טמפרטורה/לחץ הכור הדרוש כדי להשלים את הימור.

באופן ייחודי, הסרת האנדוטוקסין ושימור החומר באמצעות חום ולחץ אינה מבזות את החלבון או את היכולת המכנית של הטופס היוצר בחומר התוצאה^4,5,6,7. זה מוערך כי סביר להניח כי יש נקודת המפנה של קבלת גבוה מדי של לחץ ו/או טמפרטורה יותר מדי מחזורי חום ולחץ שתוצאתו יכולת מכנית מושפל ו/או הרס של החלבון. נקודת המפנה הזאת צפויה להשתנות עבור סוג ה-rSSp solvated, ובמידה מסוימת, אורך ה-rSSp מנוצל. עם זאת, עם שיטה בסיסית זו של שימור, מספר ניסויים שימור הצופים ניתן לבצע באופן קצר כדי להתוות את טמפרטורת האנרגיה שימור מתאים ולחצים הדרושים עבור חלבונים ספציפיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60