Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de productie van water oplosbare recombinant Spider Silk Protein Solutions en de materiële vormen die kunnen worden gevormd uit deze oplossingen.

Abstract

Veel spinnen produceren zeven soorten Silks. Zes van de zijdes zijn vezel in vorm wanneer geproduceerd door de spinnen. Deze vezels zijn niet in water oplosbaar. Om de opmerkelijke mechanische eigenschappen van spin zijdes te reproduceren, moeten zij in heterologe gastheren worden geproduceerd aangezien de spinnen zowel territoriaal als kannibalistische zijn. De synthetische analogen van spin zijde ook de neiging om onoplosbaar zijn in waterige oplossingen. Zo, een groot percentage van het onderzoek in recombinant spin zijdes vertrouwen op organische oplosmiddelen die schadelijk zijn voor grootschalige productie van materialen. De methode van onze groep dwingt de Solvatie van deze recombinante spin zijdes in water. Opmerkelijk is, wanneer deze eiwitten zijn bereid met behulp van deze methode van warmte en druk, een breed scala van materiële vormen kunnen worden bereid uit dezelfde oplossing van recombinant Spider Silk eiwitten (rSSp), waaronder: films, vezels, spons, hydrogel, lyogel, en lijmen. Dit artikel toont de productie van solvated rSSp en materiële vormen op een manier die gemakkelijker dan van geschreven materialen en methodes alleen wordt begrepen.

Introduction

Spider Silks hebben garnered het belang van materiële wetenschappers voor hun indrukwekkende combinatie van kracht, elasticiteit, en biocompatibiliteit. Recreëren van vezels is van oudsher de stuwkracht van het onderzoek. Deze inspanning werd belemmerd door de recombinante spin zijde proteïne (rSSp) onoplosbaarheid in water evenals het onvermogen van traditionele solvation technieken (chaotropic agenten en detergentia) om waterige oplosbaarheid te bereiken. Verder, technieken die zijn ontwikkeld voor solvating versies van rSSp werken niet op alle rSSp varianten en vereisen ook aanzienlijke manipulatie en tijd die vaak resulteert in eiwitverlies^1,2. Dit heeft grotendeels geresulteerd in het gebied gebruik te maken van 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) als een oplosmiddel van waaruit vezels te vormen, en andere beperkte materiële vormen. Het voordeel is dat alle bekende rSSp oplosbaar zijn in HFIP, waardoor de gegevens uniformiteit tussen elke onderzoeksgroep wordt verschaft. Het nadeel is dat HFIP is een giftig oplosmiddel dat is duur en onpraktisch om de schaal als gevolg van gezondheidsproblemen en milieu-overwegingen.

Een nieuwe benadering van rSSp solvation werd ontwikkeld die de technologische kloof overbrugde tussen de harde organische oplosmiddel HFIP en andere technieken die selectief werkte voor rSSp solvation. De combinatie van specifieke warmte en druk werd toegepast op suspensies van rSSp en water. De resultaten waren dichtbij 100% solvation en terugwinning van rSSp, evenals hoge eiwit concentraties; een verscheidenheid van materialen vormen werden bepaald om van deze formuleringen mogelijk te zijn die niet allen haalbaar waren gebruikend HFIP of andere organische oplosmiddelen^3,4,5,6. Het doel van deze aanpak is om efficiënt en gemakkelijk solubilize gezuiverde en gedroogde recombinante spin-eiwitten in een waterige oplossing die vervolgens kan worden gebruikt voor de productie van een verscheidenheid van materiële vormen.

Vezels, films, coatings, lijmen, hydrogels, lyogels, microsferen, en spons materialen zijn allemaal gemakkelijk te verwezenlijken uit dezelfde waterige rSSp oplossing met behulp van deze methode. De verdere evolutie van deze methode, niet alleen met extra rSSp maar met andere proteïnen, kon tot nieuwe materiële vormen en alternatieve EiwitReiniging en oplosbaar maken wegen leiden.

Protocol

1. recombinant spin zijde mengsel voorbereiding van gelyofiliseerde eiwit voorraden

1. Bepaal de noodzakelijke formulering en het volume dat nodig is voor de beoogde materiële formaties. De typische formuleringen variëren van 3% (w/v) tot 15% (w/v). Met deze selectie berekent u de juiste rSSp, concentraties en ratio's.
   1. Gebruik de volgende respectieve formuleringen om elk materiaal voor te bereiden dat in dit protocol wordt beschreven: hydrogels/sponzen/lyogels% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; films/coatings, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; kleefstoffen, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; vezels, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Opmerking: Hoewel de meeste formuleringen zijn beter uitgerust voor specifieke vormen en materialen, is er een breed scala van formuleringen die vaak kunnen overlappen. Daarnaast kunnen de definitieve rSSp materialen ook worden afgestemd tijdens de vorming en verwerking om de gewenste eigenschappen te produceren. Over het algemeen, zal elk eiwit onderzoek naar aangewezen of nuttige parameters vereisen.
2. Selecteer een schone en nieuwe 8 mL autoclaveerbaar borosilicaatglas glas cultuur flacon met een rubberen bekleed schroefstop.
3. Verwijder de dop en plaats de lege flacon op een analytische balans. Tarra de massa van de lege flacon, zodat het saldo nul massa leest.
4. Voeg het gewenste gelyofiliseerde rSSp poeder toe aan de lege flacon voor elk specifiek materiaal.
   1. Gebruik deze specifieke massa's van elk eiwit type voor elk materiaal, bij de voorbereiding van een 2 mL oplossing: hydrogels/sponzen/lyogels, 60 mg MaSp1 en 60 mg MaSp2; films/coatings, 80 mg MaSp1 en 20 mg MaSp2; kleefstoffen, 120 mg MaSp1 en 120 mg MaSp2; vezels, 200 mg MaSp1 en 50 mg MaSp2.
5. Voeg de gewenste hoeveelheid ultrapuur water, ten minste 2 mL, toe aan de flacon die al de gewogen rSSp poeders bevat.
   Opmerking: voor alle oplos procedures wordt een minimaal volume van 2 mL aanbevolen.
6. Seal de flacon dop en levendig Vortex de inhoud van een verspreide, en homogene, rSSp mengsel dat nu klaar is voor de solvation procedure te creëren. Extra homogenisering benaderingen zoals sonication of waaier mengen kan worden gebruikt met, of in aanvulling, de Vortex mengen.

2. recombinant spin zijde solvation

Let op: tijdens de oplos procedure worden hoge warmte en druk opgewekt. Goede persoonlijke beschermingsmiddelen, met name Goggles, lange mouwen, en hittebestendig handschoenen zijn vereist voor dit proces.

1. Voer een laatste controle van de flacon, of het schip, dop om ervoor te zorgen dat het stevig en stevig aangespannen. Breng vervolgens het gesuspendeerde rSSp mengsel over naar een conventionele microgolfoven.
   Nota: de microgolf eenheden binnen de machts waaier van 700 tot 1.500 Watts, die kleinere interne kamer capaciteiten bezitten, en roterende platforms worden geadviseerd om betere solving voorwaarden te verstrekken.
2. Start de werking van de magnetron met 5 s uitbarstingen op volle kracht. Na elke burst kort open de deur en zorgvuldig mix/Swirl de flacon om de afwikkeling te voorkomen en onderhouden van de opgeschorte mengsel.
3. Herhaal dit microgolf proces tot het mengsel en/of de oplossing een temperatuur van minstens 130 °C heeft verkregen, wanneer gemeten met een infrarode thermometer direct tegen de oplossing die gedeelten van de flacon bevat. Herhaal dit proces totdat alle vaste deeltjes volledig zijn opgelost en niet meer zichtbaar zijn.
   Opmerking: er wordt voorgesteld om de flacon en de oplossing af en toe af te koelen, vooral als de formulering heeft een hoge concentratie van rSSp aanwezig. Temperaturen van meer dan 200 °C verhogen het risico op flacon Seal failure. Speciale aandacht moet ook worden gegeven om te voorkomen dat de oververhitte mengsel/oplossing van het aanraken van het zegel, die ook zal resulteren in flacon insluiting falen.
4. Na het succesvol solvating van de rSSp mengsel in een oplossing mogelijk de temperatuur van de oplossing en de flacon dop te koelen onder 100 ° c (kookpunt) voor het openen.

3. hydrogels

1. Bereid een hydrogel van de oplossing na het verwijderen van het uit de magnetron en waardoor het af te koelen en in te stellen. Giet de hydrogel in specifieke geometrieën alvorens deze volledig af te koelen.
   Nota: de verschillende rSSps zullen gevarieerde hoeveelheden tijden aan overgang aan een hydrogel vereisen. Bijvoorbeeld, MaSp2-achtige sequenties de neiging om hydrogels sneller vorm in vergelijking met MaSp1-achtige sequenties. Eiwit concentraties, zoutgehalte, en pH ook rechtstreeks van invloed op de snelheid van de overgang naar een hydrogel.

4. sponzen

1. Bereid een rSSp sponzen door eerst waardoor de primaire solvated oplossing om een hydrogel te vormen.
2. Plaats de hydrogel in een waterbad, plaats dit bad in de vriezer bij-20 °C, en wacht tot het bad volledig wordt bevroren.
3. Voltooi de spons vorming door het verwijderen van de bevroren hydrogel en het waterbad van de vriezer en ontdooien bij 25 ° c. De resulterende spons kan nu uit het ontdooide water worden verwijderd.

5. Lyogel

1. Bereid een rSSp lyogel door een gevormde hydrogel direct te bevriezen, met of zonder waterbad, en de overbrenging van het bevroren hydrogel monster naar een lyophilizer (vriesdroger).
2. Verwijder de laatste gelyofiliseerde gel materiaal van het schip dat de vocht sublimatie opgetreden in.

6. films en coatings

1. Gebruik een van de drie volgende methoden: oplossing gieten, oplossing spuiten, of dip coating om films of coatings van rSSp te produceren.
   1. Giet de solubilized zijde oplossing in/op PDMS vormen van de gewenste vorm.
   2. Giet en spreid 200 µ L van de film oplossing uit en laat dit drogen alvorens hen van het PDMS substraat voor het testen of behandeling af te pellen.
   3. Na het toestaan van deze te drogen, verwijder de gevormde films voor mechanische testen of post-Treat de films om de mechanische eigenschappen te verbeteren.
2. Ter voorbereiding van een coating, of een film die niet kan worden verwijderd uit het substraat, gebruik ofwel spray of dip coating om een dunne laag film te produceren.
   Opmerking: om te spuiten jas, dit protocol heeft gevonden succes met een Master airbrush model Paint sprayer.
   1. Vorm een dip-coating door simpelweg onderdompelen het substraat van de keuze in de solubilized rSSp en herhaal na het drogen om de gewenste dikte te bereiken.
   2. Voer een eerste spray jas voor het aanbrengen van een dip jas om de consistentie en effectiviteit van de uiteindelijke coating te verhogen.

7. lijmen

Nota: de vorming van kleefstoffen wordt bereikt door één van de volgende methodes.

1. Voeg direct de solubilized rSSp op een substraat toe en breng vervolgens een tweede substraat over de bovenkant van de oplossing. Klem de stukken stevig vast en droog vervolgens de monsters in een oven met een minimale temperatuur van 25 °C gedurende ten minste 16 uur.
2. Als alternatief, spray de twee substraat oppervlakken met een spray coating en vervolgens klem de substraten samen.
3. De toepassing van de rSSp door de DIP methode van coating de substraten en plakken van de substraten kan ook worden gebruikt voor te bereiden en lijm.

8. nat-gesponnen vezels

1. Laad de solubilized dope oplossing in een concentrische spuit met Luer-Lok Tip door een 19 G Glide naald. Uitwerpen luchtbellen en laat de dope zitten op de Luer-Lok einde van de spuit.
2. Plaats ten minste 25 mm van PEEK tubing, interne diameter 0,01 inch, in het een stuk vinger van de PEEK tubing fittingen voor 1/16 inch OD en 10/32 kegel. Bevestig deze fitting aan een PEEK tubing op Luer-Lok Female adapter.
   1. Vervang de 19 gauge naald met deze set-up op de geladen spuit.
3. Vul een lang, helder glas bad met 99% zuiver isopropanol te gebruiken voor coagulatie bad.
   1. Vul de stretch Baden, gelegen onder de stretch GODETS. Deze zullen 80:20 isopropanol: gedistilleerd water in de eerste stretch bad, en 20:80 isopropanol: gedistilleerd water in de tweede stretch bad.
4. Stel de godin stretch systeem zodanig dat de eerste godin na het coagulatie bad en de eerste godin in de eerste stretch Bad draaien met dezelfde snelheid.
   1. Begin het eerste stuk door de snelheden van de uiteindelijke godin in stretch Bath 1, de middelste boven godin, en de eerste godin in stretch Bath 2 tot dezelfde snelheid aan te passen. Deze snelheid zal 2x zo snel als de eerste vezel verwijdering snelheid.
   2. Initiëren van de tweede Stretch door het aanpassen van de snelheden van de uiteindelijke godin in stretch Bath 2, de laatste bovenste godint, en de Winder om dezelfde snelheid. Deze snelheid zal 2x zo snel als de snelheid die wordt gebruikt voor de eerste stretch of 4x de eerste vezels verwijderen snelheid.
   3. Plaats nitril handschoenen aan de buitenkant van de tussenliggende GODETS om de vezel te houden van uitglijden.
5. Start om langzaam extruderen de oplossing in de coagulatie bad. In een geautomatiseerd systeem Stel de extrusie-tarief overeenkomen met een verwijderings snelheid van 10 mm/s.
   1. Laat Fiber extrusie uniform worden voor het trekken van de vezels uit het bad met behulp van een dun metalen haak of Tang. Controleer het verwijderen van de vezel uit het bad creëerde een lus tussen de PEEK tubing Tip en het pad van de vezel het verlaten van het bad het bad.
6. Leidraad voor de teruggewonnen vezel door de reeks van GODETS zodanig dat de vezel wordt ondergedompeld in de stretch Baden, maar drogen in de lucht tussen de stretch Baden en voordat je op een spoel. Dit drogen wordt bereikt door de hoger geplaatste midden GODETS.
   Nota: het tarief van de vezel verwijdering en/of het uitdrijvings tarief zullen moeten worden aangepast gebaseerd op de eiwitconcentratie, additieven, en het eiwit type om ruime coagulatie tijd zonder het bundelen van vezels op de bodem van het coagulatie Bad toe te staan.
7. Bevestig de volledig uitgerekte vezels aan de spoel op de Winder mechanisme met behulp van tape.

Representative Results

Van de beschreven methode van oplosbaar maken van rSSp, kan een verscheidenheid van materiële vormen worden bereikt zoals gezien in Figuur 1. De methode van oplosbaar maken is het toepassen van warmte en druk, gegenereerd door een conventionele magnetron, tot een schorsing van rSSp en water. Wanneer kritieke temperaturen en druk worden bereikt, zal het eiwit solubilize. Van deze solubilized rSSp oplossing, worden de vereiste voorwaarden voorgesteld voor zeven materiële vormen: hydrogels, lyogels, spons, kleefstoffen, deklagen, films, en vezels. Hydrogels worden voorbereid door het toestaan van de solubilized rSSp om af te koelen en natuurlijk zelf-Associate. Een lyogel wordt voorbereid door lyophilizing de hydrogel. Spons materiaal wordt gevormd door het bevriezen van de hydrogel terwijl het wordt ondergedompeld in water. Films kunnen worden bereid door het gieten van de solubilized rSSp op PDMS oppervlakken (en andere vatbaar oppervlakken) en gedroogd. De PDMS kan de film gemakkelijk worden verwijderd voor post behandelingen of analyse. Coatings en lijmen worden gegenereerd met behulp van ofwel spray of DIP methoden of combinaties van spray en dip. Vezels vereisen de meest uitgebreide verwerking door extruderen in een coagulatie bad en vervolgens serieel stretching de ruwe vezels in de post-spin stretch Baden. Vezels kunnen worden gegenereerd door extruderen in een coagulatie bad alleen. Echter, de beste mechanische vermogen in de vezels vereist stretching in de post-spin stretch Baden^3,7,8,9.

Figuur 1: waterige Solvatie en rSSp materialen. Representatieve foto's van de materialen die zijn geformuleerd met behulp van deze oplosbaar maken methode van warmte en druk met rSSp solvated in water. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Na recombinant spin zijde eiwitten worden gezuiverd moeten ze dan worden voorbereid in een oplossing die kan worden gebruikt voor de materiële vorming. Door het mengen van gelyofiliseerde Spider Silk Protein met water en het blootstellen van dit mengsel aan magnetron bestraling, om warmte en druk te genereren, het mogelijk om een rSSp oplossing te bereiden. Een grote verscheidenheid van materiële vormen kan worden geproduceerd uit deze eenvoudige en efficiënte methode van rSSp oplosbaar maken. Elk materiaal moet uniek worden voorbereid en verwerkt om de gewenste uitkomst en eigenschappen te bereiken. Met kleine wijzigingen aan de initiële formuleringen, vorming voorwaarden, en/of verwerking parameters, elk materiaal kan gemakkelijk worden aangepast met behulp van deze methode. Er zijn meer formulieren dan worden gepresenteerd hier en door verdere onderzoeken door anderen in het veld, zullen deze materialen blijven evolueren naar nieuwe materiële vormen met behulp van deze techniek te verkennen.

Op voorwaarde dat de oplossing bestaat uit voornamelijk water en eiwitten (additieven kunnen worden gebruikt om vertraging gelering en verbetering van de stabiliteit van de oplossingen) de mogelijkheid voor functionalization met biologisch actieve componenten is sterk verbeterd in vergelijking met HFIP gebaseerde rSSp oplossingen. Een verscheidenheid van componenten, maar niet uitputtende bemonstering zijn opgenomen in de verdovende middelen en dus materiële vormen, waaronder: antibiotica, antimycotica, heparine, zilver nanodeeltjes, en integrines voor cel adhesie. Naast additieven, zijn de veelvoudige recombinante proteïnen van de spin zijde van diverse grootte, opeenvolgingen, aard, en bronnen met succes solvated met deze methode en gebruikt in de vorming van materialen die in dit protocol worden beschreven.

Verdere uitbreiding van het nut van deze methode van oplosbaar maken voor niet alleen rSSp maar alle eiwitten solvated in deze methode, is dat de oplossingen zijn steriel op voorwaarde dat de temperatuur en de druk in de flacon of kamer zijn voldoende hoog. Deze oplossingen kunnen worden en zijn rechtstreeks genomen om de cel cultuur zonder besmetting van de culturen.

Als deze materialen direct in vivo-systemen moeten worden genomen, moeten de endotoxine niveaus worden aangepakt. Een drievoudige autoclaaf methode die endotoxines vernietigt zodat hun niveaus bij, of hieronder zijn, is de geadviseerde 0,25 EU/mL onlangs gemeld¹⁰. Terwijl de autoclaaf voor het vernietigen van endotoxine nuttig is, ontbreken zijn druk en temperaturen gewoonlijk om de kritieke temperatuur of de druk te bereiken die wordt vereist om alle rSSp steekproeven volledig te solvate die tot datum⁶worden geprobeerd. Dit vereist een magnetron of een temperatuur/druk reactor nodig om de solvation te voltooien.

Uniek, het verwijderen van endotoxine en de Solvatie van het materiaal met behulp van warmte en druk niet degraderen het eiwit of de mechanische vermogen van de resulterende materiaal vorm^4,5,6,7. Het wordt gewaardeerd dat er waarschijnlijk een kantelpunt van het verkrijgen van te hoog van druk en/of temperatuur en te veel cycli van warmte en druk die resulteert in gedegradeerde mechanische vermogen en/of vernietiging van het eiwit. Dit kantelpunt zal waarschijnlijk variëren voor het type van rSSp solvated en, tot op zekere hoogte, de lengte van de rSSp gebruikt. Echter, met deze basismethode van solvation, kunnen verschillende Scouting Solvatie experimenten worden uitgevoerd in het kort om de juiste solvation temperatuur en druk die nodig is voor specifieke eiwitten af te bakenen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60