Materiale dannelse av rekombinant Spider silke gjennom vandig løsnings ved hjelp av varme og trykk

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere vannløselige rekombinant Spider silke protein løsninger og materialet skjemaer som kan dannes fra disse løsningene.

Abstract

Mange edderkopper produsere syv typer silke. Seks av silke er fiber i form når produsert av edderkopper. Disse fibrene er ikke vannløselige. For å reprodusere den bemerkelsesverdige mekaniske egenskaper edderkopp silke, må de produseres i heterologous verter som edderkopper er både territorielle og kannibalistiske. Den syntetiske analogs av edderkopp silke pleier også å være uløselig i vandige løsninger. Således, en stor andel av forskningen i rekombinant Spider silke stole på organiske løsemidler som er skadelig for Storskalaproduksjon av materialer. Vår gruppes metode tvinger løsnings av disse rekombinant Spider silke i vann. Bemerkelsesverdig, når disse proteinene er utarbeidet ved hjelp av denne metoden for varme og trykk, et bredt spekter av materielle former kan tilberedes fra samme løsning av rekombinant Spider silke proteiner (rSSp) inkludert: filmer, fibre, svamp, hydrogel, lyogel, og lim. Denne artikkelen demonstrerer produksjonen av solvated rSSp og materielle former på en måte som er lettere forstått enn fra skriftlige materialer og metoder alene.

Introduction

Spider silke har fått interessen av materielle forskere for deres imponerende kombinasjon av styrke, elastisitet og biokompatibilitet. Gjenskape fibre har tradisjonelt vært den stakk av forskningen. Dette arbeidet ble hemmet av rekombinant Spider Silk protein (rSSp) uoppløselig i vann, samt manglende evne til tradisjonelle løsnings teknikker (chaotropic midler og vaskemidler) for å oppnå vandig løsnings. Videre, teknikker som er utviklet for solvating versjoner av rSSp fungerer ikke på alle rSSp varianter og krever også betydelig manipulasjon og tid som ofte resulterer i protein tap^1,2. Dette har i stor grad resultert i feltet bruker 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) som et løsemiddel for å danne fibre, og andre begrensede materielle former. Fordelen er at alle kjente rSSp er løselig i HFIP, og gir data ensartethet mellom hver forskningsgruppe. Ulempen er at HFIP er en giftig løsemiddel som er dyrt og upraktisk å skalere på grunn av helsemessige bekymringer og miljømessige hensyn.

En ny tilnærming til rSSp løsnings ble utviklet som Brokoblet den teknologiske gapet mellom de harde organiske løsemiddel HFIP og andre teknikker som selektivt jobbet for rSSp løsnings. Kombinasjonen av spesifikke Heat og trykk ble brukt til suspensjoner av rSSp og vann. Resultatene var nær 100% Løsnings og gjenvinning av rSSp, så vel som høye protein konsentrasjoner; en rekke materialer former ble bestemt å være mulig fra disse formuleringer som ikke var oppnåelig ved hjelp av HFIP eller andre organiske løsemidler^3,4,5,6. Målet med denne tilnærmingen er å effektivt og enkelt solubilize renset og tørket rekombinant Spider proteiner i en vandig løsning som deretter kan utnyttes for produksjon av en rekke materielle former.

Fibre, filmer, belegg, lim, hydrogeler, lyogels, mikrosfærer, og svamp materialer er alle lett accomplishable fra samme vandig rSSp løsning ved hjelp av denne metoden. Den fortsatte utviklingen av denne metoden, ikke bare med ekstra rSSp men med andre proteiner, kan føre til nye materielle former og alternative protein rensing og oppløseliggjøringen avenyer.

Protocol

1. rekombinant Spider Silk blanding forberedelse fra lyofilisert protein aksjer

1. Bestem den nødvendige formuleringen og volumet som kreves for de tiltenkte Material formasjonene. Typiske formuleringer spenner fra 3% (w/v) opp til 15% (w/v). Bruk dette valget til å beregne de aktuelle rSSp, konsentrasjonene og forholdstallene.
   1. Bruk følgende respektive formuleringer for å klargjøre hvert materiale som er beskrevet i denne protokollen: hydrogeler/svamper/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; filmer/belegg, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; lim, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibre, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Merk: selv om de fleste formuleringer er bedre tilpasset bestemte former og materialer, er det et bredt spekter av formuleringer som ofte kan overlappe. I tillegg kan de endelige rSSp materialene også skreddersys under dannelse og prosessering for å produsere de ønskede egenskapene. Vanligvis vil hvert protein kreve etterforskning i egnede eller nyttige parametre.
2. Velg et rent og nytt 8 mL autoklaverbar Borosilikatglass glass kultur glass med en gummi fôret skrulokk.
3. Fjern hetten og plasser det tomme hetteglasset på en analytisk balanse. Tare massen av den tomme hetteglasset slik at balansen leser null masse.
4. Legg den ønskede lyofilisert rSSp pulver til det tomme hetteglasset for hvert enkelt materiale.
   1. Bruk disse spesifikke massene av hver protein type for hvert materiale, når du forbereder en 2 mL løsning: hydrogeler/svamper/lyogels, 60 mg MaSp1 og 60 mg MaSp2; filmer/belegg, 80 mg MaSp1 og 20 mg MaSp2; lim, 120 mg MaSp1 og 120 mg MaSp2; fibre, 200 mg MaSp1 og 50 mg MaSp2.
5. Tilsett ønsket mengde ultrarent vann, minst 2 mL, til hetteglasset som allerede inneholder det veide rSSp-pulveret.
   Merk: et minimalt volum på 2 mL anbefales for alle løsnings prosedyrer.
6. Forsegle hetteglasset hetten og raskt Vortex innholdet for å skape en spredt, og homogen, rSSp blanding som nå er klar for løsnings prosedyren. Ytterligere homogenisering tilnærminger som sonikering eller pumpehjul miksing kan være ansatt med, eller i tillegg, Vortex miksing.

2. rekombinant Spider silke løsnings

FORSIKTIG: høy varmer og trykk genereres under løsnings prosedyren. Riktig personlig verneutstyr, spesielt vernebriller, lange ermer og varmebestandige hansker er nødvendig for denne prosessen.

1. Utfør en siste sjekk av hetteglasset, eller fartøyet, hetten for å sikre at det er godt festet og forsvarlig strammet. Deretter overføre suspendert rSSp blandingen til en konvensjonell mikrobølgeovn.
   Merk: mikrobølgeovn enheter innenfor kraft området på 700 til 1 500 watt, besitter mindre interne kammer kapasiteter, og roterende plattformer anbefales å gi bedre løsnings forhold.
2. Begynn driften av mikrobølgeovnen med 5 s støt ved full effekt. Etter hver burst kort åpne døren og bland forsiktig/virvel hetteglasset for å hindre bosetting og opprettholde suspendert blanding.
3. Gjenta denne mikrobølgeovnen prosessen til blandingen og/eller løsningen har fått en temperatur på minst 130 ° c, målt med et infrarødt termometer direkte mot oppløsningen som inneholder deler av hetteglasset. Gjenta denne prosessen til alle de solide partiklene er helt oppløst og ikke lenger er synlige.
   Merk: Det foreslås å la hetteglasset og oppløsningen avkjøles av og til, spesielt hvis formuleringen har en høy konsentrasjon av rSSp tilstede. Temperaturer høyere enn 200 ° c øker risikoen for tetnings svikt i hetteglasset. Det må også gis spesiell oppmerksomhet for å forhindre at overopphetet blanding/løsning berører forseglingen, noe som også vil føre til feil i hetteglass Oppbevaringen.
4. Etter vellykket solvating av rSSp-blandingen til en løsning, kan temperaturen på oppløsningen og hetteglass lokket avkjøles under 100 ° c (kokepunkt) før åpning.

3. hydrogeler

1. Forbered en hydrogel fra løsningen etter å ha fjernet den fra mikrobølgeovnen og la den avkjøles og settes. Legg hydrogel i en bestemt geometri før du lar den avkjøles helt.
   Merk: ulike rSSps vil kreve varierte mengder ganger for overgangen til en hydrogel. For eksempel MaSp2-lignende sekvenser en tendens til å danne hydrogeler raskere i forhold til MaSp1-lignende sekvenser. Protein konsentrasjoner, saltinnhold, og pH også direkte påvirke frekvensen av overgangen til en hydrogel.

4. Svamper

1. Forbered en rSSp svamper ved først å la den primære solvated løsning for å danne en hydrogel.
2. Plasser hydrogel i et vannbad, plasser dette badet i fryseren ved-20 ° c, og vent til badet er frosset helt.
3. Fullfør svamp formasjon prosessen ved å fjerne den frosne hydrogel og vannbad fra fryseren og tine ved 25 ° c. Den resulterende svamp kan nå fjernes fra tint vann.

5. Lyogel

1. Forbered en rSSp lyogel ved direkte frysing en dannet hydrogel, enten med eller uten et vannbad, og overføre den frosne hydrogel prøven til en lyophilizer (fryse tørketrommel).
2. Fjern det endelige lyofilisert gel fra fartøyet som fukt sublimering oppstod i.

6. filmer og belegg

1. Bruk en av de tre følgende metodene: løsning støping, løsning sprøyting, eller DIP belegg for å produsere filmer eller belegg av rSSp.
   1. Cast solubilized silke løsningen i/på PDMS former av ønsket form.
   2. Hell og spre 200 μL av film løsningen og la dette tørke før du peeling dem ut av PDMS substrat for testing eller behandling.
   3. Etter at disse til tørk, fjerne dannet filmer for mekanisk testing eller post-behandle filmene for å forbedre mekaniske egenskaper.
2. For å forberede et belegg, eller en film som ikke kan fjernes fra underlaget, bruk enten spray eller DIP belegg for å produsere en tynn film lag.
   Merk: Hvis du vil sprøyte pels, denne protokollen har funnet suksess med en Master airbrush modell maling sprayer.
   1. Form en dukkert belegg ved ganske enkelt submerging underlaget av valget i solubilized rSSp og gjenta etter tørking for å oppnå ønsket tykkelse.
   2. Utfør en innledende spray frakk før påføring av en dukkert pels for å øke konsistens og effektiviteten av det endelige belegget.

7. klebemidler

Merk: dannelsen av lim oppnås gjennom en av følgende metoder.

1. Legg direkte til solubilized rSSp på et substrat, og påfør deretter et andre substrat over toppen av oppløsningen. Fest delene godt sammen og tørk deretter prøvene i ovnen med en minimal temperatur på 25 ° c i minst 16 timer.
2. Alternativt, spray de to underlaget overflater med en spray belegg og deretter klemme underlaget sammen.
3. Påføring av rSSp gjennom DIP metoden av belegg på underlag og stikker på underlag kan også brukes til å forberede og lim.

8. Wet-spunnet Fibre

1. Legg den solubilized dope løsningen inn i en konsentrisk sprøyte med luer-Lok spiss gjennom en 19 G Glide nål. Løs luftbobler og la dop sitte ved luer-Lok enden av sprøyten.
2. Sett inn minst 25 mm av PEEK rør, innvendig diameter 0,01 tommer, inn i PEEK slangen er ett stykke finger stramt beslag for 1/16 tommer OD og 10/32 kjegle. Fest denne passer til en PEEK slange til luer-Lok kvinnelig adapter.
   1. Skift ut den 19 måle nålen med denne satt opp på den lastede sprøyten.
3. Fyll et høyt, klart glass bad med 99% ren isopropanol til bruk for blødnings bad.
   1. Fyll strekk bad, som ligger under strekningen godets. Disse vil ha 80:20 isopropanol: destillert vann i første strekk bad, og 20:80 isopropanol: destillert vann i andre strekningen bad.
4. Sett godet strekk system slik at den første godet etter blødnings badet og den første godet i første strekk badet roterer i samme hastighet.
   1. Initiere den første strekningen ved å justere hastigheten på den endelige godet i strekk bad 1, den midtre øvre godet, og den første godet i strekk bad 2 til samme hastighet. Denne hastigheten vil være 2x så fort som den første fiber fjerning hastighet.
   2. Initiere den andre strekningen ved å justere hastigheten på den endelige godet i strekk bad 2, den siste øvre godet, og Winder til samme hastighet. Denne hastigheten vil bli 2x så fort som den hastigheten som brukes for første strekk eller 4X den første fibrene fjerning hastighet.
   3. Plasser nitril hansker på utsiden av den mellomliggende godets å holde fiber sklir.
5. Begynn å langsomt extrude løsningen inn i blødnings badet. I et automatisert system sette ekstrudering rate å matche en fjerning hastighet på 10 mm/s.
   1. Tillat fiber ekstrudering å bli ensartet før du trekker fibrene ut av badet ved hjelp av en tynn metall krok eller tang. Kontroller fjerne fiber fra badet opprettet en løkke mellom PEEK slangen spissen og banen fiber forlate badet i badekaret.
6. Guide de hentet fiber gjennom rekken av godets slik at fibrene er nedsenket i strekk bad, men tørker i luften mellom strekk badene og før du går inn på en spole. Denne tørking oppnås ved høyere plassert mellomliggende godets.
   Merk: fiber fjerning rate og/eller ekstrudering rate må justeres basert på proteinkonsentrasjon, tilsetningsstoffer, og protein type for å tillate god blødningstid uten pooling fibre på bunnen av den blødnings bad.
7. Fest den fullt strukket fiber til spolen på Winder mekanismen ved hjelp av tape.

Representative Results

Fra den beskrevne metoden for oppløseliggjøringen av rSSp, kan en rekke materielle former oppnås som sett i figur 1. Metoden for oppløseliggjøringen er å bruke varme og trykk, generert av en konvensjonell mikrobølgeovn, til en suspensjon av rSSp og vann. Når kritiske temperaturer og trykk oppnås, vil proteinet solubilize. Fra denne solubilized rSSp-løsningen presenteres de nødvendige forutsetningene for syv Material former: hydrogeler, lyogels, svamp, Klebemidler, belegg, filmer og fibre. Hydrogeler er fremstilt av tillater det solubilized rSSp å avkjøle og ifølge sin natur selv-partner. En lyogel fremstilles ved å lyophilizing hydrogel. Svamp materiale dannes ved frysing av hydrogel mens den er nedsenket i vann. Filmer kan tilberedes ved å kaste den solubilized rSSp på PDMS overflater (og andre mottagelig overflater) og tørket. Den PDMS gjør at filmen skal lett fjernes for innlegg behandlinger eller analyse. Belegg og lim er generert ved hjelp av enten spray eller DIP metoder eller kombinasjoner av spray og DIP. Fibre krever den mest omfattende behandling ved ekstrudering inn i en blødnings bad og deretter serielt strekke rå fiber i post-spin strekk bad. Fibre kan genereres av ekstrudering i en blødnings badekaret alene. Men den beste mekaniske evnen i fibrene krever stretching i post-spin stretch bad³,⁷,^8,9.

Figur 1: vandig Løsnings og rSSp materialer. Representative bilder av materialene som er formulert ved hjelp av denne oppløseliggjøringen metoden for varme og trykk med rSSp solvated i vann. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Etter rekombinant Spider silke proteiner er renset de må da være forberedt på en løsning som kan brukes til Material dannelse. Ved å blande lyofilisert edderkopp silke protein med vann og utsette denne blandingen til mikrobølgeovn bestråling, for å generere varme og trykk, er det mulig å forberede en rSSp løsning. Et bredt utvalg av materielle former kan produseres fra denne enkle og effektive metoden for rSSp oppløseliggjøringen. Hvert materiale må være unikt forberedt og behandlet for å oppnå ønsket utfall og egenskaper. Med mindre endringer i de første formuleringer, formasjon forhold, og/eller prosessering parametere, kan hvert materiale enkelt justeres ved hjelp av denne metoden. Det finnes flere former enn det som er presentert her og gjennom videre undersøkelser av andre i feltet, vil disse materialene fortsette å utvikle seg til å utforske nye materielle former ved hjelp av denne teknikken.

Forutsatt at løsningen består av hovedsakelig vann og protein (tilsetningsstoffer kan utnyttes til å forsinke gelation og forbedre stabiliteten av løsningene) muligheten for funksjonalisering med biologisk aktive komponenter er sterkt forbedret i sammenlignet med HFIP baserte rSSp-løsninger. En rekke komponenter, men ikke uttømmende prøvetaking har vært inkludert i Dopes og dermed materielle former inkludert: antibiotika, antimycotics, heparin, sølv nanopartikler, og integrins for celle vedheft. I tillegg til tilsetningsstoffer, flere rekombinant Spider silke proteiner av ulike størrelser, sekvenser, natur og kilder har blitt vellykket solvated med denne metoden og brukes i dannelsen av materialer som er beskrevet i denne protokollen.

Videre utvide nytten av denne metoden for oppløseliggjøringen for ikke bare rSSp men alle proteiner solvated i denne metoden, er at løsningene er sterile forutsatt at temperaturen og presset inne i hetteglasset eller kammeret er tilstrekkelig høy. Disse løsningene kan og har blitt tatt direkte til cellekultur uten å forurense kulturer.

Hvis disse materialene skal tas direkte inn i vivo-systemer, må endotoksin nivåer tas opp. En trippel autoklav metode som ødelegger endotoksiner slik at deres nivåer er på, eller under, den anbefalte 0,25 EU/mL har nylig blitt rapportert¹⁰. Stund autoklav er nyttig for ødelegge endotoksin, dens trykk og temperatur vanligvis ikke oppnå det betenkelig temperatur eller trykk krevde å absolutt solvate alle av det rSSp eksemplar forsøkte å dato⁶. Dette nødvendiggjør mikrobølgeovnen eller en temperatur/trykk reaktor som er nødvendig for å fullføre løsnings.

Unikt, fjerning av endotoksin og løsnings av materialet ved hjelp av varme og trykk ikke forringe protein eller mekanisk evne til resulterende materiale form^4,5,6,7. Det er verdsatt at det trolig er et vippepunkt for å skaffe for høyt trykk og/eller temperatur og for mange sykluser av varme og trykk som resulterer i degradert mekanisk evne og/eller ødeleggelse av proteinet. Dette vippepunkt vil trolig variere for den type rSSp solvated og, til en viss grad, lengden på rSSp utnyttet. Men med denne grunnleggende metoden for løsnings, flere speideren løsnings eksperimenter kan utføres på kort for å avgrense riktig løsnings temperatur og trykk som kreves for bestemte proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60