Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以产生水溶性重组蜘蛛丝蛋白溶液和材料形式, 可以从这些解决方案形成。
Abstract
许多蜘蛛生产七种类型的丝绸。其中有六个丝绸是由蜘蛛生产的纤维。这些纤维不溶于水。为了再现蜘蛛丝的显著力学特性, 它们必须在异源寄主中产生, 因为蜘蛛既是领土的, 也是食人鱼的。蜘蛛丝的合成类似物也容易不溶于水溶液。因此, 重组蜘蛛丝的研究有很大一部分依赖于不利于大规模生产材料的有机溶剂。我们小组的方法迫使这些重组蜘蛛丝溶解到水中。值得注意的是, 当使用这种热和压力法制备这些蛋白质时, 可以从重组蜘蛛丝蛋白 (rSSp) 的相同溶液中制备出广泛的材料形式, 包括: 薄膜、纤维、海绵、水凝胶、溶解胶和粘合剂。本文演示了溶解 rSSp 和材料形式的生产方式, 比仅仅从书面材料和方法更容易理解。
Introduction
蜘蛛丝绸以其令人印象深刻的强度、弹性和生物相容性的结合而引起了材料科学家的兴趣。传统上, 修复纤维一直是研究的重点。这一努力受到重组蜘蛛丝蛋白 (rSSp) 在水中的不溶解性以及传统的溶解技术 (各向异性剂和洗涤剂) 无法实现水溶的阻碍。此外, 为解决 rssp 版本而开发的技术并不能在所有的 rssp 变体上工作, 还需要大量的操作和时间, 这往往会导致蛋白质损失1,2。这在很大程度上导致利用 1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟异丙醇 (HFIP) 作为形成纤维的溶剂, 以及其他有限的材料形式。其优点是所有已知的 rSSp 都可溶于 HFIP, 从而提供每个研究组之间的数据一致性。缺点是, HFIP 是一种有毒溶剂, 由于健康问题和环境考虑, 这种溶剂价格昂贵, 无法扩展。
提出了一种新的 rSSp 溶解方法, 弥补了苛刻的有机溶剂 HFIP 与其他有选择地用于 rSSp 溶解的技术之间的技术差距。将比热和压力结合起来, 对 rSSp 和水的悬浮液进行了应用。结果是 rSSp 的溶解和恢复接近 100%, 蛋白质浓度较高;从这些配方中确定了各种材料形式是可能的, 而这些配方并非都能使用 hfip 或其他有机溶剂3、4、5、6实现。这种方法的目的是高效和方便地溶解纯化和干燥的重组蜘蛛蛋白在水溶液中, 然后可用于生产各种材料形式。
使用这种方法, 纤维、薄膜、涂料、粘合剂、水凝胶、溶解胶、微球和海绵材料都很容易与相同的水 rSSp 溶液区分开来。这种方法的持续发展, 不仅与额外的 rSSp, 但与其他蛋白质, 可以导致新的材料形式和替代蛋白质纯化和增溶途径。
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Protocol
1. 由冻干蛋白库存制备重组蜘蛛丝的混合物
- 确定所需的配方和材料形成所需的体积。典型配方的范围从 3% (w/v) 到 15% (w v) 不等。使用此选择, 计算适当的 rSSp、浓度和比率。
- 使用以下各自的配方制备本议定书所述的每一种材料: 水凝胶/海绵/凝胶, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2;膜/涂层, 5% (w/v) 80:20 Masp1: masp2;胶粘剂, 12% (w/v) 50:50 Masp1: masp2;纤维, 12.5% (w/v) 80:20 masp1: Masp2。
注: 尽管大多数配方更适合于特定的形式和材料, 但有各种各样的配方通常会重叠。此外, 最终的 rSSp 材料也可以在成型和加工过程中进行定制, 以产生所需的性能。一般来说, 每种蛋白质都需要研究适当或有用的参数。
- 使用以下各自的配方制备本议定书所述的每一种材料: 水凝胶/海绵/凝胶, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2;膜/涂层, 5% (w/v) 80:20 Masp1: masp2;胶粘剂, 12% (w/v) 50:50 Masp1: masp2;纤维, 12.5% (w/v) 80:20 masp1: Masp2。
- 选择一个干净的和新的8毫升高压灭菌硼硅酸盐玻璃培养小瓶橡胶内衬螺帽。
- 取下瓶盖, 将空小瓶放在分析天平上。使空小瓶的质量倾斜, 使天平读出零质量。
- 为每种特定材料在空瓶中加入所需的冻干 rSSp 粉末。
- 在制备2毫升溶液时, 对每种材料使用每种蛋白质类型的这些特定质量: 盐酸/海绵/凝胶, 60 毫克的 MaSp1 和60毫克的 MaSp2;膜/涂层, 80 毫克的 MaSp1 和20毫克的 MaSp2;粘合剂, 120 毫克的 MaSp1 和120毫克的 MaSp2;纤维, 200 毫克的 MaSp1 和50毫克的 MaSp2。
- 添加所需的超纯水量, 至少2毫升, 到已经含有加权 rSSp 粉末的小瓶中。
注: 建议所有溶解过程的最小体积为2毫升。 - 密封小瓶盖和轻快的涡旋内装物, 以创建一个分散的, 均匀的, rSSp 混合物, 现在准备为溶解过程。其他均质方法, 如超声或叶轮混合, 可以与涡旋混合一起使用, 或与涡旋混合一起使用。
2. 重组蜘蛛丝溶解
注意: 在溶解过程中产生高加热和压力。在此过程中需要适当的个人防护设备, 尤其是护目镜、长袖和耐热手套。
- 对小瓶或容器盖进行最后检查, 以确保其已牢固地、牢固地拧紧。然后将悬浮的 rSSp 混合物转移到传统的微波炉中。
注: 在700至 1, 500 瓦的功率范围内的微波单元, 具有较小的内部腔容量, 并建议旋转平台, 以提供更好的溶解条件。 - 在全功率下5次爆裂, 开始微波的运行。每次爆裂后, 短暂地打开门, 小心地混合小瓶, 以防止沉淀和维护悬浮的混合物。
- 重复此微波过程, 直到混合物和/或溶液的温度至少达到 130°c, 当使用红外测温仪直接测量含有小瓶部分的溶液时。重复此过程, 直到所有的固体颗粒已完全溶解, 不再可见。
注: 建议允许小瓶和溶液偶尔冷却, 特别是如果配方中存在高浓度的 rSSp。温度超过200°c 会增加小瓶密封失效的风险。还必须特别注意防止过热的混合液接触密封, 这也会导致小瓶密封失效。 - 在成功地将 rSSp 混合物溶解到溶液中后, 可以使溶液的温度和小瓶盖冷却到 100°c (沸点) 以下, 然后才能打开。
3. 水凝胶
- 从溶液中取出水凝胶后, 将其从微波炉中取出, 并让其冷却和设置。将水凝胶抛入特定的几何形状, 然后再让其完全冷却。
注: 不同的 rSSps 将需要不同的时间过渡到水凝胶。例如, 与 Masp1 类序列相比, 类似 MaSp2 的序列往往会更快地形成水凝胶。蛋白质浓度、盐度和 pH 值也直接影响向水凝胶的转化率。
4. 海绵
- 首先让主要的溶解溶液形成水凝胶, 准备一个 rSSp 海绵。
- 将水凝胶放在水浴中, 将此浴池放在-20°c 的冰柜中, 并等待将浴池完全冻结。
- 通过从冰柜中取出冷冻的水凝胶和水浴, 并在25°c 时解冻, 完成海绵的形成过程。由此产生的海绵现在可以从解冻的水中取出。
5. lyogel
- 通过直接冷冻形成的水凝胶 (带或不使用水浴) 并将冷冻水凝胶样品转移到冻干机 (冷冻干燥机) 来制备 rSSp 溶解凝胶。
- 从容器中取出最终的冻干凝胶材料, 在容器中发生水分升华。
6. 薄膜和涂料
- 使用以下三种方法之一: 溶液铸造、溶液喷涂或浸渍涂层, 以生产 rSSp 的薄膜或涂层。
- 将溶解性丝溶液中投到所需形状的 PDMS 中。
- 将薄膜溶液倒出并扩散 200Μl, 并使其干燥, 然后将其从 PDMS 基板上剥离, 进行测试或处理。
- 在允许这些干燥后, 取出成型的薄膜进行机械测试或后处理薄膜, 以提高机械性能。
- 要制备涂层或无法从基材中去除的薄膜, 请使用喷涂或浸渍涂层来生成薄膜层。
注: 对于喷漆, 该协议已发现成功与主喷枪模型喷漆器。- 只需将所选的基板浸入溶解性 rSSp 中, 然后在干燥后重复, 以达到所需的厚度, 即可形成浸渍涂层。
- 在涂上浸渍涂层之前, 请先进行初始喷涂, 以提高最终涂层的一致性和有效性。
7. 胶粘剂
注: 粘合剂的形成是通过以下方法之一实现的。
- 直接将溶解性 rSSp 添加到基板上, 然后在溶液顶部应用第二基板。将碎片紧紧地夹在一起, 然后在最低温度为25°c 的烤箱中干燥样品, 时间至少为16小时。
- 或者, 用喷涂涂层喷洒两个基板表面, 然后将基板夹紧在一起。
- 通过浸渍基材的浸渍法和粘接基板的浸渍方法, 也可应用 rSSp 制备和粘接基板。
8. 湿法纤维
- 通过 19 G 滑翔针, 将溶解的涂料溶液装入带有 Luer-Lok 尖端的同心注射器中。弹出气泡, 让毒品坐在注射器的 Luer-Lok 末端。
- 将至少25毫米的 PEEK 管, 内径0.01 英寸, 插入 PEEK 管的单件手指紧配件为半英寸 OD 和 1 ~ 32 锥。将此管接头连接到 Luer-Lok 女性适配器上的 PEEK 管。
- 将19个规格的针头更换为已装入的注射器上的此设置。
- 用99% 的纯异丙醇填充一个高大、透明的玻璃浴, 用于凝固浴。
- 填充位于舒展 godets 下方的拉伸浴池。这些将有80:20 异丙醇: 在第一个拉伸浴中蒸馏水, 和 20:80 异丙醇: 在第二个拉伸浴中蒸馏水。
- 设置 godet 拉伸系统, 使凝血浴后的第一个 godet 和第一个 godet 在第一个拉伸浴中以相同的速度旋转。
- 通过调整在弹力浴1中的最后 godet 的速度, 在舒展浴2中调整第一个 godet 的速度, 以相同的速度启动第一个哥特。此速度将是最初的光纤去除速度的2倍。
- 通过调整最后一个哥特在弹力浴2、最后一个上哥特和卷绕机的速度, 以相同的速度启动第二个伸展运动。这种速度将是第一次拉伸所使用的速度的2倍或最初纤维去除速度的4倍。
- 将丁腈手套放在中间的 godets 外部, 以防止纤维滑倒。
- 开始慢慢地将溶液挤出到凝固浴中。在自动化系统中, 将挤出速率设置为与 10 mm 的去除速度相匹配。
- 在使用薄金属钩或钳子将纤维从浴缸中拉出之前, 允许纤维挤出变得均匀。验证从浴池中取出纤维会在 PEEK 管头和离开浴池的路径之间创建一个循环。
- 引导回收的纤维通过一系列的 godets, 使纤维被淹没在拉伸浴, 但干燥在空气中的拉伸浴和之前进入线轴。这种干燥是通过较高的位置的中间 godets 实现的。
注: 纤维去除率和/或挤出率需要根据蛋白质浓度、添加剂和蛋白质类型进行调整, 以允许在凝固浴底部不将纤维汇集的情况下获得充足的凝固时间。 - 使用胶带将完全拉伸的纤维连接到绕线机机构的线轴上。
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Representative Results
从所描述的 rSSp 增利方法中可以实现各种材料形式, 如图 1所示。增溶的方法是将传统微波产生的热和压力施加到 rSSp 和水的悬浮液中。当达到临界温度和压力时, 蛋白质就会溶解。从这种溶解性 rSSp 解决方案中, 提出了七种材料形式所需的条件: 水凝胶、胶凝胶、海绵、粘合剂、涂料、薄膜和纤维。水凝胶是通过允许溶解性 rSSp 冷却和自然自联想准备的。通过对水凝胶进行冻干制备了一种溶解凝胶。海绵材料是在水中浸泡时通过冷冻水凝胶而形成的。薄膜可以通过将溶解性 rSSp 铸造到 PDMS 表面 (和其他可待面表面) 并进行干燥来制备。PDMS 允许很容易地删除电影后处理或分析。涂料和粘合剂是通过喷雾或浸渍方法或喷雾和浸渍组合生成的。纤维需要最广泛的加工, 通过挤压到凝固浴, 然后连续拉伸的原始纤维在自旋后拉伸浴。纤维可以通过挤压到凝固浴单独产生。然而, 纤维中最好的机械能力需要在旋转后拉伸浴3、7、8、9中进行拉伸。
图 1: 水溶液和 rSSp 材料.用这种在水中溶解的 rSSp 的热、压增溶方法配制的材料的代表性图片。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
重组蜘蛛丝蛋白纯化后, 必须在可用于材料形成的溶液中制备。通过将冻干蜘蛛丝蛋白与水混合, 并将这种混合物暴露在微波照射下, 产生热量和压力, 可以制备 rSSp 溶液。这种简单有效的 rSSp 增溶方法可以产生各种各样的材料形式。每种材料都必须经过独特的准备和加工, 以达到所需的结果和性能。通过对初始配方、成型条件和/加工参数的轻微改变, 每种材料都可以很容易地使用这种方法进行调整。表格比这里提出的要多, 通过该领域其他方面的进一步调查, 这些材料将继续演变, 利用这种技术探索新的材料形式。
只要溶液主要由水和蛋白质组成 (添加剂可用于延缓凝胶化和提高溶液的稳定性), 生物活性成分功能化的可能性就会大大提高。与基于 HFIP 的 rSSp 解决方案进行比较。兴奋剂和物质形式中包括了各种成分, 但并非详尽的采样, 包括: 抗生素、抗药、肝素、银纳米颗粒和细胞粘附的整合素。除添加剂外, 该方法还成功地解决了各种大小、序列、性质和来源的多种重组蜘蛛丝蛋白, 并将其应用于本协议所述材料的形成。
进一步扩大了这种增溶方法的作用, 不仅 rSSp, 而且在这种方法中溶解的所有蛋白质, 是解决方案是无菌的, 只要温度和压力在小瓶或腔内足够高。这些溶液可以而且已经直接被带到细胞培养中, 而不会污染培养物。
如果要将这些材料直接引入体内系统, 就必须解决内毒素水平问题。一种三重高压灭菌法, 它破坏内毒素, 使其水平达到或低于建议的 0.25 euml 最近报告了 10。虽然高压灭菌器可用于销毁内毒素, 但其压力和温度通常无法达到完全溶解到目前为止尝试的所有 rSSp 样品所需的临界温度或压力.这就需要微波或温度压力反应器来完成溶解。
独特的是, 去除内毒素和使用热和压力溶解材料不会降解蛋白质或由此产生的材料形式4,5,6,7的机械能力。人们认识到, 可能有一个临界点, 即获得过高的压力和温度, 热量和压力循环太多, 导致机械能力下降和蛋白质的破坏。这个临界点可能会因溶解的 rSSp 类型以及在一定程度上所使用的 rSSp 的长度而有所不同。然而, 有了这种基本的溶解方法, 可以在短时间内进行几个球探溶解实验, 以确定特定蛋白质所需的适当的溶解温度和压力。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢犹他州科学和技术研究 (USTAR) 倡议提供的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
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