Materiale dannelse af rekombinante Spider Silks gennem vandig Solvation ved hjælp af varme og tryk

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at producere vandopløselige rekombinant edderkop silke protein løsninger og de materiale former, der kan dannes fra disse løsninger.

Abstract

Mange edderkopper producerer syv typer af Silks. Seks af silkene er fiber i form, når de produceres af edderkopper. Disse fibre er ikke vandopløselige. For at reproducere de bemærkelsesværdige mekaniske egenskaber af edderkoppe silke, skal de produceres i heterologe værter, da edderkopper er både territoriale og kannibalistiske. De syntetiske analoler af edderkop silke har også tendens til at være uopløselige i vandige opløsninger. Således, en stor procentdel af forskning i rekombinant edderkop Silks stole på organiske opløsningsmidler, der er skadelige for storskalaproduktion af materialer. Vores gruppes metode tvinger sollen af disse rekombinante edderkoppe Silks i vand. Bemærkelsesværdigt, når disse proteiner er tilberedt ved hjælp af denne metode til varme og tryk, en bred vifte af materiale former kan fremstilles af den samme opløsning af rekombinante Spider silke proteiner (rSSp) herunder: film, fibre, svamp, hydrogel, lyogel, og klæbemidler. Denne artikel demonstrerer produktionen af den solverede rSSp og materiale formularerne på en måde, der er lettere at forstå end fra skriftlige materialer og metoder alene.

Introduction

Spider Silks har høstet interesse for materialevidenskabsfolk for deres imponerende kombination af styrke, elasticitet og biokompatibilitet. Genskaber fibre har traditionelt været essensen af forskningen. Denne indsats blev hæmmet af den rekombinante edderkop silke protein (rssp) Opløselighed i vand samt manglende evne til traditionelle solvatisering teknikker (chaotrope midler og rengøringsmidler) for at opnå vandig solvatisering. Yderligere, teknikker, der er blevet udviklet til opløsnings versioner af rssp virker ikke på alle rssp varianter og kræver også betydelig manipulation og tid, der ofte resulterer i protein tab^1,2. Dette har i høj grad resulteret i området udnytter 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluisopropanol (HFIP) som et opløsningsmiddel, hvorfra man kan danne fibre, og andre begrænsede materiale former. Fordelen er, at alle kendte rSSp er opløselige i HFIP, hvilket giver data ensartethed mellem hver forskningsgruppe. Ulempen er, at HFIP er et giftigt opløsningsmiddel, der er dyrt og upraktisk at skalere på grund af sundhedsmæssige betænkeligheder og miljømæssige hensyn.

Der blev udviklet en ny tilgang til rssp-solvatisering, som byggede bro over den teknologiske kløft mellem det barske organiske opløsningsmiddel hfip og andre teknikker, der selektivt arbejdede for rssp-solvatisering. Kombinationen af specifikke opvarmer og tryk blev anvendt på suspensioner af rssp og vand. Resultaterne var nær 100% solvatisering og genvinding af rssp samt høje proteinkoncentrationer; en række forskellige materialer former blev fast besluttet på at være muligt fra disse formuleringer, som ikke var alle opnåelige ved hjælp af hfip eller andre organiske opløsningsmidler^3,4,5,6. Formålet med denne fremgangsmåde er effektivt og let at opløse rensede og tørrede rekombinante Spider-proteiner i en vandig opløsning, der derefter kan anvendes til fremstilling af en række forskellige materiale former.

Fibre, film, belægninger, klæbemidler, hydrogeler, lyogler, mikrokugler og svampe materialer er alle let at skelne fra den samme vandige rSSp-løsning ved hjælp af denne metode. Den fortsatte udvikling af denne metode, ikke kun med yderligere rSSp, men med andre proteiner, kan føre til nye materiale former og alternativ protein rensning og opløseligheds veje.

Protocol

1. rekombinant edderkop silkeblanding forberedelse fra lyofiliseret protein bestande

1. Bestem den nødvendige formulering og volumen, der kræves til de tilsigtede materiale formationer. Typiske formuleringer spænder fra 3% (w/v) op til 15% (w/v). Brug dette valg til at beregne den relevante rSSp, koncentrationer og nøgletal.
   1. Brug følgende respektive formuleringer til at forberede hvert materiale, der er beskrevet i denne protokol: hydrogels/svampe/lyogeler, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; film/belægninger, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; Klæbemidler, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibre, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Bemærk: selv om de fleste formuleringer er bedre tilpasset til specifikke former og materialer, er der en bred vifte af formuleringer, der ofte kan overlappe hinanden. Derudover kan de endelige rSSp materialer også skræddersys under dannelse og behandling for at producere de ønskede egenskaber. Generelt vil hvert protein kræve undersøgelse af passende eller nyttige parametre.
2. Vælg et rent og nyt 8 mL autoklaverbart borosilicat glas kultur hætteglas med en gummi foret skruelåg.
3. Tag hætten af, og Anbring det tomme hætteglas på en analytisk balance. Tara massen af den tomme hætteglas, således at balancen læser nul masse.
4. Tilsæt det ønskede lyofiliserede rSSp-pulver til det tomme hætteglas for hvert specifikt materiale.
   1. Brug disse specifikke masser af hver protein type til hvert materiale ved tilberedning af en 2 mL opløsning: hydrogels/svampe/lyogels, 60 mg MaSp1 og 60 mg MaSp2; film/belægninger, 80 mg MaSp1 og 20 mg MaSp2; Klæbemidler, 120 mg MaSp1 og 120 mg MaSp2; fibre, 200 mg MaSp1 og 50 mg MaSp2.
5. Tilsæt den ønskede mængde ultrarent vand, mindst 2 ml, til hætteglasset, der allerede indeholder de vægtede pulvere af rssp.
   Bemærk: en minimal volumen på 2 ml anbefales til alle solvatisering procedurer.
6. Forsegl hætteglasset hætten og hvirvlet vortex indholdet til at skabe en spredt, og homogen, rssp blanding, der nu er klar til solvatisering procedure. Yderligere homogenisering tilgange såsom sonikering eller pumpehjul blanding kan anvendes med, eller Derudover, vortex blanding.

2. rekombinant edderkop silke solvatisering

Forsigtig: der genereres høje opvarmer og tryk under solvatisering-proceduren. Der kræves passende personlige værnemidler, især beskyttelsesbriller, lange ærmer og varmebestandige handsker til denne proces.

1. Udfør en afsluttende kontrol af hætteglasset eller beholderen for at sikre, at det er spændt fast og forsvarligt. Overfør derefter den suspenderede rSSp-blanding til en konventionel mikrobølge ovn.
   Bemærk: mikrobølge enheder inden for effektintervallet 700 til 1.500 watt, der har mindre indvendig kammer kapacitet, og roterende platforme anbefales for at give bedre solvatisering betingelser.
2. Begynd driften af mikrobølgeovnen med 5 s brister ved fuld kraft. Efter hver eksplosion skal du åbne lågen og forsigtigt blande/hvirvle hætteglasset for at forhindre, at den suspenderede blanding fastholdes.
3. Denne mikrobølge proces gentages, indtil blandingen og/eller opløsningen har opnået en temperatur på mindst 130 °C, når den måles med et infrarødt termometer direkte mod opløsningen, der indeholder dele af hætteglasset. Gentag denne proces, indtil alle faste partikler er helt opløst og ikke længere er synlige.
   Bemærk: det foreslås, at hætteglasset og opløsningen afkøles lejlighedsvis, især hvis formuleringen har en høj koncentration af rSSp til stede. Temperaturer på over 200 °C øger risikoen for tætnings svigt i hætteglasset. Der skal også lægges særlig vægt på at forhindre, at den over ophedede blanding/opløsning rører ved forseglingen, hvilket også vil resultere i, at hætteglasset ikke inddæmmes.
4. Efter en vellykket opløsnings af rssp-blandingen i en opløsning, kan opløsningens temperatur og hætteglassets låg afkøles til under 100 °c (kogepunkt), inden den åbnes.

3. hydrogels

1. Forbered en hydrogel fra opløsningen, når den er taget ud af mikrobølgeovnen, og den afkøles og indstilles. Kast hydrogel i specifikke geometrier, før den kan afkøles helt.
   Bemærk: forskellige rSSps vil kræve varierede mængder af gange for at overgangen til en hydrogel. For eksempel, MaSp2-lignende sekvenser tendens til at danne silicagelrogeler hurtigere i forhold til MaSp1-lignende sekvenser. Protein koncentrationer, saltholdighed og pH påvirker også direkte overgangshastigheden til en hydrogel.

4. svampe

1. Forbered en rSSp-svampe ved først at lade den primære solverede opløsning danne en hydrogel.
2. Anbring hydrogel i et vandbad, Anbring dette bad i fryseren ved-20 °C, og vent, indtil badet er helt frosset.
3. Gennemfør svampe dannelsesprocessen ved at fjerne den frosne hydrogel og vandbad fra fryseren og optøning ved 25 °C. Den resulterende svamp kan nu fjernes fra optøet vand.

5. lyogel

1. Forbered en rSSp lyogel ved direkte frysning af en dannet hydrogel, enten med eller uden vandbad, og overføre den frosne hydrogel prøve til en lyofilisator (fryse tørrer).
2. Fjern det endelige frysetørrede gel materiale fra det fartøj, som fugt Sublimation forekom i.

6. film og belægninger

1. Brug en af følgende tre metoder: løsning støbning, løsning sprøjtning, eller DIP belægning til at producere film eller belægninger af rSSp.
   1. Kast den opløseligheds formede silke opløsning ind i/på PDMS former af den ønskede form.
   2. Hæld og spred 200 μL af film opløsningen, og lad dette tørre, før du skrælle dem af PDMS-substratet til testning eller behandling.
   3. Efter at lade disse tørre, fjerne de dannede film til mekanisk afprøvning eller efter behandling af filmene for at forbedre de mekaniske egenskaber.
2. For at forberede en belægning, eller en film, der ikke kan fjernes fra substratet, skal du bruge enten spray eller DIP belægning til at producere en tynd film lag.
   Bemærk: for at sprøjte frakke, denne protokol har fundet succes med en Master airbrush model maling sprøjte.
   1. Danne en dip belægning ved blot at nedsænkes substratet af valg i den opløselig rSSp og Gentag efter tørring for at opnå den ønskede tykkelse.
   2. Udfør en indledende spray frakke før påføring af en dip frakke for at øge konsistensen og effektiviteten af den endelige belægning.

7. klæbemidler

Bemærk: dannelsen af klæbemidler opnås ved en af følgende metoder.

1. Tilsæt den oploesede rSSp direkte til et substrat, og anvend derefter et andet substrat over toppen af opløsningen. Fastgør brikkerne sammen, og tør derefter prøverne i en ovn med en minimal temperatur på 25 °C i mindst 16 timer.
2. Alternativt spray de to underlag overflader med en spray belægning og derefter klemme substrater sammen.
3. Anvendelse af rSSp gennem dip metode til belægning af substrater og stikning af substrater kan også bruges til at forberede og lim.

8. våd-spundet fibre

1. Læg den solubiliserede dope-opløsning i en koncentrisk sprøjte med luer-Lok-spidsen gennem en 19 G glide kanyle. Skub luftbobler ud, og lad stofferne sidde ved luer-Lok-enden af sprøjten.
2. Indsæt mindst 25 mm PEEK slange, indvendig diameter 0,01 tommer, ind i PEEK slangens One-Piece finger stramme fittings til 1/16 tommer OD og 10/32 kegle. Fastgør denne fitting til en PEEK slange til luer-Lok kvindelige adapter.
   1. Udskift den 19 gauge nål med dette sæt op på den fyldte injektionssprøjte.
3. Fyld et højt, klart glasbad med 99% ren isopropanol til brug for koagulations badet.
   1. Fyld stretch bade, placeret under den stretch godets. Disse vil have 80:20 isopropanol: destilleret vand i den første stretch bad, og 20:80 isopropanol: destilleret vand i den anden stretch bad.
4. Indstil godet stretch system sådan, at den første godet efter koagulations badet og den første godet i den første stretch bad roterer med samme hastighed.
   1. Initiere den første strækning ved at justere hastigheder på den endelige godet i stretch Bath 1, den midterste øvre godet, og den første godet i stretch Bath 2 til samme hastighed. Denne hastighed vil være 2x så hurtigt som den indledende fiber fjernelse hastighed.
   2. Initiere den anden strækning ved at justere Hastighederne på den endelige godet i stretch Bath 2, den sidste øvre godet, og Winder til samme hastighed. Denne hastighed vil være 2x så hurtigt som den hastighed, der anvendes til den første strækning eller 4X den indledende fibre fjernelse hastighed.
   3. Anbring nitrilhandsker på ydersiden af de mellemliggende godeter for at holde fibrene i at glide.
5. Start med langsomt at Ekstruderer opløsningen til koagulations badet. I et automatiseret system indstilles ekstruderingfrekvensen til at matche en fjernelses hastighed på 10 mm/s.
   1. Tillad fiber ekstrudering at blive ensartet, før du trækker fibrene ud af badet ved hjælp af en tynd metalkrog eller pincet. Bekræft fjernelse af fiber fra badet skabt en løkke mellem PEEK slange spids og sti fiber forlader badet bad.
6. Guide den hentede fiber gennem serien af godeter sådan, at fiber er nedsænket i stretch bade, men tørring i luften mellem stretch bade og før de går på en spole. Denne tørring opnås ved de højere placerede mellemliggende godeter.
   Bemærk: fiber fjernelses hastigheden og/eller ekstruderingfrekvensen skal justeres baseret på proteinkoncentrationen, tilsætningsstofferne og protein typen for at tillade rigelig koagulationstid uden at samle fibre på bunden af koagulations badet.
7. Fastgør den fuldt udstrakte fiber til spolen på spole mekanismen ved hjælp af tape.

Representative Results

Fra den beskrevne metode til solubilisering af rSSp kan der opnås en række forskellige materiale former som vist i figur 1. Metoden til solubilisering er at anvende varme og tryk, genereret af en konventionel mikrobølgeovn, til en suspension af rssp og vand. Når der opnås kritiske temperaturer og belastninger, vil proteinet blive opløst. Fra denne opløsende rSSp-løsning præsenteres de nødvendige betingelser for syv materiale former: hydrogels, lyogels, svamp, klæbemidler, belægninger, film og fibre. Hydrogels forberedes ved at lade den opløsnede rSSp køle af og naturligt selv associere. En lyogel fremstilles ved lyofiliserende hydrogel. Svamp materiale dannes ved frysning af hydrogel, mens det er nedsænket i vand. Film kan fremstilles ved at caste den opløselig rssp på PDMS overflader (og andre genstand overflader) og tørres. PDMS tillader, at filmen let kan fjernes til efter behandling eller analyse. Belægninger og klæbemidler genereres ved hjælp af enten spray eller DIP metoder eller kombinationer af spray og dip. Fibre kræver den mest omfattende behandling ved ekstrudering i et koagulations bad og derefter serielt strækker rå fiber i post-spin stretch bade. Fibre kan genereres ved ekstrudering i et koagulations bad alene. Men, den bedste mekaniske evne i fibrene kræver stretching i post-spin stretch bade^3,7,8,9.

Figur 1: vandig solvatisering og rssp materialer. Repræsentative billeder af de materialer, der er blevet formuleret ved hjælp af denne opløseligheds metode for varme og tryk med rssp solvatiseret i vand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Efter rekombinant edderkop silke proteiner renses de skal derefter forberedes i en opløsning, der kan bruges til materiale dannelse. Ved at blande lyofiliseret edderkop silke protein med vand og udsætte denne blanding til mikrobølge bestråling, for at generere varme og tryk, er det muligt at forberede en rSSp løsning. En bred vifte af materiale former kan fremstilles af denne enkle og effektive metode til rSSp solubilization. Hvert materiale skal være unikt forberedt og forarbejdet for at opnå det ønskede resultat og egenskaber. Med mindre ændringer i de indledende formuleringer, dannelse betingelser, og/eller forarbejdning parametre, kan hvert materiale let justeres ved hjælp af denne metode. Der er flere formularer end der præsenteres her og gennem yderligere undersøgelser af andre i marken, vil disse materialer fortsætte med at udvikle sig til at udforske nye materiale former ved hjælp af denne teknik.

Forudsat at opløsningen består af primært vand og protein (tilsætningsstoffer kan anvendes til at forsinke gelering og forbedre stabiliteten af løsningerne) muligheden for funktionalisering med biologisk aktive komponenter er væsentligt forbedret i sammenligning med HFIP-baserede rSSp-løsninger. En række komponenter, men ikke udtømmende prøvetagninger er blevet inkluderet i doperne og dermed materiale former herunder: antibiotika, antimycotics, heparin, sølv nanopartikler, og integrins for celle vedhæftning. Ud over tilsætningsstoffer, flere rekombinant edderkop silke proteiner af forskellige størrelser, sekvenser, naturer, og kilder er blevet solvatiseret med denne metode og anvendes i dannelsen af materialer, der er beskrevet i denne protokol.

Yderligere at udvide nytten af denne metode til solubilisering for ikke bare rssp men alle proteiner solvatiseret i denne metode, er, at løsningerne er sterile forudsat temperatur og tryk inde i hætteglasset eller kammeret er tilstrækkeligt høje. Disse løsninger kan være og er blevet taget direkte til cellekultur uden at forurere kulturerne.

Hvis disse materialer skal tages direkte ind i in vivo-systemer, skal endotoksinniveauerne afhjælpes. En tredobbelt autoklaven metode, der ødelægger endotoksiner, således at deres niveauer er på, eller derunder, den anbefalede 0,25 EU/mL er for nylig blevet rapporteret¹⁰. Selv om autoklaven er nyttig til destruktion af endotoksin, kan dens tryk og temperaturer normalt ikke nå den kritiske temperatur eller det tryk, der kræves for helt at solvat alle de rssp prøver forsøgt til dato⁶. Dette nødvendiggør en mikrobølgeovn eller en temperatur/tryk reaktor, der er nødvendig for at fuldføre sollen.

Unikt, fjernelse af endotoksin og solvatisering af materialet ved hjælp af varme og tryk ikke forringe proteinet eller den mekaniske evne af den resulterende materiale form^4,5,6,7. Det er værdsat, at der sandsynligvis er et vendepunkt for at opnå for højt tryk og/eller temperatur og for mange cyklusser af varme og tryk, der resulterer i forringet mekanisk evne og/eller ødelæggelse af proteinet. Dette vendepunkt vil sandsynligvis variere for typen af rssp solvatiseret og, til en vis grad, længden af rssp udnyttet. Men med denne grundlæggende metode til solvatisering, kan flere scouting solvatisering eksperimenter udføres i kort for at afgrænse passende solvatisering temperatur og tryk, der kræves for specifikke proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60