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Bioengineering

Formação de material de Silks de aranha recombinante através de solvação aquosa usando calor e pressão

doi: 10.3791/59318 Published: May 6, 2019

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir soluções de proteína de seda de aranha recombinante solúvel em água e as formas materiais que podem ser formadas a partir dessas soluções.

Abstract

Muitas aranhas produzem sete tipos de sedas. Seis das sedas são fibra na forma quando produzidas pelas aranhas. Estas fibras não são solúveis em água. A fim reproduzir as propriedades mecânicas notáveis de sedas da aranha, devem ser produzidas em anfitriões heterólogo porque as aranhas são territoriais e Cannibalistic. Os análogos sintéticos da seda da aranha igualmente tendem a ser insolúveis em soluções aquosas. Assim, uma grande percentagem de investigação em sedas de aranha recombinante dependem de solventes orgânicos que são prejudiciais para a produção em grande escala de materiais. O método do nosso grupo força a solvação dessas sedas de aranha recombinante em água. Notavelmente, quando essas proteínas são preparadas usando este método de calor e pressão, uma ampla gama de formas materiais pode ser preparada a partir da mesma solução de proteínas de seda de aranha recombinante (rSSp), incluindo: filmes, fibras, esponja, hidrogel, lyogel, e adesivos. Este artigo demonstra a produção do rssp solvatados e dos formulários materiais em uma maneira que seja compreendida mais facilmente do que dos materiais e dos métodos escritos sozinho.

Introduction

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As sedas de aranha ganhou o interesse de cientistas materiais para sua combinação impressionante de força, elasticidade, e biocompatibility. Recriando fibras tem sido tradicionalmente o impulso da pesquisa. Este esforço foi dificultado pela insolubilidade recombinante da proteína de seda da aranha (rssp) na água assim como a incapacidade de técnicas tradicionais do solvatação (agentes e detergentes de chaotropic) para conseguir o solvatação aquoso. Além disso, as técnicas que foram desenvolvidas para as versões de altamente fácil do rssp não trabalham em todas as variantes do rssp e também requerem manipulação substancial e tempo que muitas vezes resulta em perda de proteína1,2. Isto conduziu pela maior parte no campo que utiliza 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) como um solvente de que para formar fibras, e outras formas materiais limitadas. A vantagem é que todos os rSSp conhecidos são solúveis em HFIP, proporcionando uniformidade de dados entre cada grupo de pesquisa. A desvantagem é que HFIP é um solvente tóxico que é caro e impraticável a escala devido a preocupações de saúde e considerações ambientais.

Uma aproximação nova à solvação do rssp foi desenvolvida que ponte a abertura tecnológica entre o solvente orgânico áspero hfip e as outras técnicas que trabalharam seletivamente para o solvatação do rssp. A combinação de aquece e de pressões específicos foi aplicada às suspensões do rssp e da água. Os resultados foram próximos de 100% de solvação e recuperação do rSSp, bem como altas concentrações protéicas; uma variedade de formas de materiais foi determinada para ser possível a partir dessas formulações que não eram todas realizáveis usando hfip ou outros solventes orgânicos3,4,5,6. O objetivo desta abordagem é a solubilizar eficientemente e facilmente proteínas de aranha recombinante purificada e seca em uma solução aquosa que pode então ser utilizada para a produção de uma variedade de formas materiais.

Fibras, filmes, revestimentos, adesivos, hidrogéis, lyogels, microesferas e materiais de esponja são prontamente conseguíveis a partir da mesma solução aquosa de rSSp usando este método. A continuação da evolução deste método, não apenas com o rSSp adicional, mas com outras proteínas, pode levar a novas formas materiais e vias alternativas de purificação e solubilização de proteínas.

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Protocol

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1. preparação da mistura de seda da aranha de recombinação dos estoques liofilizados da proteína

  1. Determine a formulação e o volume necessários para as formações materiais pretendidas. As formulações típicas variam de 3% (w/v) até 15% (w/v). Usando essa seleção, calcule o rSSp, as concentrações e as proporções apropriadas.
    1. Utilizar as seguintes formulações para preparar cada material descrito neste protocolo: hidrogéis/esponjas/lyogels, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; filmes/revestimentos, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adesivos, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibras, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Nota: embora a maioria das formulações sejam mais bem ajustadas para formas e materiais específicos, há uma ampla gama de formulações que muitas vezes podem se sobrepor. Adicionalmente, os materiais finais do rSSp podem igualmente ser costurados durante a formação e o processamento para produzir as propriedades desejadas. Geralmente, cada proteína exigirá a investigação em parâmetros apropriados ou úteis.
  2. Selecione um frasco de cultura de vidro de borosilicato autoclavável de 8 mL com uma tampa de rosca de borracha revestida.
  3. Retire a tampa e coloque o frasco vazio num balanço analítico. Tare a massa do frasco vazio de modo que o contrapeso Leia a massa zero.
  4. Adicione o pó de rSSp liofilizado desejado ao frasco vazio para cada material específico.
    1. Use essas massas específicas de cada tipo de proteína para cada material, ao preparar um 2 mL de solução: hidrogéis/esponjas/lyogels, 60 mg de MaSp1 e 60 mg de MaSp2; filmes/revestimentos, 80 mg de MaSp1 e 20 mg de MaSp2; adesivos, 120 mg de MaSp1 e 120 mg de MaSp2; fibras, 200 mg de MaSp1 e 50 mg de MaSp2.
  5. Adicione a quantidade desejada de água ultrapura, pelo menos 2 mL, ao frasco que já contém os pós rSSp ponderados.
    Nota: recomenda-se um volume mínimo de 2 mL para todos os procedimentos de solvação.
  6. Sele a tampa do frasco e vórtice rapidamente o conteúdo para criar uma mistura rSSp dispersa e homogênea, que agora está pronta para o procedimento de solvação. Abordagens de homogeneização adicionais, como sonicação ou mistura de impulsor pode ser empregado com, ou, além disso, a mistura de vórtice.

2. solvatação de seda de recombinação da aranha

Cuidado: altas e pressões são geradas durante o procedimento de solvação. Equipamento de proteção pessoal adequado, especialmente óculos, mangas compridas e luvas resistentes ao calor são necessários para este processo.

  1. Efectue uma verificação final do frasco para injetáveis, ou do reservatório, para garantir que está firmemente e firmemente apertado. Em seguida, transfira a mistura rSSp suspensa para um forno de microondas convencional.
    Nota: as unidades da microonda dentro da escala de poder de 700 a 1.500 watts, possuindo capacidades menores da câmara interna, e plataformas de giro são recomendadas fornecer condições melhores do solvatação.
  2. Comece a operação do microondas com 5 s rajadas em plena potência. Depois de cada explosão, abra brevemente a porta e misture/Agite cuidadosamente o frasco para evitar a resolução e mantenha a mistura suspensa.
  3. Repita este processo de microondas até que a mistura e/ou solução tenha obtido uma temperatura de pelo menos 130 ° c, quando medido com um termômetro infravermelho diretamente contra a solução contendo porções do frasco para injetáveis. Repita este processo até que todas as partículas sólidas tenham sido completamente dissolvidas e não sejam mais visíveis.
    Nota: sugere-se para permitir que o frasco e a solução esfriem ocasionalmente, especial se a formulação tem uma concentração elevada de rSSp atual. Temperaturas superiores a 200 ° c aumentam o risco de falha do selo do frasco. Deve também ser prestada especial atenção para evitar que a mistura/solução superaquecida toque no selo, o que também resultará numa falha na contenção do frasco.
  4. Após a altamente fácil com sucesso a mistura de rssp em uma solução permita que a temperatura da solução e da tampa do frasco esfrie abaixo do ° c 100 (ponto de ebulição) antes de abrir.

3. hidrogéis

  1. Prepare um hidrogel da solução depois de removê-lo do microondas e permitindo que ele esfriar e definir. Lançar o hidrogel em geometrias específicas antes de permitir que ele totalmente fresco.
    Nota: diferentes rSSps exigirá quantidades variadas de vezes para a transição para um hidrogel. Por exemplo, MaSp2-like seqüências tendem a formar hidrogéis mais rapidamente em comparação com MaSp1-like seqüências. As concentrações de proteína, salinidade e pH também afetam diretamente a taxa de transição para um hidrogel.

4. esponjas

  1. Prepare um esponjas do rssp primeiro permitindo que a solução solvatados preliminar forme um Hydrogel.
  2. Coloc o hidrogel em um banho de água, coloc este banho no congelador em-20 ° c, e espere até que o banho esteja congelado completamente.
  3. Complete o processo de formação da esponja removendo o hidrogel congelado e o banho de água do congelador e descongelando a 25 ° c. A esponja resultante pode agora ser removida da água descongelado.

5. lyogel de Oliveira

  1. Prepare um lyogel do rssp congelando diretamente um hidrogel dado forma, com ou sem um banho de água, e transferindo a amostra congelada do hidrogel a um Liofilizador (secador do gelo).
  2. Remova o material liofilizado final do gel da embarcação que a sublimação da umidade ocorreu dentro.

6. filmes e revestimentos

  1. Use um dos três métodos a seguir: fundição de solução, pulverização de solução ou revestimento de imersão para produzir filmes ou revestimentos de rSSp.
    1. Conjurar a solução de seda solubilizada em/para formas PDMS da forma desejada.
    2. Despeje e espalhe 200 μL da solução do filme e deixe-o secar antes de descascá-los fora do substrato PDMS para teste ou tratamento.
    3. Depois de permitir que estes para secar, retire os filmes formados para testes mecânicos ou pós-tratar os filmes para melhorar as propriedades mecânicas.
  2. Para preparar um revestimento, ou uma película que não possa ser removida da carcaça, use o pulverizador ou o revestimento do mergulho para produzir uma camada fina da película.
    Nota: para pulverizar o revestimento, este protocolo encontrou o sucesso com um pulverizador mestre da pintura do modelo do airbrush.
    1. Forme um revestimento de imersão simplesmente submergindo o substrato de escolha no rSSp solubilizado e repita após a secagem para atingir a espessura desejada.
    2. Execute um revestimento de pulverizador inicial antes de aplicar um revestimento do mergulho para aumentar a consistência e a eficácia do revestimento final.

7. adesivos de

Nota: a formação de adesivos é conseguida através de um dos seguintes métodos.

  1. Adicione diretamente o rSSp solubilizado em um substrato e, em seguida, aplique um segundo substrato sobre a parte superior da solução. Aperte firmemente as peças juntas e seque as amostras em um forno com uma temperatura mínima de 25 ° c por pelo menos 16 h.
  2. Alternativamente, pulverizar as duas superfícies de substrato com um revestimento de pulverização e, em seguida, fixar os substratos juntos.
  3. Aplicando o rSSp através do método DIP de revestimento dos substratos e furar os substratos também pode ser usado para preparar e adesivo.

8. fibras molhado-giradas

  1. Carregue a solução solubilizada da droga em uma seringa concêntrica com ponta de Luer-Lok através de uma agulha do deslize de 19 G. Ejecte as bolhas de ar e deixe a droga sentar-se na extremidade Luer-Lok da seringa.
  2. Introduza pelo menos 25 milímetros da tubulação do auge, diâmetro interno 0, 1 polegadas, nos encaixes apertados do dedo One-Piece da tubulação do auge para 1/16 a polegada OD e o cone 10/32. Prenda este encaixe a uma tubulação do auge ao adaptador fêmea de Luer-Lok.
    1. Substitua a agulha de calibre 19 por esta configurada na seringa carregada.
  3. Encha um banho de vidro alto, desobstruído com o isopropanol puro do 99% a usar-se para o banho da coagulação.
    1. Encha os banhos do estiramento, situados abaixo dos godets do estiramento. Estes terão 80:20 isopropanol: água destilada no primeiro banho de estiramento, e 20:80 isopropanol: água destilada no segundo banho de estiramento.
  4. Ajuste o sistema do estiramento do godet tal que o primeiro godet após o banho da coagulação e o primeiro godet no primeiro banho do estiramento estão girando na mesma velocidade.
    1. Inicie o primeiro estiramento ajustando as velocidades do godet final no banho do estiramento 1, o godet superior médio, e o primeiro godet no banho 2 do estiramento à mesma velocidade. Esta velocidade será 2x tão rápido quanto a velocidade inicial da remoção da fibra.
    2. Iniciar o segundo trecho, ajustando as velocidades do godet final no banho trecho 2, o último godet superior, eo enrolador para a mesma velocidade. Esta velocidade será 2x tão rapidamente quanto a velocidade usada para o primeiro estiramento ou 4x a velocidade inicial da remoção das fibras.
    3. Coloque luvas de nitrilo no exterior dos godets intermediários para manter a fibra de escorregar.
  5. Comece a expulsar lentamente a solução para o banho de coagulação. Em um sistema automatizado, defina a taxa de extrusão para corresponder a uma velocidade de remoção de 10 mm/s.
    1. Permita que a extrusão da fibra se torne uniforme antes de puxar as fibras fora do banho usando com um gancho ou um fórceps fino do metal. Verific remover a fibra do banho criou um laço entre a ponta da tubulação do auge e o trajeto a fibra que sae do banho o banho.
  6. Guie a fibra recuperada através da série de godets tal que a fibra está submersa nos banhos do estiramento mas na secagem no ar entre os banhos do estiramento e antes de ir em um carretel. Esta secagem é conseguida pelos godets intermediários coloc mais elevados.
    Nota: a taxa da remoção da fibra e/ou a taxa da extrusão precisarão de ser ajustadas baseadas na concentração da proteína, nos aditivos, e no tipo da proteína para permitir o tempo amplo da coagulação sem agrupar fibras na parte inferior do banho da coagulação.
  7. Prenda a fibra inteiramente esticada ao carretel no mecanismo do enrolador usando a fita.

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Representative Results

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A partir do método descrito de solubilização do rSSp, uma variedade de formas materiais pode ser alcançada como observado na Figura 1. O método de solubilização é aplicar calor e pressão, gerados por um microondas convencional, a uma suspensão de rSSp e água. Quando as temperaturas e as pressões críticas são alcançadas, a proteína solubilize. A partir desta solução de rSSp solubilizada, são apresentadas as condições necessárias para sete formas materiais: hidrogéis, lyogels, esponja, adesivos, revestimentos, filmes e fibras. Os hidrogéis são preparados permitindo que o rSSp solubilizado esfrie e naturalmente se autoassocie. Um lyogel é preparado liofilizado pelo hidrogel. O material da esponja é formado congelando o hidrogel quando é imergido na água. As películas podem ser preparadas lançando o rssp solubilizado em superfícies de PDMS (e outras superfícies passíveis) e secas. O PDMS permite que a película seja removida facilmente para tratamentos ou análise do borne. Os revestimentos e os adesivos são gerados usando métodos do pulverizador ou do mergulho ou combinações do pulverizador e do mergulho. As fibras exigem o processamento o mais extensivo expulsando em um banho da coagulação e então esticando em série a fibra crua em banhos do estiramento da borne-rotação. As fibras podem ser geradas expulsando em um banho da coagulação sozinho. Entretanto, a melhor habilidade mecânica nas fibras requer alongamento nos banhos de estiramentopós-spin3,7,8,9.

Figure 1
Figura 1: materiais de solvação aquosa e rSSp. Retratos representativos dos materiais que foram formulados usando este método do solubilização do calor e da pressão com o rssp solvatados na água. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Depois que as proteínas de seda da aranha de recombinação são purified têm que então ser preparadas em uma solução que possa ser usada para a formação material. Misturando a proteína de seda da aranha liofilizada com água e expondo esta mistura à irradiação da microonda, para gerar o calor e a pressão, é possível preparar uma solução do rSSp. Uma grande variedade de formas materiais pode ser produzida a partir deste método simples e eficiente de solubilização de rSSp. Cada material tem que ser preparado e processado exclusivamente para alcançar o resultado desejado e as propriedades. Com pequenas alterações nas formulações iniciais, condições de formação e/ou parâmetros de processamento, cada material pode ser facilmente ajustado utilizando este método. Há mais formas do que são apresentadas aqui e através de outras investigações por outros no campo, estes materiais continuarão a evoluir para explorar novas formas materiais usando esta técnica.

Desde que a solução é composta principalmente de água e proteína (aditivos podem ser utilizados para atrasar a gelação e melhorar a estabilidade das soluções) a possibilidade de funcionalização com componentes biologicamente ativos é muito melhorada em comparação com as soluções de rSSp baseadas em HFIP. Uma variedade de componentes, mas não as amostragens exaustivas foram incluídas nos Narcóticos e, portanto, formas materiais, incluindo: antibióticos, antimicóticos, heparina, nanopartículas de prata e integrinas para a adesão celular. Além dos aditivos, várias proteínas de seda de aranha recombinante de vários tamanhos, sequências, naturezas e fontes foram satisfatoriamente solucionadas com este método e utilizadas na formação de materiais descritos neste protocolo.

Ampliar ainda mais a utilidade deste método de solubilização para não apenas rssp mas todas as proteínas solvatados neste método, é que as soluções são estéreis desde que a temperatura e as pressões dentro do frasco ou da câmara sejam suficientemente elevadas. Estas soluções podem ser e foram levadas diretamente para a cultura celular sem contaminar as culturas.

Se esses materiais forem levados diretamente para sistemas in vivo, os níveis de endotoxina devem ser abordados. Um método triplo da autoclave que destrua endotoxinas de modo que seus níveis estejam em, ou abaixo, o recomendado 0,25 EU/mL foi relatado recentemente10. Enquanto a autoclave é útil para destruir a endotoxina, suas pressões e temperaturas geralmente não atingem a temperatura ou pressão crítica necessária para solvate completamente todas as amostras de rSSp tentadas até a data6. Isso requer microondulação ou um reator de temperatura/pressão necessário para completar a solvação.

Excepcionalmente, a remoção da endotoxina e a solvação do material usando calor e pressão não degradam a proteína ou a capacidade mecânica do formulário material resultante4,5,6,7. É apreciado que há provavelmente um ponto de inflexão de obter muito alta de pressão e/ou temperatura e muitos ciclos de calor e pressão que resulta em degradação da capacidade mecânica e/ou destruição da proteína. Este ponto de inflexão provavelmente variará para o tipo de rssp solvatados e, em algum grau, o comprimento do rssp utilizado. No entanto, com este método básico de solvação, vários experimentos de solvação de aferição podem ser realizados em curto sentido para delinear a temperatura de solvação adequada e as pressões necessárias para proteínas específicas.

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Disclosures

Os autores não declaram conflito de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer com gratidão o financiamento da iniciativa de pesquisa de ciência e tecnologia de Utah (USTAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

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References

  1. Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43, (42), 13604-13612 (2004).
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Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).More

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

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