Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Material bildning av rekombinant Spider Silks genom vattenhaltiga Solvation med hjälp av värme och tryck

doi: 10.3791/59318 Published: May 6, 2019

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att producera vattenlösliga rekombinanta spindelnät protein lösningar och de material former som kan bildas från dessa lösningar.

Abstract

Många spindlar producerar sju typer av Silks. Sex av silkarna är fiber i form när de produceras av spindlar. Dessa fibrer är inte vattenlösliga. För att reproducera de anmärknings värda mekaniska egenskaperna hos spindel Silks, måste de produceras i heterologa värdar som spindlar är både territoriella och kannibalistiska. De syntetiska analoger av spindel silke tenderar också att vara olösliga i vatten lösningar. Således, en stor andel av forskning i rekombinant spindel Silks förlita sig på organiska lösnings medel som är skadliga för storskalig produktion av material. Vår grupps metod tvingar solvatiseringen av dessa rekombinanta spindel Silks i vatten. Anmärknings värt, när dessa proteiner är beredda att använda denna metod för värme och tryck, kan ett brett spektrum av material former framställas från samma lösning av rekombinant spindel silke proteiner (rSSp) inklusive: filmer, fibrer, svamp, hydrogel, Lyogel, och lim. Denna artikel visar produktionen av den solverade rSSp och material former på ett sätt som är lättare att förstå än från skriftligt material och metoder ensam.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Spider Silks har samlat intresset av material forskare för deras imponerande kombination av styrka, elasticitet, och biokompatibilitet. Återskapa fibrer har traditionellt varit inriktningen av forskningen. Denna ansträngning hämmades av rekombinant spindel silke protein (rssp) olösliga i vatten samt oförmåga traditionella solvatiseringen tekniker (chaotropic agenter och rengörings medel) för att uppnå vattenaktig solvatiseringen. Vidare, tekniker som har utvecklats för att löregla versioner av rssp fungerar inte på alla rssp varianter och kräver också betydande manipulation och tid som ofta resulterar i protein förlust1,2. Detta har till stor del resulterat i att fältet använder 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) som ett lösnings medel som bildar fibrer, och andra begränsade material former. Fördelen är att alla kända rSSp är lösliga i HFIP, vilket ger data enhetlighet mellan varje forskar grupp. Nack delen är att HFIP är ett giftigt lösnings medel som är dyrt och opraktiskt att skala på grund av hälso problem och miljömässiga överväganden.

En ny strategi för rssp solvatiseringen utvecklades som överbryggas den tekniska klyftan mellan de hårda organiska lösnings medel hfip och andra tekniker som selektivt fungerade för rssp solvatiseringen. Kombinationen av specifika Heat och tryck tillämpades på SUS pensioner av rSSp och vatten. Resultaten var nära 100% solvatiseringen och återhämtning av rssp, samt hög proteinkoncentrationer; en mängd olika material former bestämdes vara möjligt från dessa formuleringar som inte var alla kan uppnås med hjälp av hfip eller andra organiska lösnings medel3,4,5,6. Syftet med detta tillvägagångs sätt är att effektivt och enkelt solubilisera renade och torkade rekombinanta spindel proteiner i en vatten lösning som sedan kan användas för produktion av en mängd olika material former.

Fibrer, filmer, beläggningar, lim, hydrogels, lyogels, microspheres, och svamp material är alla lätt accomplishable från samma vattenhaltiga rSSp lösning med hjälp av denna metod. Den fortsatta utvecklingen av denna metod, inte bara med ytterligare rssp men med andra proteiner, kan leda till nya material former och alternativa proteiner rening och inlösning avenyer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. framställning av rekombinant spindel silke blandning från frystorkat protein bestånd

  1. Bestäm den nödvändiga formuleringen och volymen som krävs för de avsedda material formationerna. Typiska formuleringar varierar från 3% (w/v) upp till 15% (w/v). Med det här valet beräknar du lämplig rSSp, koncentrationer och nyckeltal.
    1. Använd följande beredningar för beredning av varje material som beskrivs i detta protokoll: hydrogels/svampar/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; filmer/beläggningar, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; lim, 12% (vikt/volym) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibrer, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Obs: även om de flesta formuleringar är bättre monterade för specifika former och material, det finns ett brett spektrum av formuleringar som ofta kan överlappa. Dessutom kan de slutliga rSSp-materialen också skräddarsys under bildning och bearbetning för att producera önskade egenskaper. Generellt, varje protein kommer att kräva utredning av lämpliga eller användbara parametrar.
  2. Välj en ren och ny 8 mL autoklabel borosilikatglas kultur flaska med ett gummifodrad skruv lock.
  3. Ta bort locket och placera den tomma injektions flaskan på en analytisk balans. Tara massan av den tomma flaskan så att balansen läser noll massa.
  4. Tillsätt det frystorkade rSSp-pulvret till den tomma injektions flaskan för varje specifikt material.
    1. Använd dessa specifika massor av varje protein typ för varje material, när du förbereder en 2 mL lösning: hydrogels/svampar/lyogels, 60 mg MaSp1 och 60 mg MaSp2; filmer/beläggningar, 80 mg MaSp1 och 20 mg MaSp2; lim, 120 mg MaSp1 och 120 mg MaSp2; fibrer, 200 mg MaSp1 och 50 mg MaSp2.
  5. Tillsätt den önskade mängden ultrarent vatten, minst 2 mL, till den injektions flaska som redan innehåller det viktade rSSp-pulvret.
    Obs: en minimal volym på 2 ml rekommenderas för alla solvatiseringen procedurer.
  6. Täta injektions flaskans lock och raskt virveln innehållet för att skapa en dispergerad, och homogen, rssp-blandning som nu är klar för solvatiseringen-proceduren. Ytterligare homogenisering metoder såsom ultraljudsbehandling eller impeller blandning kan användas med, eller i tillägg, Vortex blandning.

2. rekombinant spindel sidensolvation

Varning: hög uppvärmning och tryck genereras under solvatiseringen förfarandet. Lämplig personlig skyddsutrustning, särskilt skydds glasögon, långa ärmar och värme beständiga handskar krävs för denna process.

  1. Utför en slutlig kontroll av injektions flaskan, eller kärlet, locket för att säkerställa att det har varit stadigt och säkert åtdragna. Överför sedan den suspenderade rSSp-blandningen till en vanlig mikrougn.
    Obs: mikrovågsenheter inom effekt området på 700 till 1 500 watt, som har mindre invändig kammar kapacitet, och roterande plattformar rekommenderas för att ge bättre solvatiseringen villkor.
  2. Starta driften av mikrovågsugnen med 5 s spricker vid full effekt. Efter varje burst kort öppna dörren och försiktigt blanda/snurra flaskan för att förhindra sedimentering och bibehålla den suspenderade blandningen.
  3. Upprepa denna mikrovågs process tills blandningen och/eller lösningen har uppnått en temperatur på minst 130 ° c, mätt med en infraröd termometer direkt mot lösningen som innehåller delar av injektions flaskan. Upprepa denna process tills alla fasta partiklar har lösts upp fullständigt och inte längre syns.
    Anmärkning: det föreslås att flaskan och lösningen svalna ibland, särskilt om formuleringen har en hög koncentration av rSSp närvarande. Temperaturer som överstiger 200 ° c ökar risken för fel på Flask tätningen. Särskild uppmärksamhet måste också ägnas åt att förhindra att den överhettade blandningen/lösningen vidrör tätningen, vilket också leder till fel i Flask inne slutningen.
  4. Efter att ha lyckats lösa upp rSSp-blandningen i en lösning, kan lösningens temperatur och locket till injektions flaskan svalna under 100 ° c (Kok punkt) innan den öppnas.

3. hydrogels

  1. Förbered en hydrogel från lösningen efter att ta bort den från mikrovågsugnen och gör det möjligt att kyla och ställa. Kasta Hydrogelen i specifika geometrier innan den tillåts svalna helt.
    Obs: olika rSSps kommer att kräva varierande mängder gånger för att övergå till en hydrogel. Till exempel, MaSp2-liknande sekvenser tenderar att bilda vävnadsinväxt snabbare i jämförelse med MaSp1-liknande sekvenser. Proteinkoncentrationer, salthalt, och pH också direkt påverka hastigheten av över gången till en hydrogel.

4. svampar

  1. Förbered en rSSp-svamp genom att först låta den primära solverta lösningen bilda en hydrogel.
  2. Placera hydrogel i ett vatten bad, placera detta bad i frysen vid-20 ° c, och vänta tills badet är fryst helt.
  3. Slutföra svampen bildandet genom att ta bort den frusna Hydro gel och vatten bad från frysen och upptinning vid 25 ° c. Den resulterande svampen kan nu avlägsnas från det tinade vattnet.

5. Lyogel

  1. Förbered en rSSp Lyogel genom att direkt frysa en formad hydrogel, antingen med eller utan ett vatten bad, och överföra fryst hydrogel provet till en frystorkad (frys tork).
  2. Ta bort den sista frystorkade gel materialet från kärlet att fukt sublimering inträffade i.

6. filmer och beläggningar

  1. Använd någon av följande tre metoder: lösning gjutning, lösning sprutning, eller doppa beläggning för att producera filmer eller beläggningar av rSSp.
    1. Kasta den solubilized siden lösande in i/onto PDMS formerna om önskat forma.
    2. Häll och sprid 200 μL av film lösningen och låt detta torka innan du skalar bort dem från PDMS-substratet för testning eller behandling.
    3. Efter att ha tillåtit dessa att torka, ta bort de bildade filmerna för mekanisk provning eller efter behandling av filmerna för att förbättra de mekaniska egenskaperna.
  2. För att förbereda en beläggning, eller en film som inte kan avlägsnas från substratet, Använd antingen spray eller doppbeläggning för att producera ett tunt skikt.
    Anmärkning: att spraya päls, har detta protokoll funnit framgång med en Master airbrush modell färg spruta.
    1. Bilda en DIP beläggning genom att helt enkelt dränka substrat val i solubilized rSSp och upprepa efter torkning för att uppnå önskad tjocklek.
    2. Utför en första spraykappa innan du applicerar ett dopplack för att öka konsistensen och effektiviteten hos den slutliga beläggningen.

7. lim och klister

Anmärkning: bildandet av lim uppnås genom en av följande metoder.

  1. Lägg direkt till solubilized rSSp på ett substrat och sedan tillämpa ett andra substrat över toppen av lösningen. Kläm ihop bitarna ordentligt och torka proverna i en ugn med en minimitemperatur på 25 ° c i minst 16 timmar.
  2. Alternativt kan du spraya de två substrat ytorna med en spraybeläggning och sedan klämma ihop substrat.
  3. Tillämpningen av rSSp genom DIP-metoden för beläggning av substrat och stickning av substrat kan också användas för att förbereda och lim.

8. våt-spunnen fibrer

  1. Sätt in den lösningsbaserade Dope-lösningen i en koncentrisk spruta med Luer-lok-spetsen genom en 19 G glidnål. Mata ut luft bubblor och låt knark sitta vid Luer-lok änden av sprutan.
  2. Sätt i minst 25 mm PEEK slangar, inre diameter 0,01 tum, i PEEK slangar ett stycke finger tight beslag för 1/16 tum OD och 10/32 kon. Fäst denna montering på en PEEK slang till Luer-lok hona adapter.
    1. Sätt tillbaka den 19 gauge-nålen med den här uppsättningen på den laddade sprutan.
  3. Fyll ett högt, klart glas bad med 99% ren isopropanol att använda för koagulering bad.
    1. Fyll stretch bad, som ligger under stretch godets. Dessa kommer att ha 80:20 isopropanol: destillerat vatten i det första stretch badet, och 20:80 isopropanol: destillerat vatten i det andra stretchbadet.
  4. Ställ in det Godet stretch system så att den första Godet efter koagulering badet och den första Godet i den första stretch badet roterar i samma hastighet.
    1. Initiera den första sträckan genom att justera hastigheten på den sista Godet i stretch Bath 1, mitten övre Godet, och den första Godet i stretch Bath 2 till samma hastighet. Denna hastighet kommer att vara 2x så snabbt som den initiala fiber borttagnings hastighet.
    2. Initiera den andra sträckan genom att justera hastigheten på den sista Godet i stretch Bath 2, den sista övre Godet, och rullmaskinen till samma hastighet. Denna hastighet kommer att vara 2x så snabbt som den hastighet som används för den första sträckan eller 4x den ursprungliga fibrer avlägsnande hastighet.
    3. Placera nitrilhandskar på utsidan av mellanliggande godets att hålla fiber glider.
  5. Börja sakta extrudera lösningen i Koagulations badet. I ett automatiserat system som extrudering hastighet för att matcha en avverknings hastighet på 10 mm/s.
    1. Låt fiber extrudering att bli enhetliga innan du drar fibrerna ur badet med hjälp av en tunn metall krok eller pincett. Kontrol lera att ta bort fiber från badet skapat en slinga mellan PEEK slang spets och väg fibern lämnar badet badet.
  6. Guide den hämtade fibern genom serien av godets så att fibern är nedsänkt i stretch bad men torkning i luften mellan stretch bad och innan du går på en spole. Denna torkning uppnås genom högre placerade mellanliggande godets.
    Obs: fiber avlägsnande hastighet och/eller extrudering hastighet kommer att behöva justeras baserat på protein koncentrationen, tillsatser, och protein typ att tillåta riklig Koagulations tid utan att samla fibrer på botten av koagulering badet.
  7. Fäst den fullt sträckta fiber till spolen på rullmaskinen mekanismen med tejp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Från den beskrivna metoden för inlösning av rssp, en mängd olika material former kan uppnås som framgår av figur 1. Metoden för inlösning är att tillämpa värme och tryck, som genereras av en konventionell mikrovågsugn, till en SUS pension av rssp och vatten. När kritiska temperaturer och tryck uppnås, proteinet kommer att solubilize. Från denna solubilized rSSp lösning, de nödvändiga villkoren presenteras för sju material former: hydrogels, lyogels, svamp, lim, beläggningar, filmer och fibrer. Hydrogels bereds genom att låta solubilized rSSp svalna och naturligt själv associera. En Lyogel bereds genom frystorkad hydrogel. Svamp material bildas genom att frysa hydrogel medan den är nedsänkt i vatten. Filmer kan förberedas genom gjutning av solubilized rSSp på PDMS ytor (och andra mottagliga ytor) och torkas. Den PDMS tillåter filmen att enkelt tas bort för post behandlingar eller analys. Beläggningar och lim genereras med antingen spray eller dip metoder eller kombinationer av spray och dopp. Fibrer kräver den mest omfattande bearbetning genom att extrudera i ett koagulering bad och sedan seriellt stretching den råa fiber i post-spin stretch bad. Fibrer kan genereras genom extruderande till ett koagulering bad ensam. Men den bästa mekaniska förmåga i fibrerna kräver stretching i post-spin stretch bad3,7,8,9.

Figure 1
Figur 1: vattenbaserad solvatiseringen och rssp-material. Representativa bilder av de material som har formulerats med hjälp av denna inlösning metod för värme och tryck med rssp solveras i vatten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter rekombinant spindel silke proteiner renas de måste sedan beredas i en lösning som kan användas för material bildning. Genom att blanda frystorkad spindel silke protein med vatten och utsätta denna blandning för att mikrovågs bestrålning, för att generera värme och tryck, det möjligt att förbereda en rSSp lösning. En mängd olika material former kan produceras från denna enkla och effektiva metod för rSSp solubilization. Varje material måste vara unikt för berett och bearbetat för att uppnå önskat resultat och egenskaper. Med smärre ändringar av de ursprungliga formuleringarna, bildnings förhållanden och/eller bearbetnings parametrar kan varje material enkelt justeras med denna metod. Det finns fler former än presenteras här och genom ytterligare undersökningar av andra inom området, kommer dessa material fortsätta att utvecklas för att utforska nya material former med hjälp av denna teknik.

Förutsatt att lösningen består av främst vatten och protein (tillsatser kan utnyttjas för att fördröja gelation och förbättra stabiliteten i lösningarna) är möjligheten för funktionalisering med biologiskt aktiva komponenter kraftigt förbättrad i jämfört med HFIP-baserade rSSp-lösningar. En mängd olika komponenter, men inte uttömmande provtagning har inkluderats i dopat och därmed material former inklusive: antibiotika, antimykotika, heparin, Silvernanopartiklar, och integriner för celladhesion. Förutom tillsatser, flera rekombinant spindel silke proteiner av olika storlekar, sekvenser, naturer, och källor har framgångs rikt solverats med denna metod och används i bildandet av material som beskrivs i detta protokoll.

Ytterligare utvidga nyttan av denna metod för inlösning för inte bara rssp men alla proteiner solveras i denna metod, är att lösningarna är sterila förutsatt att temperaturen och trycket inuti flaskan eller kammaren är tillräckligt hög. Dessa lösningar kan vara och har tagits direkt till cell kultur utan att förorena kulturerna.

Om dessa material ska tas direkt in i in vivo-system måste endotoxinhalten åtgärdas. En trippel autoklav metod som förstör endotoxiner så att deras nivåer är på, eller lägre, den rekommenderade 0,25 EU/ml har nyligen rapporter ATS10. Medan autoklaven är användbart för att förstöra endotoxin, dess tryck och temperaturer brukar inte nå den kritiska temperatur eller tryck som krävs för att helt extraktionslösning alla rssp prover försökte hittills6. Detta nödvändiggör mikrovågsugnen eller en temperatur/tryck reaktor som krävs för att slutföra solvation.

Unikt, avlägsnande av endotoxin och solvatiseringen av materialet med hjälp av värme och tryck inte försämra proteinet eller den mekaniska förmågan hos den resulterande material form4,5,6,7. Det uppskattas att det sannolikt är en tippnings punkt för att få för högt tryck och/eller temperatur och för många cykler av värme och tryck som resulterar i försämrad mekanisk förmåga och/eller förstörelse av proteinet. Denna tippnings punkt kommer sannolikt att variera för den typ av rSSp solveras och, i viss mån, längden på rSSp utnyttjas. Men med denna grundläggande metod för solvatiseringen, kan flera scouting solvatiseringen experiment utföras i kort för att avgränsa lämplig solvatiseringen temperatur och tryck som krävs för specifika proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar ingen intresse konflikt.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja tacksamt erkänna finansiering från Utah Science and Technology Research (USTAR) initiativ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43, (42), 13604-13612 (2004).
  2. Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12, (7), 2488-2495 (2011).
  3. Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 , (4), 1418-1425 (2015).
  4. Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 , (8), 3158-3170 (2014).
  5. Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17, (11), 3761-3772 (2016).
  6. Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17, (11), 1955 (2016).
  7. Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1, (7), 557-584 (2015).
  8. Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35, (4), 1262-1266 (2002).
  9. Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96, (2), 170-189 (1977).
  10. Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8, (12166), 1-6 (2018).
Material bildning av rekombinant Spider Silks genom vattenhaltiga Solvation med hjälp av värme och tryck
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).More

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter