Isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek Silks malzeme oluşumu

Summary

Burada, su çözünebilir rekombinant örümcek ipek protein çözümleri ve bu çözümlerden oluşabilir malzeme formları üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Birçok örümcekler yedi tür Silks üretir. Örümceklerin altı, örümcekler tarafından üretildiğinde lif şeklindedir. Bu lifler su çözünmez. Örümcek Silks olağanüstü mekanik özelliklerini çoğaltmak için, örümcekler hem toprak ve yamyam olduğu gibi heterolog hosts üretilmelidir. Örümcek ipek Sentetik analogları da sulu çözümlerde çözünmez olma eğilimindedir. Böylece, rekombinant örümcek ipek araştırma büyük bir yüzdesi malzeme büyük ölçekli üretim için zararlı olan organik çözücüler güveniyor. Bizim grubun yöntemi bu rekombinant örümcek ipek su içine solvasyon zorlar. Bu proteinler bu ısı ve basınç yöntemi kullanılarak hazırlanırken, film, elyaf, sünger, hidrojel, lyogel ve yapıştırıcılar dahil olmak üzere rekombinant örümcek ipek proteinlerinin (rSSp) aynı çözeltisi ile çok çeşitli malzeme formları hazırlanabilir. Bu makalede, tek başına yazılı malzeme ve yöntemlerden daha kolay anlaşılır bir şekilde ayrılmış rSSp ve malzeme formları üretimini göstermektedir.

Introduction

Spider ipek güç, elastikiyet ve biyouyumluluk onların etkileyici kombinasyonu için malzeme bilim adamlarının ilgisini topladı. Liflerin yeniden oluşturulması geleneksel olarak araştırmanın itme gücü olmuştur. Bu çaba, su içinde rekombinant örümcek ipek proteini (rSSp) inçözünme yanı sıra geleneksel solvasyon teknikleri (chaotropik ajanlar ve deterjanlar) sulu solvasyon elde etmek için yetersizlik tarafından engel oldu. Daha fazla, rssp sürümleri solvating için geliştirilen teknikler tüm rssp türevleri üzerinde çalışmaz ve aynı zamanda önemli manipülasyon ve zaman genellikle protein kaybı^1,2sonuçları gerektirir. Bu büyük ölçüde alan 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFıP) hangi lifleri ve diğer sınırlı malzeme formları oluşturmak için bir çözücü olarak kullanılarak sonuçlandı. Tüm bilinen rSSp HFıP çözünür olduğu avantajı, her araştırma grubu arasında veri bütünlüğü sağlar. Dezavantajı HFıP pahalı ve sağlık endişeleri ve çevresel hususlar nedeniyle ölçeklemek için pratik olmayan bir toksik solvent olduğunu.

RSSp 'ye yeni bir yaklaşım, sert organik solvent HFıP ve seçici rSSp solvasyon için çalıştı diğer teknikler arasındaki teknolojik boşluğu köprülenmiş geliştirilmiştir. RSSp ve suyun süspansiyonları için özel ısıtmalar ve basınçların kombinasyonu uygulandı. Sonuçlar, rSSp 'nin yanı sıra yüksek protein konsantrasyonlarının% 100 solvasyonu ve geri kazanımı gibi; çeşitli malzeme formları HFIP veya diğer organik çözücüler^3,4,5,6kullanılarak ulaşılamayan tüm bu formülasyonlardan mümkün olduğu belirlendi. Bu yaklaşımın amacı, daha sonra çeşitli malzeme formları üretimi için kullanılabilecek sulu bir çözelti içinde arıtılmış ve kurutulmuş rekombinant örümcek proteinlerini verimli ve kolay bir şekilde çözünsündür.

Elyaflar, Filmler, kaplamalar, yapıştırıcılar, Hidrojeller, lyogels, microspheres ve sünger malzemeleri, bu yöntemi kullanarak aynı sulu rSSp çözümünden kolayca başarılır. Bu yöntemin devam eden evriminin, sadece ek rSSp ile değil, diğer proteinler ile, yeni malzeme formları ve alternatif protein arıtma ve çözünme caddeleri yol açabilir.

Protocol

1. liyofilize protein stokları rekombinant örümcek ipek karışımı hazırlama

1. İstenilen malzeme oluşumları için gerekli formülü ve hacmi belirleyin. Tipik formülasyonlar% 3 ' ten (w/v)% 15 ' e kadar (w/v) değişir. Bu seçimi kullanarak, uygun rSSp, konsantrasyonları ve oranları hesaplayın.
   1. Bu protokolde açıklanan her malzemeyi hazırlamak için aşağıdaki ilgili formülasyonları kullanın: hidrogeller/süngerler/lyogels,% 6 (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; Filmler/kaplamalar,% 5 (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; Yapıştırıcılar,% 12 (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; lifleri, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Not: çoğu formülasyonları özel formlar ve malzemeler için daha iyi monte olsa da, genellikle örtüşebilir formülasyonlar geniş bir yelpazede vardır. Ayrıca, son rSSp malzemeleri de istenilen özellikleri üretmek için oluşum ve işleme sırasında uyarlanmış olabilir. Genellikle, her protein uygun veya yararlı parametreler içine soruşturma gerektirecektir.
2. Bir kauçuk astarlı vida kapağı ile temiz ve yeni 8 ml otoklavlanabilir borosilikat cam kültür şişe seçin.
3. Kapağı çıkarın ve boş şişeyi analitik bir denge üzerine yerleştirin. Denge sıfır kütle okur böylece boş şişe kütlesi Dara.
4. İstenilen lizofilize rSSp tozu her özel malzeme için boş şişeye ekleyin.
   1. Her malzeme için her protein türünün bu belirli kütlelerini kullanın, 2 mL çözüm hazırlarken: hidrogeller/süngerler/lyogels, 60 mg MaSp1 ve 60 mg MaSp2; Filmler/kaplamalar, 80 mg MaSp1 ve 20 mg MaSp2; Yapıştırıcılar, 120 mg MaSp1 ve 120 mg MaSp2; lifler, 200 mg MaSp1 ve 50 mg MaSp2.
5. İstenilen miktarda ultra saf suyu, en az 2 ml, zaten ağırlıklı rssp tozları içeren şişeye ekleyin.
   Not: tüm solvasyon prosedürleri için en az 2 mL 'Lik bir hacim önerilir.
6. Mühür şişe kap ve briskly bir dağınık oluşturmak için içeriği Vortex, ve homojen, şimdi solvasyon prosedürü için hazır olan rssp karışımı. Sonication veya pervane karıştırma gibi ek homojenizasyon yaklaşımlar ile istihdam edilebilir, ya da ek olarak, Vortex karıştırma.

2. rekombinant örümcek ipek solvasyon

DIKKAT: solvasyon prosedürü sırasında yüksek ısıtmalar ve baskılar üretilir. Bu süreç için uygun kişisel koruyucu ekipmanlar, özellikle gözlük, uzun kollu ve ısıya dayanıklı eldivenler gereklidir.

1. Bu sıkıca ve güvenli bir şekilde sıkılaştırılmış olduğundan emin olmak için şişe, veya gemi, kap son bir kontrol gerçekleştirin. Ardından, askıya alınan rSSp karışımını geleneksel bir mikrodalga fırınına aktarın.
   Not: 700 ' den 1.500 watt 'a kadar güç aralığında mikrodalga üniteleri, daha küçük iç oda kapasiteleri bulunan ve dönen platformlar daha iyi besleme koşulları sağlamak için tavsiye edilir.
2. Tam güce sahip 5 s patlamaları ile mikrodalga çalışma başlayın. Her patlama kısa bir süre sonra kapıyı açın ve dikkatle Mix/girdap önlemek için şişe yerleşmek ve askıya karışımı korumak.
3. Karışım ve/veya çözelti, bir kızılötesi termometre ile doğrudan şişenin bölümlerini içeren çözüme karşı ölçülen en az 130 °C sıcaklık elde edene kadar bu mikrodalga işlemi tekrarlayın. Tüm katı partiküller tamamen çözülmüş ve artık görünmez olana kadar bu işlemi yineleyin.
   Not: Bu şişe ve çözüm zaman zaman serin izin vermek için önerilir, özellikle formülasyon rSSp mevcut yüksek bir konsantrasyon varsa. 200 °C ' yi aşan sıcaklıklar şişe mühür yetmezliği riskini arttırır. Süper ısıtılmış karışımı/çözeltinin mührü dokunmasını önlemek için, ayrıca şişe muhafaza arızasına neden olacak özel dikkat da verilmelidir.
4. Bir çözüme rSSp karışımı başarıyla solvating sonra çözeltinin sıcaklığı ve şişe kapağı 100 altında soğutmak için izin ° c (kaynama noktası) açmadan önce.

3. Hidrojeller

1. Mikrodalga çıkarttıktan sonra çözeltinin bir hidrojel hazırlayın ve serin ve ayarlamak için izin. Hidrojel tamamen serin izin vermeden önce belirli geometriler içine cast.
   Not: farklı rSSps bir hidrojel geçiş zaman çeşitli miktarlarda gerektirir. Örneğin, MaSp2 benzeri diziler MaSp1 benzeri dizilere kıyasla daha hızlı Hidrojeller oluşturmak eğilimindedir. Protein konsantrasyonları, tuzluluk ve pH da doğrudan bir hidrojel geçiş hızını etkiler.

4. süngerler

1. İlk olarak bir hidrojel oluşturmak için birincil solvated çözüme izin vererek bir rSSp süngerleri hazırlayın.
2. Hidrojel su küvetine yerleştirin, bu banyosu buzdolabına-20 °C ' de yerleştirin ve banyo tamamen donduruluncaya kadar bekleyin.
3. Dondurulmuş hidrojel ve su banyosunun dondurucudan çıkarılması ve 25 °C ' de çözünmesi ile sünger oluşumu sürecini tamamlayın. Ortaya çıkan sünger artık çözülmüş sudan kaldırılabilir.

5. lyogel

1. Bir rssp lyogel doğrudan oluşturulan bir hidrojel dondurarak hazırlamak, ya da bir su banyosu olmadan, ve bir kurutucu dondurulmuş hidrojel örnek transfer (dondurma kurutma makinesi).
2. Nem süblimasyon oluştuğu geminin son liyofilize jel malzeme çıkarın.

6. Filmler ve kaplamalar

1. Üç aşağıdaki yöntemlerden birini kullanın: çözüm döküm, çözüm püskürtme, veya daldırma kaplama film veya rSSp kaplamaları üretmek için.
   1. İstenen şeklin PDMS formları içine/üzerine çözünen ipek çözeltisi cast.
   2. Film çözeltisi 200 μL dökmek ve yaymak ve test veya tedavi için PDMS substrat onları soyulmadan önce bu kuru izin.
   3. Bunların kurumasına izin verdikten sonra, mekanik testler için oluşturulan filmleri çıkarın veya mekanik özellikleri iyileştirmek için filmleri sonrası tedavi edin.
2. Bir kaplama hazırlamak için, veya substrat kaldırılamaz bir film, ince bir film tabakası üretmek için ya sprey veya daldırma kaplama kullanın.
   Not: ceket sprey Için, bu protokol bir Master Airbrush modeli boya püskürtücü ile başarı buldu.
   1. Sadece çözünen rSSp içine seçim substrat alt ve istenen kalınlığı elde etmek için kurutduktan sonra tekrarlayın bir daldırma kaplama formu.
   2. Son kaplama tutarlılığı ve etkinliğini artırmak için bir daldırma ceket uygulamadan önce bir ilk sprey ceket gerçekleştirin.

7. yapıştırıcılar

Not: yapıştırıcıların oluşumu aşağıdaki yöntemlerden biri aracılığıyla elde edilir.

1. Doğrudan bir substrat üzerine çözünen rSSp ekleyin ve sonra çözümün üst kısmında ikinci bir substrat uygulayın. Parçaları birlikte sıkıca kelepçe ve daha sonra en az 16 h için 25 °C asgari sıcaklık ile bir fırında örnekleri kurutun.
2. Alternatif olarak, bir sprey kaplama ile iki substrat yüzeyleri sprey ve sonra birlikte substratlar kelepçe.
3. RSSp 'yi substrat kaplamasının daldırma yöntemiyle uygulanması ve substratlar yapışmasını hazırlamak ve yapıştırıcı için de kullanılabilir.

8. ıslak-spun lifleri

1. Bir 19 G kayma iğne ile Luer-Lok ucu ile bir eşmerkezli şırınga içine çözünen uyuşturucu solüsyonu yükleyin. Hava kabarcıklarını çıkarın ve uyuşturucunun şırınganın luer-Lok ucunda otursun.
2. En az 25 mm PEEK boru, iç çapı 0,01 inç, PEEK tüpünün tek parça parmak sıkı bağlantı parçaları içine 1/16 inç OD ve 10/32 koni takın. Bu bağlantı elemanı, Luer-Lok dişi adaptörüne bir PEEK borusu takın.
   1. 19 kalibrelik iğneleri, yüklenmiş şırıngayı bu kurla değiştirin.
3. Doldurmak bir uzun boylu, açık cam banyo ile 99% saf izopropanol Koagülasyon Banyosu için kullanmak.
   1. Streç godets altında bulunan streç Banyoları doldurun. Bu 80:20 isopropanol olacak: ilk streç banyoda distile su, ve 20:80 isopropanol: ikinci streç banyoda distile su.
4. Koagülasyon banyo ve ilk streç banyoda ilk Godet sonra ilk Godet aynı hızda döner gibi Godet streç sistemi ayarlayın.
   1. Streç banyo 1, orta üst Godet ve aynı hızda streç banyo 2 ilk Godet son Godet hızları ayarlayarak ilk streç başlatın. Bu hız, ilk fiber kaldırma hızı kadar hızlı 2x olacaktır.
   2. Streç banyo son Godet hızları ayarlayarak ikinci streç başlatın 2, son üst Godet, ve aynı hızda sarıcı. Bu hız, ilk streç veya 4X ilk lifler kaldırma hızı için kullanılan hız kadar hızlı 2x olacaktır.
   3. Lif kayma tutmak için ara Godeli dışında nitril eldiven yerleştirin.
5. Çözümü yavaşça pıhtılaşma banyosuna ekstrüze etmeye başlayın. Otomatik bir sistemde Ekstrüzyon hızını 10 mm/s kaldırma hızına uyacak şekilde ayarlayın.
   1. Fiber ekstrüzyon ince bir metal kanca veya forseps kullanarak banyo lifleri çekmeden önce üniforma haline izin verin. Banyosundan fiber kaldırarak doğrulamak PEEK Boru ucu ve banyo banyo bırakarak fiber yolu arasında bir döngü oluşturdu.
6. Bir makara üzerine gitmeden önce lifin streç banyoları içinde batık ama streç banyoları arasında havada kurutulması gibi Godeli serisi ile alınan fiber Kılavuzu. Bu kuruma yüksek yerleştirilmiş ara godets tarafından elde edilir.
   Not: fiber kaldırma oranı ve/veya ekstrüzyon oranı protein konsantrasyonu, katkı maddeleri, ve protein türü üzerinde koagülasyon banyosunun alt lifleri havuzu olmadan bol pıhtılaşma süresi izin göre ayarlanması gerekir.
7. Bant kullanarak sarıcı mekanizması üzerinde biriktirme için tam olarak gergin fiber takın.

Representative Results

RSSp 'nin belirtilen çözünme yönteminden, Şekil 1' de görüldüğü gibi çeşitli malzeme formları elde edilebilir. Çözünme yöntemi, geleneksel bir mikrodalga tarafından oluşturulan ısı ve basıncı, rSSp ve suyun süspansiyonunu uygulamak için kullanılır. Kritik sıcaklıklar ve baskılar elde edildiğinde, protein çözünecek. Bu çözünen rSSp çözümünden, gerekli koşullar yedi malzeme formları için sunulmaktadır: Hidrojeller, lyogels, sünger, yapıştırıcılar, kaplamalar, Filmler, ve lifler. Hydrogels soğutmak ve doğal Self-Associate için çözünen rSSp izin vererek hazırlanır. Bir lyogel hidrojel lyophilizing tarafından hazırlanır. Sünger malzemesi su içine daldırırken hidrojel dondurarak oluşur. Filmler, çözünen rSSp 'yi PDMS yüzeylerine (ve diğer etkin yüzeylere) döküm ve kurutularak hazırlanabilir. PDMS film sonrası tedaviler veya analiz için kolayca kaldırılmasına olanak sağlar. Kaplamalar ve yapıştırıcılar sprey veya daldırma yöntemleri veya sprey ve daldırma kombinasyonları kullanılarak üretilir. Elyaflar bir pıhtılaşma banyosu içine ekstrüzyon ve sonra seri olarak post-spin streç banyoları ham fiber germe en kapsamlı işleme gerektirir. Lifleri tek başına bir pıhtılaşma banyosu içine ekstrüzyon tarafından oluşturulabilir. Ancak, liflerin en iyi mekanik yeteneği Post-spin streç banyoları^3,7,8,9germe gerektirir.

Resim 1: sulu solvasyon ve rSSp malzemeleri. RSSp ile ısı ve basınç bu çözünme yöntemi kullanılarak formüle edilmiş malzemelerin temsili resimleri su içinde solvated. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

Rekombinant örümcek ipek proteinleri arıtıldıktan sonra, malzeme oluşumu için kullanılabilecek bir çözelti içinde hazırlanmalıdır. Likofilize örümcek ipek proteini su ile karıştırarak ve bu karışımı mikrodalga ışınlarına maruz bırakarak, ısı ve basınç oluşturmak için, rSSp çözümünü hazırlamak mümkün. Bu basit ve verimli rSSp çözünme yönteminden çok çeşitli malzeme formları üretilebilmektedir. Her malzemenin istenilen sonuç ve özellikleri elde etmek için benzersiz bir şekilde hazırlanması ve işlenmesi gerekir. İlk formülasyonlar, oluşum koşulları ve/veya işleme parametrelerinde küçük değişikliklerle, her malzeme bu yöntem kullanılarak kolayca ayarlanabilir. Burada sunulandan daha fazla form vardır ve bu alanda başkaları tarafından daha fazla soruşturma yapılarak bu malzemeler bu tekniği kullanarak yeni malzeme formlarını keşfetmek için gelişmeye devam edecektir.

Çözümün öncelikle su ve proteinden oluşması koşuluyla (katkı maddeleri jelleşme gecikmesi ve çözümlerin stabilitesini artırmak için kullanılabilir) biyolojik olarak aktif bileşenlerle işlevselleşme olasılığı büyük ölçüde geliştirildi HFıP tabanlı rSSp çözümlerine kıyasla. Çeşitli bileşenler, ancak kapsamlı örneklere dahil edilmiştir ahmaklar ve böylece malzeme formları dahil: antibiyotik, Antimikotik, heparin, gümüş nano opartiküller, ve hücre yapışma için integrinler. Katkı maddelerine ek olarak, çeşitli boyutlarda, sıraların, doğanın ve kaynakların birden fazla rekombinant örümcek ipek proteinlerini bu yöntemle başarıyla yeniledi ve bu protokolde açıklanan malzemelerin oluşumunda kullanılır.

Daha fazla sadece rSSp değil, bu yöntem içinde solvated tüm proteinler için çözünme Bu yöntemin kullanışlılığı genişleyen, çözeltiler steril olduğu sıcaklık ve basınç şişe veya oda içinde yeterince yüksek olduğu sağlanır. Bu çözümler olabilir ve kültürler kontamine olmadan doğrudan hücre kültürünü alınmıştır.

Bu materyaller doğrudan in vivo sistemlere alınırsa, endotoksin seviyeleri ele alınmalıdır. Endotoksinleri yok eden üçlü otoklav yöntemi, böylece seviyeleri veya aşağıda, önerilen 0,25 AB/mL son zamanlarda¹⁰bildirildi. Otoklav endotoksini yok etmek için yararlıdır iken, basınç ve sıcaklıklar genellikle kritik sıcaklık ya da tamamen rSSp numunelerin tüm solvate için gerekli basınç ulaşmak için başarısız oldu⁶Tarih çalıştı. Bu, mikrosallama veya bir sıcaklık/basınç reaktörü, solvasyon tamamlamak için gerekli gerektirir.

Benzersiz olarak, endotoksin ve ısı ve basınç kullanarak malzemenin solvasyon kaldırılması protein veya sonuç malzeme formu mekanik yeteneği düşürmez^4,5,6,7. Bu büyük olasılıkla çok fazla basınç ve/veya sıcaklık ve ısı ve basınç çok fazla döngüsü yüksek elde bir ipucu noktası olduğunu takdir edilir bozulmuş mekanik yetenek ve/veya protein imha sonuçlanır. Bu devirme noktası muhtemelen rSSp türü için değişir ve bir dereceye kadar, rSSp kullanılan uzunluğu farklılık gösterecektir. Ancak, bu temel solvasyon yöntemi ile, belirli proteinler için gerekli olan uygun solvasyon sıcaklığını ve baskılarını tanımlamak için kısa sürede birkaç keşif işlemleri yapılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60