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Bioengineering

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59324
Automatic Translation
1
1Biology Department, Luminex Corporation

Summary

インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。

Abstract

インビトロ微小核(MN)アッセイは、細胞毒性およびゲノキシビリティを評価するためにしばしば使用されますが、手動顕微鏡検査を介してアッセイを採点することは面倒であり、スコアラー間の変動による結果の不確実性を引き起します。これを改善するために、自動スライドスキャン顕微鏡と従来のフローサイトメトリー法が導入され、スコアラーバイアスを除去し、スループットを向上させようとしています。しかし、これらの方法には、細胞の細胞質を可視化できない、フローサイトメトリーによる視覚的なMN検証や画像データストレージの欠如など、独自の固有の制限があります。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、これらの制限を克服する可能性を秘めています。MIFCは、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と、従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたものです。さらに、収集されたすべての画像は、線量固有のファイルに格納することができます。本論文では、MIFC上で完全に自動化されたMNアッセイを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。ヒトリンパ芽球体TK6細胞は、低対性溶液(75mM KCl)を用いて拡大し、4%ホルマリンで固定し、核含有量をHoechst 33342で染色した。すべてのサンプルはMIFC上で懸濁液中で実行され、アッセイに必要なすべての主要事象の高解像度画像の取得を可能にした(例えば、MNの有無にかかわらず二重化細胞、および単核化細胞および多核化細胞)。画像はMIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別、分類、列挙され、細胞毒性と無毒性の両方の自動スコアリングが可能でした。結果は、MIFCを使用してインビトロMNアッセイを行うことを示し、TK6細胞の曝露後の溶媒対照と比較した場合、MN周波数の統計的に有意な増加をいくつかの異なるレベルで検出することを可能にするミトマイシンCおよびコルチシンは、マンニトールへの曝露後にMN周波数の有意な増加が観察されない。

Introduction

インビトロマイクロ核(MN)アッセイは、化学的および医薬品開発、ならびに様々な暴露者の間でヒトバイオモニタリングなどの研究のいくつかの分野におけるスクリーニングツールとして細胞毒性および登録毒性を評価するために一般的に使用される試験である。環境、職業またはライフスタイルの要因1、2、3.MNは、2つの主要な娘核の1つに組み込まれない細胞分裂中に生成された染色体断片または全染色体からなる。テロ相に続いて、この染色体材料は、主核2のいずれかから分離された細胞質内の個々の丸みを帯びた体に形成される。したがって、MNはDNA損傷の代表であり、ゲノム毒性試験4のエンドポイントとして長年使用されてきた。MNを測定する最も適切な方法は、サイトカインシスブロック微小核(CBMN)アッセイである。CBMNアッセイを用いて、ビヌクレス細胞(BNC)におけるMNの周波数は、試料にサイトチャラシンB(Cyt-B)を組み込むことによって得点することができる。Cyt-Bは核分裂を可能にするが、細胞分裂を防ぎ、MNのスコアリングを5回しか分割していないBNCに制限する。

顕微鏡検査とフローサイトメトリーの両方を使用するプロトコルが開発され、検証され、インビトロMNアッセイ6、7、8、9、10を実行するために日常的に使用されています。11,12,13,14.顕微鏡検査は、MNが正当であることを視覚的に確認できることから利益を得るが、時間がかかり、スコアラー15間の変動が起こりやすい。これに対処するために、自動顕微鏡検査法は、スライドをスキャンし、核とMN 16、17、18、19の画像をキャプチャするために開発されましたが、細胞質を視覚化することはできません。MN が実際に特定のセルに関連付けられているかどうかを判断するのは困難です。さらに、これらの方法は、Cyt-B9を用いた場合の細胞傷害性の計算に必要な多核化(POLY)細胞(三角および四分円細胞を含む)を同定することが困難である。MNアッセイを行うために開発されたフローサイトメトリー法は、蛍光と前方および側散乱強度を用いて、lysis20,21に続いて細胞から解放された核とMNの両方の集団を同定する。 、22.これにより、数分で数千セルからデータを取得することができ、自動分析23を可能にします。しかし、細胞を視覚化できないと、スコア付けされたイベントが本物であることを確認できなくなります。さらに、細胞膜を溶解すると、Cyt-Bの使用を阻害するだけでなく、染色体凝集体やアポトーシス体などの他の破片を含む懸濁液を作成し、これらをMN24と区別する方法はありません。

これらの制限に照らして、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー(MIFC)は、顕微鏡検査の高解像度蛍光画像と従来のフローサイトメトリーの統計的堅牢性と速度を組み合わせたMNアッセイを実行するのに理想的なシステムです。MIFCでは、すべての細胞が流体系に導入され、流動細胞キュベットの中心に動的に集動されます。すべての細胞の直交照明は、明視野(BF)発光ダイオード(LED)、サイド散乱レーザーおよび(少なくとも)1つの蛍光レーザーの使用を使用することによって達成される。蛍光光子は、3つの(20x、40xまたは60x)高い数値開口対物レンズのいずれかによって捕捉され、スペクトル分解要素を通過します。フォトンは、電荷結合デバイス (CCD) カメラに焦点を当てて、フロー セルを通過するすべてのセルの高解像度画像を取得します。ぼかしやストリークを避けるために、CCDは、流れのセルの速度と同期して行から行下にピクセルコンテンツを転送することにより、オブジェクトを追跡する時間遅延統合(TDI)モードで動作します。ピクセル情報は、ピクセルの最後の行から収集されます。スペクトル分解と組み合わせたTDIイメージングにより、フローセルを通過するすべての細胞から最大12枚の画像(2BF、10蛍光)を同時に捕捉できます。キャプチャされたすべての画像はサンプル固有のデータファイルに保存されるため、MIFCデータ解析ソフトウェアを使用していつでも分析を実行できます。最後に、データファイルは、すべての二変量プロット上のセルラー画像とドット間のリンクを保持します。これは、従来の二変量プロット上の任意のドットを強調表示することができ、対応するBFおよび蛍光画像が25に表示されることを意味します。

近年、MIFCベースの方法は、トリアージ放射線バイオドシメトリー26、27、28、29、30、31および遺伝的両方のMNアッセイを行うために開発された。毒物学32、33テスト。本研究は、主核、MNおよび細胞質の細胞画像が他の方法26よりも高いスループットで画像化できることを実証した。MONOセル、NNC(MNの有無にかかわらず)、POLYセルを含む解析に必要なすべての細胞タイプは、MIFCデータ解析ソフトウェアで自動的に識別することができ、Fenechらによって開発されたスコアリング基準の実装は、によって達成されます。様々な数学的アルゴリズム6、34の使用。バイオドシメトリーの結果は、BNC29あたりのMNの速度を定量化する際に文献の他の自動化された方法から得られたものと用量応答較正曲線が大きさで類似していることを示した。さらに、毒物学の最近の研究は、MONO細胞、BNC(MNの有無にかかわらず)およびPOLY細胞の画像がMIFCを使用して自動的に捕捉、同定、分類、列挙できることを実証しました。プロトコルおよびデータ分析は、TK6細胞をいくつかのクラストゲンおよびアヌゲン32に暴露した後、細胞毒性および無毒性の計算を可能にした。

本論文で提示されるプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行う方法について説明する。この作業で使用されるサンプル処理技術は、単一のサンプルを処理するのに2時間未満で、他の方法と比較して比較的簡単に実行できます。MIFC 解析ソフトウェアのデータ分析は複雑ですが、このホワイト ペーパーで説明した手順に従って、分析テンプレートの作成は数時間で完了できます。さらに、テンプレートが作成されると、それ以上の作業を行わずに、収集されたすべてのデータに自動的に適用できます。このプロトコルは、TK6細胞をクラストゲンおよびアニューゲンに暴露するために必要なすべてのステップを概説し、細胞を培養、処理、染色する方法を説明し、MIFCを用いて高解像度画像を取得する方法を示す。さらに、本論文では、細胞毒性と無毒性の両方を計算する目的でMONO細胞、BNC、およびPOLY細胞を自動的に同定し、スコア付けするためにMIFCソフトウェアのデータを分析するための現在のベストプラクティスを示す。

Protocol

1. 培養培地の調製とTK6細胞の培養

注:このプロトコルで使用される一部の化学物質は有毒です。皮膚Bを吸入、嚥下または接触することは致命的なことができます。実験室用コートと2組のニトリル手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。取り扱い後は手をよく洗ってください。ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入または飲み込んだ場合に有毒です。目、呼吸器系、皮膚を刺激する。吸入や皮膚接触により感せが生じる可能性があります。目に深刻な損傷を与える危険性があります。それは潜在的な発癌物質です。

  1. 1x RPMI培養培地の565mLを調出す。MEM非必須アミノ酸(100x)、5mLのピルビン酸ナトリウム(100mM)、5mLのペニシリン連鎖筋ミン-グルタミン(100倍)、50mLの胎児ウシ血清(FBS)を1x RPMI10の500mLボトルに加えます。バイオセーフティキャビネットで培地を準備し、2-8 °Cで保存します。TK6細胞に添加する前に培地を37°Cに加熱します(材料の表を参照)。
  2. TK6細胞の1mLを10mLの培地で解凍(DMSOで-80°Cで貯蔵)。細胞を200 x gで8分間遠心分離し、上清を吸引する。細胞を50mLの培体に移し、37°C、5%CO2でインキュベートする。TK6細胞の倍増時間は~12~18時間と変化し、細胞が最大増殖速度に達するためには少数の(3または4)の通過が必要になります(材料の表を参照)。
  3. 培養100mLの細胞を〜7〜8 x 105細胞/mLの濃度にする。

2. クラストゲンおよび/またはアヌゲンおよびサイトチャラシンBの調製

  1. 所望のクラストゲンおよびアヌゲンの適切なストック濃度を調調す。例えば、ミトマイシンCの場合、無菌水の10mLに完全な2mgボトルを溶解し、200 μg/mLの最終ストック濃度を達成します。ミトマイシンCは4°Cで3ヶ月間保存できます(材料の表参照)。
  2. 実験日に、滅菌水またはDMSOで希釈する場合、所望の暴露濃度よりも10倍または100倍高い所望の化学物質の希釈をそれぞれ調製する。
  3. ミトマイシンCの場合は、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、および5.0 μg/mLの滅水で3mL希釈を調出します。コルチシンの場合は、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、および 0.5 μg/mL の滅水で 3 mL 希釈を調出します。最後に、マンニトールの場合は、5、10、20、30、40、および50mg/mLの無菌水で3 mL希釈を調出します。
  4. 5mgボトルをDMSOの25mLに溶解することにより、サイトカラシンBの200 μg/mLストック濃度を調出します。サイトチャラシンBは、数ヶ月間-20°Cで保存することができる。

3. クラストゲンおよび/またはアヌイゲンへの細胞の暴露

  1. 所望の化学物質の1 mL(例えばミトマイシンC)をT25フラスコで〜7-8x105細胞/mLで9mLの細胞に加える。対照サンプルの場合は、滅菌水を1mL加えます。フラスコを37°C、5%CO2インキュベーターに3時間置きます。
    注:DMSOで化学物質を希釈する場合は、各フラスコに100 μLの化学物質のみを追加し、コントロールに100 μLのDMSOを追加します。各フラスコには 9.900 mL のセルが含まれている必要があります。
  2. 3時間後、インキュベーターからフラスコを取り出し、細胞を15 mLポリプロピレンチューブに移します。遠心分離機を200xgで8分間、上清を吸引し、合計10mLの新鮮培養培地を含む新しいT25フラスコに細胞を移移す。 各フラスコに150 μLのストック濃度(200 μg/mL)を追加し、最終的な濃度を3μg/mLにします。
  3. フラスコを37°C、5%のCO2インキュベーターに戻し、OECDガイドライン9で推奨されているように、1.5-2.0倍の回収時間に相当します。本研究で使用したTK6細胞の回収時間は24時間であった。
    注:ここで使用したTK6細胞の倍増時間は15時間で、回収時間は24時間(1.6倍)であった。回収時間が1.5倍未満の場合、BNCの数に影響を与える高用量にさらされたサンプルの増殖が減少します。歪んだ細胞毒性の計算。

4. DNA含有量の固定および標識のためのバッファーの準備(材料の表を参照)

  1. 超純水の500 mLに2.79gを加えて塩化カリウム(KCl)の75mMを調調します。200 μm フィルターを通して磁気攪拌機と滅菌フィルターを使用して 5 分間溶液をかき混ぜます。75 mM KCl溶液は、数ヶ月間4°Cで保存することができます。
  2. 実験に十分な量の4%ホルマリンを準備し、各サンプルに合計2.1 mLを添加する必要があることを予測します。例えば、4%ホルマリンの10mLを調製するために、Ca2+またはMg2+(PBS)を使用せずに1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水溶液の6mLに10%ホルマリンストックの4 mLを添加する。この4%ホルマリンは、数週間室温で保存することができる。
  3. 1x PBSの500 mLボトルにFBSの10 mLを加えることによって、洗浄バッファーの510 mL(1X PBSで2%FBS)を準備します。
  4. 1X PBSの9,900 μLにストック濃度(1mg/mL)の100 μLを加えて、100 μg/mLの100 μl/mLのホーチスト33342の濃度を調べ取ります。Hoechst 33342溶液は、数ヶ月間4°Cで保存することができます。

5.サンプル処理:低トン性腫脹、固定、細胞計数および標識DNA含有量

  1. 回収期間の終わりに、インキュベーターからすべてのフラスコを取り出し、すべてのサンプルを15 mLポリプロピレンチューブに移します。8分間200 x gですべてのサンプルを遠心分離します。
  2. 上清を吸引し、細胞を再中断し、75 mM KClの5 mLを3回反転して穏やかに混合し、7分間4°Cでインキュベートする。
  3. 各サンプルに4%ホルマリンの2 mLを加え、反転3回で穏やかに混合し、4°Cで10分間インキュベートする。このステップは「ソフト固定」として機能します。
  4. 200 x gですべてのサンプルを8分間遠心分離し、上清を吸引し、20分間4%ホルマリンの100 μLで再中断します。このステップは「ハード固定」として機能します。
  5. 洗浄バッファーと遠心分離機の5 mLを200 x gで8分間追加し、上清を吸引し、100 μLの洗浄バッファーで再中断します。
  6. すべてのサンプルを1.5 mLマイクロ遠心管に移します。
  7. 各サンプルのセル数を実行して、サンプルごとのセル数を決定します。サンプルは非常に濃縮され、正確な数を得るためには1x PBS(990 μLのサンプルの10 μL)で1:100希釈が必要になる可能性が高くなります。
    注: この時点では、ヘモサイトメーターを使用してセルカウントを実行することをお返しを行うことをお知めします。KCl を追加すると、細胞質が半透明に見え、自動セル カウンタがそれらを認識しにくくなります。また、自動カウンターは、そのサイズのために多核細胞をスコアリングすることが困難です。
  8. MIFC上ですぐにサンプルを実行しない場合は、数日間4°Cで保存することができます。サンプルを実行する準備ができたら、各サンプルに1x106セル/mLあたり100 μg/mLの5 μLを追加します。また、サンプルの100 μLあたりのRNaseの500 μg/mLの10 μLを加え、50 μg/mLの最終濃度を追加します。37°C、5%CO2で30分間サンプルをインキュベートします。
  9. マイクロ遠心分離機は、すべてのサンプルを200 x gで8分間使用し、ピペットを使用して、約30μLを残して上清を除去します。MIFCで実行する前に、ピペットを使用してすべてのサンプルを再中断し、チューブに気泡がないことを確認します。渦を起さしないでください。

6. MIFCの開始と調整

  1. シース、システムキャリブレーション試薬、デバブラー、クレンザー、滅菌容器がいっぱいで、廃棄物タンクが空であることを確認します。システムの電源を入れ、MIFC ソフトウェア アイコンをダブルクリックします。[スタートアップ] ボタンをクリックし、[すべてのキャリブレーションとテストを開始] チェック ボックスがオンであることを確認します。これにより、システムがフラッシュされ、シースとシステムキャリブレーション試薬が読み込まれ、システムが校正されます (材料の表を参照)。

7. MIFCでのサンプルの実行

注: このセクションでは、2 カメラ MIFC の使用を前提としています。1カメラMIFCを使用する場合は、取得中にプロットを作成するための補足1 - フルプロトコル、セクション7を参照してください。

  1. MIFC データ取得ソフトウェアを起動します(「材料の表」を参照)。図 1は、計測器の設定を示しています。405 nm レーザーをオンにし、レーザーパワーを 10mW (A) に設定します。他のすべてのレーザー(SSCを含む)を無効にし、BFをチャンネル1と9(B)に設定します。倍率スライダが 60x (C) に設定され、高感度モード (D) が選択され、画像ギャラリーにチャンネル 1、7、9 のみが表示されていることを確認します。
  2. 散布図アイコンをクリックします。[すべての母集団]を選択し、X 軸の[面積 M01]を選択し、Y 軸のアスペクト比 M01を選択します。[正方形の領域] アイコンをクリックし、1 つのセルの周囲に領域を描画します。この領域に単一のセルに名前を付けます。プロットを右クリックし、[地域]を選択します。単一セル領域をハイライト表示し、X 座標を 100 と 900 に変更し、y 座標を 0.75 と 1 に変更します (図 1I)。
  3. 散布図アイコンをクリックします。親母集団として単一セルを選択し、X 軸でグラデーション RMS M01を選択し、Y 軸でグラデーション RMS M07を選択します。[正方形の領域] アイコンをクリックし、セルの大部分の周囲に領域を描画します。この領域にフォーカスのあるセルに名前を付けます。プロットを右クリックし、[地域]を選択します。フォーカスセル領域をハイライト表示し、X 座標を 55 と 75 に変更し、Y 座標を 9.5 と 20 に変更します (図 1J)。
  4. ヒストグラムアイコンをクリックします。[集焦点セル]の作成を選択し、フィーチャとして[強度 M07]を選択します。線形領域アイコンをクリックし、ヒストグラムのメインピークに領域を描画します。この領域にDNA 陽性の名前を付けます。プロットを右クリックし、[地域]を選択します。DNA陽性領域をハイライト表示し、座標を 2 x 105および 2 x 106に変更します。ヒストグラムの強度ピークに応じて範囲を調整する必要がある場合があります (図 1K)。
  5. 取得パラメータを設定します (図 1E)。ファイル名と宛先フォルダを指定し、イベント数を 20,000 に変更し、DNA陽性母集団を選択します。
  6. [ロード(図 1F)]をクリックし、コントロール サンプルを MIFC に配置します。[取得] ボタンをクリックしてデータを収集します (図 1 G)。取得が完了したら、[戻る]ボタンをクリックしてサンプルを返します (図 1H)。サンプルチューブを計測器から取り外します。実験の残りのサンプルすべてに対してこのプロセスを繰り返します。

8. IDEAS でデータ ファイルを開く

  1. MIFC 分析ソフトウェア パッケージを起動します (資料の表を参照)。[分析の開始] をクリックして、ファイルを開くウィザードを開始します。目的の生のイメージ ファイル (.rif) を参照してデータ ファイルを選択します。[開く]ボタンをクリックし、[次へ]をクリックします。
  2. これは単一の色のアッセイであるため、補正は必要ないため、[次へ]をクリックして補正ステップをバイパスします。この段階では、適用する分析テンプレートがないため、[次へ] をもう一度クリックします。補足資料から分析テンプレートがダウンロードされている場合は、ここで選択します。これらのテンプレートは、BFがチャンネル1と9に設定された2台のカメラMIFCと、取得時にチャンネル7の核画像でのみ動作します。
  3. デフォルトでは、.cif ファイル名と .daf ファイル名は.rif に一致するように自動的に生成されます。.cif と .daf の名前を変更することはお勧めしません。[次へ] をクリックします。01と07を選択して、イメージ表示プロパティを設定します。[次へ] をクリックします。このアプリケーションにはウィザードがないため、[完了]をクリックします。進行状況の損失を避けるために、セクション 9 ~ 14 の間にデータ分析ファイル (.daf) と分析テンプレート (.ast) を頻繁に保存することが非常に重要です。

9. BNC を識別するためのマスクと機能の作成

  1. イメージ ギャラリーのプロパティアイコン (青/白のアイコン) をクリックします。[プロパティの表示] タブで [ピクセル データに範囲を設定] をクリックし、色を黄色に変更します。[OK]をクリックします。Hoechst 画像が黒い背景に対して見やすくなり、表示しやすくなります。
  2. 非アポトーシスセルプロットを作成します。
    1. [解析]タブをクリックし、[マスク]をクリックします。[新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[機能]で[しきい値]を選択し、[マスク]で[M07]を選択し、[強度のパーセンテージ]を 50 に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。[閉じる]をクリックします。
    2. [分析]タブをクリックし、[フィーチャ]をクリックし、[新規]をクリックします。機能タイプ選択領域の場合。マスクの場合はしきい値(M07,Ch07,50)を選択します。[既定の名前を設定]をクリックし、[OK] をクリックします。 [閉じる]をクリックしてフィーチャ値の計算を開始します。
    3. ドットプロットアイコンをクリックします。[すべての母集団] を選択します。X軸フィーチャーの場合は、コントラスト_M01_Ch01フィーチャーを選択し、Y軸フィーチャーでは[エリア・しきい値(M07,Ch07,50)]を選択します。[OK]をクリックします。
    4. [正方形の領域]ボタンをクリックし、セルの大部分の周囲に領域を描画します。この領域を非アポトーティックと呼び出します。プロットを右クリックし、[地域]をクリックします。非アポトーシス領域を強調表示します。X座標を 0 と 15 に設定し、Y座標を 50 と 300 に設定します。[閉じる]をクリックします。
  3. BNC マスク (手順 9.3.1 - 9.3.5) を作成して、2 つの核のみを含むセルを識別します。
    1. 画像ギャラリーでBNCを参照し、それをクリックします。これは、Hoechst チャネルでのマスクの作成を視覚化することです。
    2. [解析]タブをクリックし、[マスク]をクリックします。[新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[機能]で[レベルセット]を選択し、[マスク]で[M07]を選択し、[中間レベルマスク]ラジオ ボタンを選択し、[輪郭の詳細スケール]を 3.00 に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
    3. [新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[関数]で [ディレイト]を選択し、[マスク]でLevelSet (M07,Ch07,Middle, 3)を選択します。Ch07に表示するイメージを設定し、ピクセル数を 2 に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
    4. [新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[関数]で[集水域]を選択し、[マスク]で[レベルセット(M07,Ch07,ミドル,3)2) を選択します。画像をCh07に表示するように設定し、線の太さを1 に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
    5. [新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[機能]で [範囲]を選択し、[マスク]で[水分引き(レベルセット(M07、Ch07、ミドル,3)2)]を選択します。Ch07に表示するイメージを設定します。最小領域値と最大面積値をそれぞれ 115 と 5000 に設定します。最小アスペクト比値と最大縦横比値をそれぞれ 0.4 と 1 に設定します。[OK]をクリックします。[名前]フィールドで、BNCを読むようにテキストを変更し、[OK] をクリックします。
  4. フィーチャとプロットを作成して最終的な BNC 母集団を取得する
    1. スポットカウント BNC 機能: [分析]タブをクリックし、[機能] をクリックし、[新しい]をクリックします。 フィーチャータイプの場合は、スポットカウントを選択します。[マスク]で、9.3.5 で作成された最終的な BNC マスクを選択します。[接続性]を4に設定し、名前をスポットカウント BNCに変更します。[OK]をクリックし、[閉じる]をクリックしてフィーチャ値を計算します。
    2. スポットカウント BNC ヒストグラム。ヒストグラムアイコンをクリックします。親母集団として非アポトーティックを選択します。X軸フィーチャーの場合は、スポットカウント BNCフィーチャーを選択します。[OK]をクリックします。線形領域アイコンをクリックします。ビン2を横切って領域を描画します。この領域を 2N と呼びます。
      注: 補足 1 - 完全なプロトコルのセクション 9 を参照して、残りのマスク、機能、およびプロットを作成して、最終的な BNC 母集団を識別します。

10. BNC 母集団内で MN を識別するためのマスクと機能の作成

  1. MN マスクを作成します。イメージ ギャラリーに MN を含む BNC を参照し、それをクリックします。これは、Hoechst チャネルでの MN マスクの作成を視覚化することです。[解析]タブをクリックし、[マスク]をクリックします。
    1. スポット識別マスク 1 の作成:
      1. [新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[機能]で[スポット]を選択し、[明るいラジオ]ボタンが選択されていることを確認します。[マスク]で[M07]を選択し、[セルの背景比率]を2.00に設定します。最小半径を2に、最大半径を6に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
      2. [新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[関数]で[範囲]を選択し、[マスク]でLevelSet (M07,Ch07,Middle, 3)を選択します。Ch07に表示するイメージを設定します。[最小領域] と [最大面積]をそれぞれ 80 と 5000 に設定します。[最小アスペクト比] と [最大アスペクト比]をそれぞれ 0 と 1 に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
      3. [新規] をクリックし、[機能] をクリックします。[関数]で[広向]を選択し、[マスク]で[範囲(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3),80-5000,0-1)を選択します。Ch07に表示するイメージを設定します。ピクセル数を2に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
      4. [新規]をクリックします。スポット(M07、Ch07、ブライト、2、6、2)マスクをダブルクリックしてマスク定義に追加します。And演算子をクリックし、[Not] 演算子をクリックします。[範囲(レベルセット(M07、Ch07、中、3)、80-5000、0-1)マスク(2)マスク定義に追加します。[OK]をクリックします。
      5. [新規]をクリックし、[機能]をクリックします。[機能]で[範囲]を選択し、[マスクの下] で 10.1.1.4 で作成されたマスクを選択します。
        1. スポット(M07、Ch07、ブライト、2、6、2)を選択し、広げ不全(LevelSet(レベルセット(M07、Ch07、中央、3)、80-5000、0-1、2)を選択します。
        2. 画像をCh07に表示するように設定します。[最小領域] と [最大面積]をそれぞれ 10 と 80 に設定します。[最小アスペクト比] と [最大アスペクト比]をそれぞれ 0.4 と 1 に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。スポット識別マスク1が完成しました。
          注: 補足 1 - 完全なプロトコルのセクション 10 を参照して、マスク、機能、およびプロットを作成して、最終的な MN 母集団を識別します。

11. マスク、フィーチャー、プロットを作成して、単核化母集団と多核母集団を識別する

  1. POLY マスクを作成します。[分析]をクリックし、[マスク]をクリックし、[新規]をクリックしてから[機能]をクリックします。[機能]で [範囲]を選択し、[マスク]で[水分引き(レベルセット(M07、Ch07、中央、3)]を選択します。Ch07に表示するイメージを設定します。[最小面積] 値と[最大面積]値をそれぞれ 135 と 5000 に設定します。[最小アスペクト比]の値と最大アスペクト比の値をそれぞれ 0.4 と 1 に設定します。[OK]をクリックします。[名前] フィールドで、テキストを変更してPOLY を読み取り、[OK] をクリックして[閉じる]をクリックします。 ポリ核セルマスクが完成しました。
  2. POLY コンポーネント マスクを作成します。
    1. POLY コンポーネント マスク 1: [解析]タブをクリックし、[マスク]、[新規]、[機能]をクリックします。[機能][コンポーネント]を選択し、[マスク]の下でPOLYマスクを選択します。[フィーチャのランキング]で[エリア]を選択し、[並べ替え順序]の場合は[下降ラジオ] ボタンをクリックします。ランクを1に設定します。[OK]をクリックし、もう一度[OK]をクリックします。
    2. POLY コンポーネント マスク 2、3、4: 11.2.1 のすべてのステップを繰り返しますが、[ランク2、3、4]に設定して個々のコンポーネント マスクを作成します。
  3. POLY マスクを使用したスポットカウント。
    1. [分析]タブをクリックし、[機能]をクリックし、[新規]をクリックします。フィーチャータイプの場合は、[スポット数]を選択します。マスクの場合はPOLYマスクを選択し、[接続性]を 4に設定します。[既定の名前を設定]をクリックし、[[閉じる]をクリックしてフィーチャ値を計算します。
    2. ヒストグラム アイコンをクリックします。非アポトーシス母集団を選択します。X軸フィーチャーの場合は、スポットカウント_POLY_4フィーチャーを選択します。
    3. MONO スポットカウント領域。線形領域アイコンをクリックします。11.3.2 で作成されたヒストグラム上のビン1全体の領域を描画します。この領域を 1Nと呼びます。
    4. TRI スポットカウント領域。線形領域アイコンをクリックします。11.3.2 で作成されたヒストグラム上のビン3全体に領域を描画します。この領域を 3N と呼びます。
    5. QUAD MONO スポットカウント領域。線形領域アイコンをクリックします。11.3.2 で作成されたヒストグラム上のビン4全体の領域を描画します。この領域を 4N と呼びます。
  4. MONO 母集団を識別します。
    1. MONO 縦横比機能を作成します。[分析]タブをクリックし、[機能]をクリックし、[新規]をクリックします。[フィーチャタイプ]で[縦横比]機能を選択し、[マスク]の下にある[コンポーネント(1、面積、POLY、降順])を選択します。[既定の名前を設定]をクリックし、[OK] をクリックします。
    2. MONO 循環フィーチャーを作成します。機能マネージャウィンドウを開いたまま、[新規]をクリックします。[フィーチャタイプ] で[円形]機能を選択し、[マスク]の下にある[コンポーネント(1、面積、POLY、降順)]を選択します。[既定の名前を設定]をクリックし、[OK] をクリックし、[閉じる]をクリックしてフィーチャ値を計算します。
    3. 円形 MONO セルドット プロットの場合は、ドット プロットアイコンをクリックします。親母集団として1Nを選択します。X軸フィーチャーでは、[円率]コンポーネント(1、面積、POLY、降順)を選択し、Y軸フィーチャーではアスペクト比コンポーネント(1、面積、POLY、降順)を選択します。[OK]をクリックします。[正方形領域]ボタンをクリックし、セル母集団の周囲の領域をプロットの右上部分に描画します。この領域にCircular_1N という名前を付けます。プロットを右クリックし、[地域]をクリックします。循環領域をハイライト表示します。X座標を 20 と 55 に変更し、Y座標を 0.85 と 1.0 に変更します。[閉じる]をクリックします。
    4. エリア ポリ/エリア_M07 フィーチャーを作成します。[分析]タブをクリックし、[機能]をクリックし、[新規]をクリックします。[フィーチャタイプ] で[エリアフィーチャー]を選択し、[マスク]の下にある[コンポーネント(1、エリア、POLY、降順)]を選択します。[既定の名前を設定]をクリックし、[OK] をクリックします。
    5. 機能マネージャウィンドウが開いたまま、[新機能]をクリックし、[機能タイプ]の下にある[組み合わせたラジオ]ボタンをクリックします。フィーチャの一覧から、Area_Component(1、エリア、POLY、降順)をハイライト表示し、下向き矢印をクリックしてフィーチャ定義に追加します。分割記号 (/) をクリックします。Area_M07 フィーチャーを選択し、下向き矢印をクリックしてフィーチャ定義に追加します。[既定の名前を設定]をクリックし、[OK] をクリックします。 [閉じる]をクリックしてフィーチャ値の計算を開始します。
    6. 最終的な MONO 母集団ドット プロットの場合は、ドット プロットアイコンをクリックします。親母集団として[循環_1N]を選択します。X軸フィーチャーの場合はアスペクト比_M07を選択し、Y軸フィーチャーではエリアコンポーネント(1、面積、POLY、降順)/エリア_M07 を選択します。[OK]をクリックします。[正方形の領域]ボタンをクリックし、セルの大部分の周囲に領域を描画します。この領域に単一核化に名前を付けます。プロットを右クリックし、[地域]をクリックします。モノ核領域をハイライト表示します。X座標を 0.85 と 1.0 に変更し、Y座標を 0.55 および 1.0 に変更します。[閉じる]をクリックします。
      注: 補足 1 - 完全なプロトコルのセクション 11 を参照して、マスク、機能、およびプロットを作成して、最終的な三角母集団と多核化母集団を識別します。

12. BNC および MN マスクを調べるカスタム ビューを作成する

  1. [イメージ ギャラリーのプロパティ] ボタンをクリックし、[表示] タブをクリックします。 [名前の下のタイプCh01/Ch07][画像の追加] をクリックします。[イメージ]でCh01を選択し、[パーセント]を 100 に設定します。[画像をもう一度追加] をクリックし、[画像]で[Ch07]を選択し、[パーセント]を 100 に設定します。
  2. [新規]をクリックし、[名前] タイプBNC および MN マスクをクリックします。
  3. [列の追加] をクリックします。[イメージタイプ] でCh01を選択し、[マスク]で [なし]を選択します。
  4. [列の追加] をクリックします。[イメージタイプ]でCh07 を選択し、[マスク]で [なし]を選択します。
  5. [列の追加] をクリックします。[画像タイプ]でCh07 を選択し、[マスク]で[BNC]を選択します。
  6. [列の追加] をクリックします。[イメージタイプ]でCh07 を選択し、[マスク]の下で[MN マスク]を選択します。
  7. [列の追加] をクリックします。[画像の種類]で[コンポジットラジオ]ボタンをクリックします。Ch01/Ch07合成イメージは、ビューに自動的に追加する必要があります。[OK]をクリックして[イメージ ギャラリーのプロパティ]ウィンドウを閉じます。

13. POLY マスクを調べるカスタム ビューを作成する

  1. POLY マスクを調べるカスタム ビューを作成するには、補足 1 - フル プロトコルのセクション 13 を参照してください。

14. キーイベントを列挙する統計テーブルを作成する

  1. [レポート]タブをクリックし、[統計レポートの定義]をクリックします。新しいウィンドウで、[列の追加] をクリックします。
  2. BNC カウント統計を追加します。[統計]で [選択した人口] で[選択した人口]で[BNC]の母集団を選択します。 [統計情報の追加] をクリックして、統計情報をリストに追加します。
  3. 手順 14.2 を繰り返して、MN BNC、MONO、TRI、POLY 母集団の別々の列を作成します。 [閉じる]をクリックし、[OK] をクリックします。
  4. データ分析テンプレートが完成しました (図2)。テンプレートを保存します(ファイル、テンプレートとして保存)。完全なマスクリストは、サプリメント2 - マスクリストで見つけることができます。

15. データ分析テンプレートを使用したバッチ処理実験ファイル

  1. [ツール] メニューで [データ ファイルのバッチ処理] をクリックし、[新しいウィンドウでバッチを追加] をクリックします。
  2. 新しいウィンドウで [ファイルの追加] をクリックして、バッチに追加する実験ファイル (.rif) を選択します。[テンプレートまたはデータ分析ファイルの選択](.ast、.daf)オプションで、開いているフォルダアイコンをクリックして、ステップ14.4に保存されたデータ分析テンプレート(.astファイル)を参照して開きます。
  3. [統計レポートのプレビュー] ボタンをクリックして、統計テーブルをプレビューします。まだ計算されていないため、値は表示されません。ただし、この手順は、バッチを実行する前に適切な分析テンプレートが選択されていることを確認するチェックとして機能します。
  4. [OK]をクリックして現在のウィンドウを閉じます。次に、[バッチの送信]をクリックして、すべてのファイルのバッチ処理を開始します。
  5. バッチ処理が完了すると、すべての .rif ファイルを含むフォルダに .txt ファイルが使用できるようになります。これらの統計情報を使用して、ジェノ毒性と細胞毒性を計算します。

16. 無毒性および細胞毒性パラメータの計算

  1. ジェノ毒性の計算: ジェノ毒性を計算するには、15.5 で作成された統計表を使用します。MN BNC 母集団内のセル数を、BnC 母集団内のセル数で割り、100 を掛けます。
    Equation 1
  2. 細胞毒性の計算: TRI セルと QUAD セルの数を合計して、POLY セルの総数を決定します。
    1. MONO、BNC、POLYの細胞数を次のように使用して、サイトカインシスブロック増殖指数(CBPI)を計算します。
      Equation 2
    2. 最後に、対照培養(C)および化学的に露出した培養物(T)からのCBPI値を以下のように使用して、各培養物の細胞毒性を計算します。
      Equation 3

Representative Results

このホワイト ペーパーで概説した分析方法により、MN の有無にかかわらず、BNC の自動識別とスコアリングを行い、ジェノ毒性を計算できます。さらに、MONO細胞とPOLY細胞も自動的に同定され、細胞毒性を計算するためにスコア付けされます。これらのイベントをスコアリングする際に遵守する必要がある公開されたスコア基準 6,34は、MIFC データ分析ソフトウェアに実装されています。ここで提示された結果は、細胞毒性の増加に伴うMN頻度の統計的に有意な増加が、ヒトリンパ芽球性TK6細胞をよく知られているMN誘導化学物質(ミトマイシンCおよびコルチシン)に曝露した後に検出できることを示している。試験された追加の化学物質に対する同様の結果は、別の出版物32で実証されている。さらに、Mannitolの使用の結果は、非MN誘導化学物質もここで概説するMIFC法を使用して正しく識別できることを示しています。すべてのマスク、特徴および領域の境界を作成するためにプロトコルで説明されているパラメータは、異なる細胞タイプ(例えば中国ハムスター細胞)がアッセイを実行するために使用される場合、調整する必要がある可能性が高い。

図 3は、BNC を識別するために選択した 4 つのパネルを示しています (図 3A-3D)。ここに示すのは、2つの核(図3A)と、類似した円形(図3B)、類似した領域と強度を持つBNCの選択を可能にする二変量プロットを持つ細胞の選択を可能にするヒストグラムです(図3C)。)と、スコアリングクリティエリア6、34に準拠して、十分に分離された、重複しない核(図3D)を有するBNC。図 3Eは、BF および Hoechst イメージ、および BNC および MN マスクを示し、単一または複数の MN を持つ BNC を識別および列挙できることを示します。これにより、最終的なBNC集団における微小核BNCの速度を決定することによって、ゲノ毒性を計算することができる。図 4は、POLY マスクを使用して MONO、TRI、および QUAD セルを識別するスポットカウント機能の適用を示しています。次に、TRI セルと QUAD セルの数を合計して、最終的なポリセル数を取得できます (表1)。これにより、プロトコルに示す式を使用して細胞毒性を計算することができます。したがって、実験における各用量点は、無毒性および細胞毒性パラメータの両方によって評価することができる。

図5は、アヌゲンコルチシン、クラストゲンミトマイシンCおよび陰性対照、マンニトールに対するゲノ毒性および細胞毒性値を示す。コルチシン(図5A)の場合、0.02~0.05 μg/mL用量は、溶媒制御に対してそれぞれ1.28%から2.44%の範囲で、MN周波数の統計的に有意な増加を生み出した(表1)。ミトマイシンC(図5B)の場合、溶媒対照と比較した場合、0.4と0.5 μg/mLの2つのトップ用量が統計的に有意なMN周波数を生成した。これらのMN周波数は0.4 μg/mLで0.93%、0.5 μg/mLで1.02%であった(表2)。最後に、Mannitol(図5C)に対しては、試験された用量は30%を超える細胞毒性を誘導せず、また、期待どおりに溶媒対照と比較した場合のMN周波数の有意な増加を生じなかった(表3)。

Figure 1
図 1: MIFC計測器の設定。プロトコルのセクション 7 で説明されている MIFC 設定のスクリーンショット。(A) 405 nmレーザーパワーを10mWに設定。(B) BF チャンネル 1 および 9 を設定します。(C) 60倍倍倍の対物レンズを選択する。(D) 最も解像度の高い画像を生成する最も遅い流速を選択します。(E) 収集するイベントの数を 20,000 に指定します。(F) [ロード]ボタンをクリックして、サンプル読み込みプロセスを開始します。(G) [取得]ボタンをクリックして画像の取得を開始します。(H) [戻る]ボタンをクリックすると、未使用のサンプルが返されます。(I) 単一細胞の選択に対するBFアスペクト比対BF面積の散布図。(J) 集値セルの選択に対するホーチスト勾配RMS対BF勾配RMSの散布図。(K)DNA陽性細胞の選択のためのホエヒト強度のヒストグラム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:分析ソフトウェアゲーティング戦略。プロトコルのセクション 9 で説明するゲーティング戦略のスクリーンショット。領域は、二核化細胞(赤い箱)、微小核(黄色の箱)、および単核細胞(青い箱)の同定のための順番に示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: MN の有無にかかわらず、BNC の識別とスコアリング。(A) 2つの異なる核を持つ細胞の選択。(B) アスペクト比強度特徴を用いた2つの円高核を持つ二核(BNC)の同定。(C) 類似の領域と強度を持つ核を持つBNCの選択。これは、両方の核の面積の比率と両方の核のアスペクト比の比率を計算することによって達成される。(D) 形状比とアスペクト比機能を使用して、2つのよく分離された核を持つBNCを識別する。(E) 単一または複数の MN を持つ BNC を識別および列挙できることを示すマイクロ核(MN)マスクを使用したスポットカウント機能。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: MONO および POLY セルの識別とスコアリング。スポットカウント機能を使用して、モノ、トライ、四分円のセルを識別して列挙します。成分マスク1は、単核細胞の同定を可能にする(上画像)。成分マスク1~3は、三角細胞(中間画像)の同定を可能にする。コンポーネントマスク1~4は、四分位細胞の同定を可能にする(下の画像)。この数字はロドリゲス201832から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 細胞毒性の定量化。サイトカインシスブロック増殖指数(黒い円)とゲノキシック性を用いて定量した細胞毒性は、(A)コルチシン、(B)ミトマイシンCおよび(および(C)マンチトール。コントロールと比較したMN周波数の統計的に有意な増加は、星によって示されます(カイ二乗検定;*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。すべての量は、各線量点で2回の反復の平均である。この数字はロドリゲス201832から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Table 1
表 1:コルチシンの細胞毒性(モノ、バイ核細胞、多核細胞の数)およびゲノム毒性(微小核化ビヌクエート細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

Table 2
表 2:ミトマイシンCの細胞毒性(モノ、バイ、ポリ核細胞の数)およびゲノム毒性(微小核化ビヌクレオ化細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

Table 3
表 3:Mannitolの細胞毒性(モノ、バイ核細胞、多核細胞の数)およびジェノ毒性(微小核化ビヌクエート細胞の数と割合)を計算するために必要なパラメータ。すべての計算された量は、各線量点での2回の反復の平均です。

補足 1: 完全なプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足2:マスクリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

最近の出版物でVermaらは、フローサイトメトリーのハイスループットの利点と画像解析35のデータおよび画像記憶の利点を組み合わせたシステムを開発することの重要性を強調した。このホワイト ペーパーに記載されている IMFC in vitro MN アッセイは、この引用を満たしており、顕微鏡検査およびフローサイトメトリー法における前述の課題の多くを克服する可能性を秘めています。ここで説明するプロトコルは、細胞毒性と無毒性の両方がMIFCを用いて評価できることを示している。サンプル調製、細胞染色、データ収集は簡単ですが、プロトコルには常に実装する必要がある重要な手順がいくつかあります。細胞への塩化カリウム(KCl)の添加は、細胞を膨らみ、主核間の分離を生成するために重要である。これにより、マスキング アルゴリズムは、列挙に必要な BNC および POLY セル (POLY セル) 内のすべての個々の核を識別できます。さらに、KCLは正確なMNマスキングおよび定量のために不可欠である核とMNの間の分離を提供する。さらに、KClの添加に続くホルマリンの使用は、遠心分離中に細胞がlysingすることを防ぎます。サイトチャラシンBの添加により、複数の核分裂を受けたTK6細胞が非常に大きくなります。その結果、細胞質が壊れやすくなり、KClを添加した直後に遠心分離が行われれば、凍結が起こり得る。さらに、最終的な濃度ではなく、サンプル中の細胞数に応じてサンプルにHoechstを導入することは非常に重要です。例えば、Hoechstの最終的な濃度が10 μg/mLの最終濃度は、1 x 106細胞のサンプルを均一に染色しますが、5 x 106細胞を含むサンプルを適切に染色すされず、薄暗い核を有する多くの細胞が生じる可能性があり、分析が困難になります。また、MIFCに488nmおよび/または642nm励起レーザーが装備されている場合、MIFCが405 nm励起レーザーまたはDRAQ5を装備している場合、HoechstはDAPIなどの別のDNA色素に置き換えることができることに注意することも重要です。核汚れを修正する場合は、必要な/所望のレーザーパワーに適した濃度を見つけるために染色を力付けることが重要です。

MIFC でデータを収集する場合は、グラデーション RMS フィーチャに最適な領域境界を決定することが重要です。このプロトコルで提示される境界は、MIFC計測器間のわずかな変動のために調整が必要な場合があります。データ収集中にこの機能を適用することは、高度に集中した画像を確実にキャプチャするために不可欠です。データ ファイルにぼやけた画像や焦点が合っていない画像が多数含まれている場合、解析ソフトウェアのマスキング アルゴリズムがぼやけた領域の染色アーティファクトを誤ってハイライト表示し、多数の誤検知アーティファクトが MN としてスコア付けされる可能性があります。ここで説明する画像処理技術は難しいかもしれませんが、MIFCソフトウェアで解析テンプレートを開発すると、バッチ処理によりデータファイルを自動的に分析できるため、ユーザーの介入が不要になり、スコアラーバイアス。また、TK6細胞以外の細胞株を用いてアッセイを行う場合、細胞の形態特性(例えば、サイズ)がTK6細胞のものと異なるようにマスクおよび領域境界を修正する必要がある。

ここで提示された結果(図5)は、TK6細胞をミトマイシンCおよびコルチシンの様々な用量に暴露する際のMN誘導の統計的に有意な増加を示す。溶媒対照と比較した場合のMNの頻度の統計的に有意な増加は、両方の化学物質で複数の用量について観察された。さらに、マンニトールの用量は30%以上の細胞毒性を誘発せず、また、期待どおりに溶媒対照と比較した場合のMNの頻度の統計的に有意な増加も起用しなかった。この論文で説明するプロトコルは、MIFCを用いてインビトロMNアッセイを行い、陽性および陰性制御化学物質の両方から期待される結果を与える。MNの周波数とサイトカインシスブロック増殖指数(CBPI)の両方のベースライン値を開発するために、溶媒制御と陰性制御化学物質の両方を使用して多くの実験を行うことが非常に重要です。遺伝子毒性については、MN周波数の統計的に有意な増加は、使用される細胞タイプによく知られている必要があるベースラインMN周波数との比較によって決定される。さらに、すべての細胞毒性計算は、コントロールサンプルのCBPIに基づいているため、MONO、BNCおよびPOLY細胞のベースラインレートは、コントロールで十分に定量化されなければなりません。

MNアッセイの文脈でMIFCを使用することのいくつかの制限と利点は、前の研究29、32で説明されている。主な制限事項は、顕微鏡検査と比較した場合のMN周波数の低下に関するもので、分析ソフトウェアでスコアリング基準を実装する際の柔軟性の欠如とMIFCの被写界深度の限られた深さの両方から生じ込まれる可能性があります。十分に輪郭を描かれたマスクは、主核を正確に識別するために作成できますが、主核に触れている(または非常に近い)MNはBNCマスク内で捕捉される可能性があります。さらに、顕微鏡検査を使用してかなり簡単に採点できる非常に小さなMNは、小さなアーティファクトのスコアリングを避けるために、MNマスクの面積パラメータの下限のためにMIFCを使用する場合、おそらく誤って見逃されます。画像ベースのデータ解析の難しさに加え、その設計により、MIFCは3次元細胞物体の2次元投影画像を取得します。これにより、一部の MN は、2 つのメイン MN とは異なる深さでキャプチャされ、マスキングを使用して非常に暗く、コーザブルに見える可能性があります。さらに、MN のごく一部が 2 つの主要な核の 1 つの後ろに存在し、視覚化とスコア付けが不可能になります。したがって、これらの困難を考慮すると、低用量でMN周波数の有意な増加を解釈する際には注意が必要である。

これらの欠点にもかかわらず、ここで説明するMIFC法は、他の技術に対していくつかの利点を提供する。Fenechらは、MNアッセイ36の自動化されたシステムと方法論を開発する際に考慮すべき基準とガイドラインを提案した。これらには、主核および細胞質の直接可視化、試験対象の化学物質または薬剤の様々な用量からのMNの頻度の決定、形態を定量し、すべての位置を決定する能力が含まれるが、これらに限定されない。核とMNは、それらが細胞質内にあることを確認します。本論文は、インビトロMNアッセイを行うために開発されたMIFC法が、これらの基準を満たす(または満たす可能性を有する)ことを示す。具体的には、核とMNの画像は蛍光レーザーで捕捉することができ、細胞質画像はBF LEDを用いて得ることができる。正常な核形態を持つ細胞の画像は、高度なマスクと特徴の組み合わせを使用して、不規則な形態を持つ細胞から自動的に区別することができます。コルチシンおよびミトマイシンC(図5)に提示された結果は、溶媒対照と比較した場合、ジェノ毒性と細胞毒性の両方が様々な用量で評価され、統計的に有意なMN周波数がどこで観察されることを示しています。期待。さらに、OECD試験ガイドライン487は、細胞毒性を決定するために、テスト濃度当たり少なくとも500細胞と共に、MNの存在を評価するために、テスト濃度当たり2,000 BNCを採点することを推奨しています。これは手動顕微鏡検査を使用して1時間以上かかる場合があります。この論文のプロトコルと結果は、約6,000 BNC、16,000 MONO細胞、および800個のPOLY細胞を約20分で試験濃度当たりに捕捉し、スコア付けしたことを示している。このような短時間で得得たデータ取得の急速な速度と多数の候補細胞は、インビトロMNアッセイを実行するためにMIFCを採用するもう一つの重要な利点を強調しています。

本論文で発表された結果は励みになりますが、初期の概念実証法を代表しています。この研究は、カークランドら37で示唆されたような、複数のクラスと毒性および細胞毒性のメカニズムをカバーするより大きく、より多様な化学セットのより徹底的な調査によって続かれるべきである37しかし、時間と労働集約的であり、この論文の範囲外であるこの大規模な研究は、弱い毒性物質を確実に同定する方法の能力に関する貴重な洞察を提供する。ここで提示される方法論は、より大きな線量範囲にわたってより迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にするマイクロウェル形式にまだ小型化されていない。したがって、現在の形では、ここで提示されるMIFCベースのインビトロMNアッセイは、労働集約的なフォローアップ研究や良好な実験室の実践に関する研究に最も適している可能性があります。しかし、この方法は引き続き最適化され、検証され、細胞の割合を増加させるアヌーゲン暴露など、形態に関連する化学的特異的事象を検出する柔軟性を高める可能性を秘めています。まだコーラブルである非円形核38.最後に、MIFC法は、MN誘導のメカニズムのより包括的なビューを提供するために、MNアッセイ(例えばキネトコレ染色)に追加のバイオマーカーを導入する機会を提供する。

Disclosures

著者は、本作で使用したImageStreamマルチスペクトルイメージングフローサイトメーターのメーカーであるルミネックス株式会社に採用されています。

Acknowledgments

著者は、以前の形式のデータ分析テンプレートの開発に取り組んだクリスティン・プロブスト(ルミネックス社)と、ヘイリー・パグスリー博士(ルミネックス株式会社)とフィル・モリッシー博士(ルミネックス株式会社)に感謝しています。原稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

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References

  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

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マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法
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Rodrigues, M. A. An Automated Method … More

Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

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