Summary

Uso de la tinción de inmunofluorescencia en la cara para observar directamente las células endoteliales vasculares

Published: August 20, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia para observar las células endoteliales de la aorta del ratón directamente. Esta técnica es útil cuando se estudia el fenotipo celular y molecular de las células endoteliales en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis.

Abstract

Los cambios aberrantes en el fenotipo endotelial y la morfología se consideran eventos iniciales en la patogénesis de la aterosclerosis. La observación directa del endotelio intacto proporcionará información valiosa para comprender los eventos celulares y moleculares en las células endoteliales disfuncionales. Aquí, describimos una técnica de tinción de inmunofluorescencia en la cara modificada que permite a los científicos obtener imágenes claras de la superficie endotelial intacta y analizar los patrones de expresión de moléculas in situ. El método es simple y confiable para observar toda la monocapa endotelial en diferentes sitios de la aorta. Esta técnica puede ser una herramienta prometedora para entender la fisiopatología de la aterosclerosis, especialmente en una etapa temprana.

Introduction

Los primeros cambios en la vasculatura se inician principalmente en el endotelio, que funciona como una barrera selectiva entre la sangre y la pared del vaso con sus complejos de unión hermética intercelular1. La evidencia sustancial apunta a un papel crítico para los efectos mecánicos del flujo sanguíneo en la modulación de la función endotelial2. Tensión de cizallamiento fluido, fuerza de fricción generada por el flujo sanguíneo, da forma diferencial a lamorfología y función celular endotelial, dependiendo de los paradigmas de flujo específicos en diferentes sitios vasculares 2,3. Las lesiones ateroscleróticas ocurren preferentemente en sitios de flujo sanguíneo alterado (flujo d), como curvaturas de vasos, divisores de flujo y puntos de rama, en comparación con regiones de flujo constante (flujo s), como el segmento recto de la arteria. Por lo tanto, la observación directa de la morfología endotelial y los patrones de expresión de moléculas debe proporcionar información importante sobre los fenotipos estructurales y funcionales de las células endoteliales bajo diferentes paradigmas de flujo.

Las células endoteliales cultivadas pueden no expresar el fenotipo real como lo hacen in vivo en parte debido a la pérdida de impacto de tensión de cizallamiento de líquido, citoquinas circundantes e interacciones de matriz celular o celular-extracelular. Para ayudar a esto, la monocapa de células endoteliales intacta se puede estudiar en secciones transversales utilizando inmunohistoquímica clásica. Sin embargo, la monocapa endotelial es tan delgada y frágil que por lo general no se puede observar claramente. En face inmunohistochemistry se ha utilizado para observar la superficie interna del endotelio, pero es complicado o errático en sus resultados porque el endotelio se despoja fácilmente del tejido subyacente, o sólo parte de la pared arterial de ratas o conejos, cuyas paredes son gruesas, está montada4,5.

Los modelos de ratón tienen considerables ventajas sobre otros animales en muchos aspectos. Aquí, empleamos una técnica de inmunofluorescencia en la cara modificada para analizar las células endoteliales del arco aórtico y la aorta torácica en el ratón C57BL/6. Tal técnica ha sido ampliamente utilizada para estudiar la fisiopatología endotelial en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis6,7,8,9,10. Este método permite a los científicos observar claramente toda la superficie del endotelio y comparar los patrones de expresión de una proteína dada en regiones bajo diferentes tensiones de cizallamiento de fluidos.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái. 1. Perfusión del ratón aorta Brevemente, anestesia ratones C57BL/6 de 12 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente la cola.NOTA: Si no se observa ningún movimiento, el animal es…

Representative Results

Un ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad fue eutanasiado y perfundido con salina normal que contenía 40 unidades/ml de heparina y, entonces, preenfriado 4% paraformaldehyde. La aorta del ratón se expuso bajo un microscopio de disección (Figura1), diseccionada y cortada longitudinalmente (Figura2). En face la tinción de inmunofluorescencia de las células endoteliales vasculares se realizó como se ilustra en <strong class="xfi…

Discussion

El endotelio está expuesto a numerosos factores proaterogénicos, incluyendo lípidos, mediadores inflamatorios, y tensión de cizallamiento fluido1,11,12. La observación directa de las células endoteliales in situ proporciona las ventajas especiales para analizar los cambios en la morfología celular, las uniones intercelulares y los patrones de expresión de moléculas en respuesta a los estímulos de lesión.

<p class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81670451, 81770430), el Programa Shanghai Rising-Star (Grant No. 17QA1403000), y el Comité de Tecnología Científica del Gobierno Municipal de Shanghai (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Materials

Antifade mountant Servicebio G1401
Delicate Forceps RWD Life Science F11001-11
Delicate Scissors RWD Life Science S12003-09
Dissecting Forceps RWD Life Science F12005-10
Mciro Spring Scissors RWD Life Science S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) Amresco M143
Polysorbate 20 (Tween 20) Amresco 0777
VCAM-1 antibody Abcam ab134047
VE-Cadherin antibody BD Biosciences 555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG invitrogen A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG invitrogen A-21208
Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss

References

  1. Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

Play Video

Cite This Article
Li, C., Liu, Z. H., Chen, J. W., Shu, X. Y., Shen, Y., Ding, F. H., Zhang, R. Y., Shen, W. F., Lu, L., Wang, X. Q. Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly. J. Vis. Exp. (150), e59325, doi:10.3791/59325 (2019).

View Video