Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

المعالجة الضوئية اليومية مع الضوء الأحمر لتنظيم "النمو بيوفيلم" المبيضات البيض

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59326

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم نتائج تطبيق الضوء الأحمر على نمو بيوفيلم المبيضات البيض . جهاز ضوء الأحمر غير متسقة مع الطول الموجي ل 635 نانومتر وكثافة الطاقة 87.6 J·cm-2 طبق في جميع أنحاء نمو المبيضات البيض الأغشية الحيوية ح 48.

Abstract

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم نتائج بدل الضوء الأحمر في العلاج على نمو بيوفيلم المبيضات البيض . لزيادة نمو العوالق SN425 المبيضة ، نما إينوكولومس في وسائل الإعلام "قاعدة النيتروجين الخميرة". لتكوين بيوفيلم، طبقت RPMI 1640 وسائل الإعلام، التي لها تركيزات عالية من الأحماض الأمينية، للمساعدة على نمو بيوفيلم. تعامل الأغشية الحيوية 48 ساعة مرتين في يوم لمدة 1 دقيقة مع جهاز خفيفة غير متماسك (الضوء الأحمر؛ والطول الموجي = 635 نانومتر؛ وكثافة الطاقة = 87.6 J·cm-2). كما تم تطبيق عنصر تحكم إيجابية (PC)، الكلورهيكسيدين 0.12 في المائة (التايوانية)، وكعنصر تحكم سلبية (كارولاينا الشمالية)، 0.89% كلوريد الصوديوم تم تطبيقه على الأغشية الحيوية. مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي), كانت كمياً والانسيابيه الوزن الجاف والقابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان بعد العلاج. بإيجاز، البروتوكول المعروضة هنا بسيط واستنساخه ويقدم إجابات فيما يتعلق بالجدوى، مبالغ السكاريد الوزن الجاف وخارج الخلية بعد العلاج الضوء الأحمر.

Introduction

زيادة حالات مرض السكري، تطبيقات المعالجة الكابتة للمناعة، والإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، ووباء الإيدز، الإجراءات السريرية الغازية واستهلاك المضادات الحيوية واسعة الطيف في السنوات الماضية زادت حالات المبيضات البيض المتصلة بالأمراض1،2. ترتبط عادة بالتنمية بيوفيلم التهابات المبيضة وقد يسبب المظاهر السريرية، مثل داء المبيضات أو المظاهر الجهازية، مثل المبيضات1،2. واحدة من أبرز عوامل الفوعة النمو بيوفيلم هو إنشاء مصفوفة السكاريد خارج الخلية. وتتعاون تشكيل بيوفيلم زيادة المقاومة للعقاقير المضادة للفطور الموجودة، والإجهاد البيئي، والمضيف الآليات المناعية3.

ويبدأ نمو بيوفيلم المبيضة الانضمام المبكر الخلايا العوالق إلى الركازة، متبوعاً بنشر خلايا الخميرة من خلال سطح الركازة، ونمو أصله. المرحلة الأخيرة من النمو بيوفيلم هو مرحلة النضوج، حيث يتم إعاقة التنمية مثل الخميرة ويوسع تنمية أصله، والمصفوفة خارج الخلية إحاطة بيوفيلم4. تتفاعل والانسيابيه المبيضة (EPS) في المصفوفة شكل معقد5،المنان glucan6. تفاعل والانسيابيه أمر بالغ الأهمية للدفاع عن الأغشية الحيوية مكافحة المخدرات7. ومن ثم، يمكن الحد EPS من المصفوفة خارج الخلية المبيضة دعم تطوير بروتوكولات أنتيبيوفيلم جديدة لمكافحة داء المبيضات الفموية.

ينظم الضوء النمو والتنمية، وسلوك العديد من الكائنات الحية8 وتم تطبيقه كمضادات الميكروبات في العلاج الكيميائي الميكروبات الضوئي (الميثاق). وينطبق ميثاق ضوء مرئي طول موجي محدد ومحسس ضيائي امتصاص ضوء9. ومع ذلك، قد الضيائية صعوبات في اختراق بيوفيلم، مما تسبب في انخفاض كفاءة10. فشل العوامل العلاجية في اختراق الأغشية الحيوية تماما سبب في أن الأغشية الحيوية أحياناً يقاوم العلاج بمضادات الميكروبات التقليدية3،5. لإلغاء تنشيط الخلايا الجرثومية المغلقة، يلزم مضادات الميكروبات تتخلل من خلال المصفوفة خارج الخلية؛ ومع ذلك، يميز EPS عقبة ديفوسيونال لمثل هذه الجزيئات بدفع مستوى النقل إلى بيوفيلم أو بالتأثير على استجابة مضادات الميكروبات مع المصفوفة نفسها11.

نظراً للعيوب للميثاق، يبرز استخدام الضوء بحد ذاته كحدوث تحسن قيمة. وكشفت البيانات الأولية أن العلاج بالضوء الأزرق مرتين في يوم إلى حد كبير يحول دون إنتاج EPS الذوبان في بيوفيلم mutans العقدية . بنقصان قدرة EPS-تستعصي على الحل، تناقص الضوء الأزرق بيوفيلم النمو. ومع ذلك، نتائج العلاج الضوئي باستخدام الضوء الأحمر في الأغشية الحيوية المبيضة شحيحة. ومن ثم، كان الهدف من هذا التحقيق لتقييم ما هي طريقة المعالجة الضوئية باستخدام الضوء الأحمر يؤثر على النمو وترتيب بيوفيلم المبيضة . للعلاج مرتين يوميا وعلينا تكييف لدينا مختبر السابقة البروتوكولات9،12 إلى تقديم نموذج بيوفيلم سهلة واستنساخه أن توفر إجابات فيما يتعلق بالجدوى، السكريات الوزن الجاف وخارج الخلية المبالغ بعد العلاج الضوء الأحمر. يمكن استخدام البروتوكول نفسه لاختبار العلاجات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة

  1. إعداد أجار سابورو سكر العنب (حزب العمل الديمقراطي). تعليق ز 65 من حزب العمل الديمقراطي وتستكمل مع الكلورامفينيكول (50 مغ/لتر) في 1,000 مل ماء المقطر. يغلي بحل الوسط تماما. تعقيم بالتعقيم في 15 PSI (121 درجة مئوية) عن 30 دقيقة كول إلى 45-50 درجة مئوية. تخلط جيدا وتصب 20 مل من حزب العمل الديمقراطي في لوحات بيتري معقمة (الحجم: 100 ملم × 15 ملم).
  2. إعداد الخميرة النيتروجين قاعدة (YNB) المتوسطة تكملها مع الجلوكوز 100 ملم خلط ز 6.7 من YNB و 18 جرام من سكر العنب إلى 1,000 مل من الماء عالي النقاوة. استخدام محرض مزيج وتعقيم المتوسطة استخدام نظام تصفية فراغ 0.22 ميكرومتر.
  3. إعداد ربمي بخلط ز 10.4 RPMI 1640 و 34.32 ز 3-(N-morpholino) حمض بروبانيسولفونيك (والمماسح) إلى 1,000 مل من الماء عالي النقاوة. خلط في محرض دون الحرارة وضبط درجة الحموضة إلى 7 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم 1 ن (ز 2 إضافة من هيدروكسيد الصوديوم في 50 مل الماء عالي النقاوة). تعقيم المتوسطة استخدام نظام تصفية فراغ 0.22 ميكرومتر.

2-قبل العدوى والعدوى

  1. إزالة الكائنات الدقيقة SN425 المبيضة من الثلاجة −80 درجة مئوية والسماح لها بالذوبان في درجة حرارة الغرفة. البذور 10 ميليلتر من ثقافة الأسهم على أطباق بتري تحتوي على حزب العمل الديمقراطي وتستكمل مع الكلورامفينيكول (50 مغ/لتر). احتضان أطباق بيتري هوائيا في 37 درجة مئوية ح 48.
  2. بعد 48 ساعة حضانة، إضافة 10 مستعمرات المبيضة إلى 10 مل نيتروجين الخميرة المتوسطة (YNB) قاعدة تكمل مع الجلوكوز 100 مم، واحتضان هوائيا في 37 درجة مئوية ح 16 للعدوى قبل.
  3. وبعد حضانة لإعداد 16 ح، إينوكولومس بتمييع الثقافات كاتب في المتوسطة YNB جديدة تستكمل مع الجلوكوز 100 ملم في 01:10 نسبة (1 مل ثقافة كاتب المخفف في 9 مل YNB). قياس الكثافة البصرية الأولية (OD) في 540 نانومتر.
  4. احتضان إينوكولومس هوائيا في 37 درجة مئوية ح 8 حتى تصل إلى مرحلة النمو سجل منتصف السلالات وقياس التطوير التنظيمي النهائي في 540 نانومتر. طرح OD النهائي من OD الأولية معرفة ما إذا كان التطوير التنظيمي إينوكولومس في مرحلة النمو سجل منتصف (ح 8، استناداً إلى منحنيات النمو في الشكل 1).
  5. للوصول إلى العدوى مع خلايا7 10 مل-1، الطرد المركزي العدوى لمدة 5 دقائق في 5,500 س زوتجاهل المادة طافية والتركيز العدوى إلى نصف حجم الأنابيب.

3-بيوفيلم تشكيل والمعالجة الضوئية

  1. إضافة 1 مل من العدوى إلى الآبار للوحة البوليستيرين 24-جيدا. احتضان هوائيا في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة للسماح لالتصاق الخلايا إلى الجزء السفلي من الآبار.
  2. استخدم علامة حمراء غير متماسك الضوء (انظر الجدول للمواد) كمصدر الضوء بطول موجي 635 ± 10 نيوتن متر وقوة إخراج ثابتة ميغاواط 1,460 سم2.
  3. استخدم مقياس طاقة لقياس كثافة الطاقة من الضوء. تعرض إشعاعاً المطبق 87.6 ي سم-2، أي ما يعادل حوالي 1 دقيقة للتعرض. استخدام صيغة كثافة الطاقة (J/سم2) = كثافة الطاقة (W/سم2) × الوقت التشعيع (s). تطبيق على مسافة 5 ملم بين مصدر الضوء وبيوفيلم لتجنب الاحترار العينة.
  4. علاج في مراقبة إيجابية الأغشية الحيوية مع الكلورهيكسيدين 0.12 في المائة لمدة 1 دقيقة والأغشية الحيوية مراقبة سلبية بنسبة 0.89 في المائة كلوريد الصوديوم لمدة 1 دقيقة.
  5. وبعد العلاج، غسل جميع الأغشية الحيوية مرتين مع محلول كلوريد الصوديوم 0.89 في المائة.
  6. أضف 1 مل من 1640 RPMI مخزنة مع 3-(N-morpholino) حمض بروبانيسولفونيك (والمماسح) عند درجة الحموضة 7 للأغشية الحيوية واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  7. في الصباح، وتطبيق العلاجات نفس الخطوات 3.2 إلى 3.6، غسل الأغشية الحيوية مرتين مع 0.89% كلوريد الصوديوم، إضافة جديدة ربمي مخزنة مع والمماسح (1 مل، الأس الهيدروجيني 7) إلى الآبار واحتضان هوائيا في 37 درجة مئوية.
  8. وفي اليوم نفسه، بعد ح 6، فضح الأغشية الحيوية للضوء الأحمر. علاج في مراقبة إيجابية الأغشية الحيوية مع الكلورهيكسيدين 0.12 في المائة لمدة 1 دقيقة والأغشية الحيوية مراقبة سلبية بنسبة 0.89 في المائة كلوريد الصوديوم لمدة 1 دقيقة. وبعد العلاج، يغسل الأغشية الحيوية مرتين مع محلول كلوريد الصوديوم 0.89 في المائة.
  9. كرر الخطوات من 3.2 3.8 حتى تحقيق ح 48 بيوفيلم التنمية.
    ملاحظة: في الأساس، سيحدث معاملة واحدة في الصباح والآخر سوف يحدث في فترة ما بعد الظهر في نفس اليوم (عدا 6 ح).

4-تجهيز

  1. أضف 1 مل العقيمة 0.89% كلوريد الصوديوم إلى البئر لإزالة في بيوفيلم بخدش من شكل جيد باستخدام تلميح ماصة. إضافة بيوفيلم إزالة أنبوب عقيمة.
  2. أضف 1 مل آخر العقيمة 0.89% كلوريد الصوديوم إلى البئر. الصفر مرة أخرى وإضافة التعليق إلى الأنبوب نفسه لإجمالي حجم 2 مل.
  3. الوحدات المكونة للمستعمرة (زيمبابوي)
    1. قوة دوامة تعليق بيوفيلم لمدة 1 دقيقة. من تعليق بيوفيلم, استخدم قاسمة 0.1 مل لتمييع المسلسل.
    2. تمييع تعليق بيوفيلم من 10-1 إلى 10-4 في محلول كلوريد الصوديوم 0.89 في المائة.
    3. البذور 50 ميكروليتر من كل تخفيف إلى لوحات حزب العمل الديمقراطي واحتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 48.
    4. عد المستعمرات وتطبيق الصيغة زيمبابوي/مل = عدد من المستعمرات x 10ن /q (n = تمييع؛ س = حجم المصنف).
  4. الوزن الجاف
    1. أنابيب ميكروسينتريفوجي وزنها والتسمية.
    2. من تعليق بيوفيلم, استخدام 0.1 مل لتحديد الوزن الجاف (الكتلة الحيوية).
    3. إضافة 1 مل إيثانول المطلقة قاسمة 0.1 مل من الأغشية الحيوية وتخزينها في-20 درجة مئوية ح 18. بعد ح 18، الطرد المركزي في س 10,000 ز لمدة 10 دقائق.
    4. تجاهل المادة طافية، ووضع الأنابيب في مجفف لتجف العينات لمدة أسبوع واحد وتزن أنابيب ميكروسينتريفوجي مرة أخرى.
  5. السكريات للذوبان في الماء (وسبس) والسكريات والقلويات القابلة للذوبان (ASPs)
    1. من تعليق بيوفيلم, قوة دوامة ما تبقى الحجم (1.8 مل) 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 5,500 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تخزين المادة طافية في أنبوب جديد ويغسل ترسبات مرتين مع الخلايا، والتي تحتوي على المكونات غير قابلة للذوبان من المصفوفة خارج الخلية مع الماء المعقم عالي النقاوة (5,500 × ز، 10 دقيقة في 4 درجات مئوية).
    2. إعادة تعليق المحتوى غير قابلة للذوبان في 1.8 مل الماء المعقم عالي النقاوة.
    3. السكريات للذوبان في الماء (وسبس)
      ملاحظة: إجراء هذه التجربة في غطاء دخان.
      1. من المادة طافية المخزنة، حجز 1 مل للتحديد الكمي للسكريات للذوبان في الماء (وسبس).
      2. مجانسة المادة طافية المخزنة لمدة 1 دقيقة. ثم نقل إلى أنابيب معقمة وإضافة مجلدات 2.5 من الإيثانول 95%. تخزين أنابيب لح 18 في-20 درجة مئوية لهطول الأمطار وسبس.
      3. بعد ح 18، الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 9,500 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، تجاهل في سوبيرناتانتس.
      4. تغسل العينات ثلاث مرات مع الإيثانول 75% وأيردري الكريات. تعليق إعادة بيليه مع 1 مل الماء المعقم عالي النقاوة، وتحديد مقدار WSP استخدام الأسلوب حمض الكبريتيك الفينول.
      5. استخدام 0.1% جلوكوز (0.01 غرام السكر إلى 10 مل الماء عالي النقاوة) للمنحنى القياسي (0 و 2.5، 5، 10، 15، 20 و 25 ميكروليتر من الجلوكوز في الأنبوب).
      6. إضافة 200 ميليلتر من الفينول 5% (2.7 مل فينول 90% إلى 47.3 مل من الماء عالي النقاوة) إلى أنبوب زجاج تضم 200 ميكروليتر من العينة أو المنحنى المعياري نقطة (في ثلاث نسخ كل عينة) وتخلط بحذر.
      7. أضف 1 مل حامض الكبريتيك إلى الأنبوب ومزيج. الانتظار 20 دقيقة لرد الفعل وقياس العينات باستخدام جهاز المطياف الضوئي (490 نيوتن متر).
    4. السكريات والقلويات القابلة للذوبان (ASPs)
      ملاحظة: إجراء هذه التجربة في غطاء دخان.
      1. من مبلغ إعادة تعليق غير قابلة للذوبان، فصل 1 مل لتحديد ASPs. الطرد المركزي في مختبرين لكل تعليق بيوفيلم (13,000 س ز، لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية).
      2. حذر إزالة المادة طافية من كل أنبوبة. ثم وضع العينات في مركز فراغ إلى الجاف الكريات.
      3. وزن الكريات وإضافة 300 ميليلتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم (2 غ من هيدروكسيد الصوديوم في 50 مل الماء عالي النقاوة) كل 1 ملغ الوزن الجاف. احتضان لهم ح 2 في 37 درجة مئوية وثم الطرد المركزي في × 13,000 ز لمدة 10 دقائق.
      4. حذر جمع supernatants ماصة ونقل إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي، الحفاظ على بيليه.
      5. مرة أخرى، إضافة وحدة تخزين متساوية من هيدروكسيد الصوديوم ن 1 إلى أنابيب تتألف الكريات، وكرر نفس الخطوات أعلاه لاستخراج ASP.
      6. بعد حضانة ح 2، الطرد المركزي العينات (13,000 س ز لمدة 10 دقائق)، بعناية وجمع في سوبيرناتانتس وإضافة إلى سوبيرناتانتس التي تم جمعها سابقا.
      7. لاستخراج الثالثة، كرر نفس الخطوات كما أعلاه، لكن هذه المرة، لا احتضان العينات ح 2 قبل الطرد المركزي.
      8. وبعد ذلك إضافة ثلاثة مجلدات من الإيثانول 95% لكل عينة. ثم، الأسهم العينات من −20 درجة مئوية ح 18 لهطول الأمطار لآسيا والمحيط الهادئ.
      9. الطرد المركزي هذه الأنابيب (9,500 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية) وتجاهل في سوبيرناتانتس.
      10. تغسل كل بيليه ثلاث مرات مع الإيثانول 75% وأيردري (فعلت نفس الإجراءات ل WSP). إعادة تعليق الكريات في تساوي إجمالي حجم الاستخراج الأولى مع هيدروكسيد الصوديوم ن 1.
      11. قراءة في النماذج للتحديد الكمي لآسيا والمحيط الهادئ باستخدام الفينول الكبريتيك (نفس أما بالنسبة لتحليل WSP).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 2 يعرض نتائج سجل10 مليلتر زيمبابوي من المبيضة بعد العلاج المصروف مع الضوء الأحمر للضوء الأحمر 1 كحد أدنى إلى حد كبير سجل10 زيمبابوي/مل مقارنة NC (p = 0.004). ويبين الشكل 3 النتائج من الكتلة الأحيائية (ملغ) للأغشية الحيوية المبيضة بعد العلاجات اليومية. جميع المجموعات أظهرت الحد من الكتلة الأحيائية نورث كارولاينا بالمقارنة مع المعالجة (p = 0.000) والضوء الأحمر معاملة مجموعات عرض تخفيض مماثل من الكتلة الأحيائية لمراعاتها في جهاز الكمبيوتر. رقم 4 و رقم 5 عرض كميات أدنى من المبيضة EPS القابلة للذوبان وتستعصي على الحل EPS في الكمبيوتر بالمقارنة مع نورث كارولاينا (p = 0.000). حتى ولو لم إحصائيا التطبيق كبيرة، المصروف الضوء الأحمر لمدة 1 دقيقة للأغشية الحيوية المبيضة عددياً تناقص المبالغ القابلة للذوبان EPS وتستعصي على الحل EPS.

Figure 1
الشكل 1 . منحنى النمو المبيضة سلالة SN 425- وقدم الثقافة العوالق في المتوسط YNB تكملة مع 100 مم جلوكوز والمحتضنة في 37 درجة مئوية. الكثافة البصرية (OD في 540 نانومتر) وحددت Log10 زيمبابوي/مل مع مرور الوقت. يظهر الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . الانحرافات القياسية ويعني سجل10 زيمبابوي/مل من المبيضة. أجريت تقييمات بين العلاج بالضوء الأحمر مرتين في يوم و controls-0.12% التايوانية (PC) و 0.89% "كلوريد الصوديوم" (NC). الأحرف متساوية تمثل الإحصائية التشابه بين المجموعات (p > 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . الانحرافات يعني والقياسية للوزن الجاف (ملغ) من المبيضة. أجريت تقييمات بين العلاج بالضوء الأحمر مرتين في يوم و controls-0.12% التايوانية (PC) و 0.89% "كلوريد الصوديوم" (NC). الأحرف متساوية تمثل الإحصائية التشابه بين المجموعات (p > 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . المبلغ انحرافات قياسية ويعني EPS قابلة للذوبان في المبيضة بيوفيلم (ميكروغرام/ملغ وزن الجاف). أجريت مقارنات بين العلاج بالضوء الأحمر مرتين في يوم و controls-0.12% التايوانية (PC) و 0.89% "كلوريد الصوديوم" (NC). الأحرف متساوية تمثل الإحصائية التشابه بين المجموعات (ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . انحرافات قياسية ويعني تستعصي على الحل EPS المحتوى في المبيضة بيوفيلم (ميكروغرام/ملغ وزن الجاف). أجريت تقييمات بين العلاج بالضوء الأحمر مرتين في يوم و controls-0.12% التايوانية (PC) و 0.89% "كلوريد الصوديوم" (NC). الأحرف متساوية تمثل الإحصائية التشابه بين المجموعات (ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية لاستزراع ناجحة من بيوفيلم المبيضة : 1) للقيام بالعدوى قبل والعدوى في المتوسط YNB تكملة مع الجلوكوز 100 مم؛ 2) الانتظار 90 دقيقة لمرحلة الالتصاق وتغسل بعناية مرتين الآبار بنسبة 0.89 في المائة كلوريد الصوديوم لإزالة الخلايا غير التقيد بها؛ و 3) لإضافة المتوسطة ربمي في الخلايا التقيد بها لبدء تشكيل بيوفيلم، منذ ربمي سوف تحفز نمو خيوط فطرية. يمكن أن يحدث أنيوبلويديس عند استزراع المبيضة. وبالتالي، من المهم عدم استخدام المستعمرات القديمة، لا لتخزين لوحات عند 4 درجة مئوية، وليس لإعادة خط الخلايا من ألواح القائمة أكثر من سبعة أيام. وبالمثل، ينبغي استخدام سلالات قبل 18 ساعة بين عشية وضحاها النمو13.

حد دراسة أن أنجز في المختبر. في حين أن الدراسات في المختبر أن زيادة كبيرة في فهم بيولوجيا بيوفيلم، فهي لا تمثل دقة ظروف المجراة في14. ومع ذلك، توفر الاختبارات في المختبر الفرز الفائق بالإضافة إلى كونها منهجية بسيطة ورخيصة14 الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالعلاجات أنتيبيوفيلم الجديدة. اختيار الوسائط الثقافة الصحيحة لكل مرحلة من مراحل التنمية بيوفيلم خطوة هامة لنجاح هذه الطريقة. RPMI 1640 هو متوسط الغنية بالمغذيات التي الأحماض الأمينية ويحاكي تركيبة السوائل البشرية15. ويتضمن RPMI 1640 لام الجلوتامين، ارجينين، أسباراجين L بالإضافة إلى الفيتامينات والأملاح غير العضوية. ومع ذلك، قد الإعلام YNB كمية مرتفعة من الجلوكوز (18 جرام/لتر) مقارنة بالمتوسط RPMI 1640 (الجلوكوز 2 غرام/لتر). لقد وصف محتوى الجلوكوز عالية لزيادة نمو المبيضات الأنواع16العوالق. وفي المقابل، سيساعد وجود تركيزات أعلى من الأحماض الأمينية بيوفيلم النمو في المتوسط ربمي مقارنة ب المتوسط YNB16. وأظهرت البيانات النوعية تطبيق ميكروجرافس وزارة شؤون المرأة أن يعرض التصميم الهيكلي للأغشية الحيوية المبيضة في ربمي منظمة معقدة مع نمو قوي للخمائر مع متشعبة خيوط فطرية وعناصر مهدها وندوب برعم مع وفيرة 16من المصفوفة خارج الخلية. هذه النتائج، وفقا لدراسة سابقة أفادت أن RPMI 1640 زيادة تشكيل أصله في الأغشية الحيوية المبيضة 15. هذه النتائج تظهر الاختلافات في الركازة استخدام المبيضات طوال مراحل النمو بيوفيلم مختلفة وإظهار أهمية تغيير الوسائط أثناء تشكيل النمو وبيوفيلم العوالق.

اختيار درجة الحرارة الصحيحة ودرجة الحموضة زراعة الأغشية الحيوية المبيضة مهم أيضا لإنجاز الأسلوب مع تكوين خيوط فطرية كافية. وتتعهد المبيضة التحويل من بلاستوسبوريس إلى خيوط في رد فعل على الظروف التي تحاكي الوسط من أنسجة الثدييات المضيفة17. هذه الشروط تنطوي على زيادة في درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية) وفي الأس الهيدروجيني المحايدة17، وهذا هو السبب لماذا يتم ضبط الأس الهيدروجيني للوسط ربمي إلى 7.

الأساليب المطبقة في هذه الدراسة كبيرة حيث كانت تتسم الأغشية الحيوية للتعطيل المبيضة 425 قبل12، تبين أن كميات كبيرة من EPS قابلة للذوبان-وغير قابلة للذوبان، مما يجعله وسيلة موثوق بها لتحليل نتائج الأضواء على السكريات خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، نفس الجهاز الخفيفة غير متماسك المطبقة في التجارب التي تم تطبيقها بنجاح على المعلقات العوالق البكتيرية18 والأغشية الحيوية9، والاستفادة القصوى من هذا الجهاز هو الحد في وقت المعاملة، ما يجعل الجهاز أكثر جدوى للتطبيقات السريرية18. تحليل المعالجة الضوئية اليومية المطبقة على الأغشية الحيوية المبيضة مهم نظراً ليحاكي المنهجية المطبقة في هذه الدراسة لعلاج سريع، ويمكن أن يتم بسهولة من قبل المريض في المنزل.

مجد تخفيض العلاج اليومي الضوء الأحمر المبيضة مستعمرة صالحة العد وبيوفيلم بيوماسيس. المزيد من الدراسات قد حاول مزيج من العلاجات، بدءاً بالمعالجة الضوئية وبعد تطبيق مضاد موضعي. قد تساعد هذه الاستراتيجية في المصفوفة خارج الخلية التدريع بيوفيلم المبيضة ، السماح بتسلل المخدرات أفضل عن طريق بيوفيلم للوصول إلى وأخيراً القضاء على الخلايا المبيضة ديسورجانيزينج. ونظرا لمحدودية هذه التجربة في المختبر، قد يساعد استخدام الضوء الأحمر لمدة 1 دقيقة adjuvant إلى انتيفونغلس الموضوع في علاج داء المبيضات الفموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر الدكتور بولا دا سيلفيرا، كوستا الدكتور سيسيليا اتيم غونسالفس دي أروجو، ماولي شون م.، ماولي م. شين، جانال مالفين أ. د. والدكتور إيريانا زانن لتطوير هذه الدراسة. ونعترف أيضا الدكتور ألكسندر دال جونسون (UCSF) للتبرع إلى الضغط التي تم تحليلها في هذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clorhexidine 20%  Sigma-Aldrich C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous Fisher Chemical D16-500
Ethanol 200 proof Decon Laboratories DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A  LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA 
NaCl  Fisher Chemical S641-500
NaOH  Fisher Bioreagents  BP 359-500
Phenol 5% Milipore Sigma 843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) Sigma R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol Acumedia 7306A
Sulfuric acid  Fisher Chemical SA200-1
Yeast nitrogen base  Difco DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS Sigma-Aldrich M1254
 24-well polystyrene plate  Falcon 353935

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
  2. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
  3. Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
  4. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
  5. Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
  6. Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
  7. Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
  8. Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
  9. de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
  10. Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
  11. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  12. Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
  13. Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
  14. Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
  15. Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
  16. Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
  17. Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
  18. Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 146، بيوفيلم، المبيضات البيض، العلاج بالضوء، والضوء الأحمر، والمصفوفة خارج الخلية، بوليساتشاريديس
المعالجة الضوئية اليومية مع الضوء الأحمر لتنظيم "النمو بيوفيلم" <em>المبيضات البيض</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Panariello, B. H. D., Garcia, B. A., More

Panariello, B. H. D., Garcia, B. A., Duarte, S. Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth. J. Vis. Exp. (146), e59326, doi:10.3791/59326 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter