Summary
ここでは、カンジダバイオ フィルムの発育に赤色光アプリケーションの結果を評価するためのプロトコルを提案する.635 nm の波長とエネルギー密度が 87.6 J·cm-2非コヒーレント赤光デバイスは、48 h のカンジダバイオ フィルムの成長を通して適用されました。
Abstract
ここでは、カンジダバイオ フィルムの発育に日当赤光治療の成果を評価するためのプロトコルを提案する.C. アルビカンスSN425 の浮遊性の成長を高めるため、乳酸菌は酵母窒素ベースのメディアに成長しました。バイオ フィルム形成アミノ酸の高濃度を持っている, RPMI 1640 メディアはバイオ フィルムの成長を助けるに適用されました。48 h のバイオ フィルムは、非コヒーレント光デバイスと 1 分の期間の 1 日 2 回を扱われた (赤色光; 波長 = 635 nm; エネルギー密度 = 87.6 J·cm-2)。肯定的な制御 (PC)、0.12% クロルヘキシジン (CHX) が適用されると否定的な制御 (NC)、0.89% 塩化ナトリウムがバイオ フィルムに適用されました。コロニー形成単位 (CFU) 治療後ドライ重量、水溶性と不溶性の細胞外多糖類の定量を行った。簡単に言えば、ここで提示されたプロトコルは、簡単に再現できると赤光治療.後の乾物重と細胞外多糖類量、生存率についての回答を提供します
Introduction
糖尿病、免疫抑制療法のアプリケーション、HIV 感染、エイズの流行、侵襲の臨床的および過去数年間の広域スペクトルの抗生物質消費の発生率の増加は、カンジダの発生率を増加しています。関連疾患1,2。C. albicans感染症一般的バイオ フィルム開発に関連しているし、カンジダ症やカンジダ性敗血症1,2などの全身症状などの臨床症状を引き起こす可能性があります。バイオ フィルムの成長の最も注目すべき病原因子の 1 つは細胞外多糖類マトリックス設立です。既存の抗真菌薬、環境ストレス、ホスト免疫機構3への抵抗を高めるためにバイオ フィルム形成が協力しています。
C. albicansのバイオ フィルムの成長は、基板、基板表面と菌糸の生育酵母の伝播によって後に浮遊性細胞の初期付着によって始まります。バイオ フィルムの成長の最後の段階は、成熟段階、前記酵母のような開発を抑制、菌糸の開発拡大、および細胞外マトリックスを囲むバイオ4です。C. アルビカンスポリサッカライド (EPS) マトリックスの相互マンナン グルカン複合5,6を形成します。細胞外多糖類の相互作用は薬7に対してバイオ フィルムの防衛のために重要です。したがって、 C. albicansの細胞外マトリックスから EPS の削減は口腔カンジダ症コントロールの新しい antibiofilm プロトコルの開発をサポート可能性があります。
光は、成長、開発、およびいくつかの生物8の動作を調節して光線力学的抗菌化学療法 (協定) において、抗菌薬として適用されています。協定は、可視光線の特定の波長と光吸収の光増感剤9を適用されます。ただし、感光でも苦労して、バイオ フィルムを貫通低い有効性10の原因します。完全にバイオ フィルムを浸透させる治療薬の失敗では、バイオ フィルムが時折伝統的な抗菌療法3,5を抵抗です。囲まれた微生物細胞を非アクティブ化、抗菌薬は細胞外のマトリックスを透過する必要があります。それにもかかわらず、EPS、バイオ フィルムにキャリッジのレベルのプロンプトまたは11マトリックス自体に抗菌の応答に影響を与えるそのような分子の拡散障害の特徴です。
協定の欠点を考える自体による光の使用は、貴重な改善として現れます。予備的なデータでは、青色光と 1 日 2 回の治療が EPS 不溶性のミュータンス連鎖球菌バイオ フィルムの生産と有意に抑制したことを明らかにしました。EPS 不溶性の減少、青い光は、バイオ フィルムの成長を減少しました。それにもかかわらず、 C. albicansのバイオ フィルムの赤い光を使った光線療法の結果が不足しています。したがって、この調査の目的は、成長とC. albicansのバイオ フィルムの配置に影響を及ぼす赤色光を使用してどのような方法の光線療法の評価でした。1 日 2 回治療のため我々 が研究室の前のプロトコル9,12生存率についての答えを提供する簡単で再現性のあるバイオ フィルム モデルを提供する適応乾物重および細胞外多糖類赤光治療.後の金額他の治療法をテストするため、同じプロトコルを使用できます。
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Protocol
1. 培地の調製
- サブロー ・ ブドウ糖寒天培地 (SDA) を準備します。1,000 mL の蒸留水にクロラムフェニ コール (50 mg/L) を添加した SDA の 65 g を中断します。沸騰媒体を完全に溶解します。30 分 45-50 ° C に冷却 15 PSI (121 ° C) でオートクレーブに入れることによって殺菌しなさいよく混ぜ、滅菌のペトリ プレートに SDA の 20 mL を注ぐ (サイズ: 100 x 15 mm)。
- 6.7 g YNB と 18 g を 1,000 mL の超純水のブドウ糖を混合することによって 100 mM グルコース添加酵母窒素ベース (YNB) メディアを準備します。スターラーを使用してミックス、0.22 μ m の真空フィルター システムを使用して培地を滅菌します。
- 10.4 g RPMI 1640 と 34.32 g 3-(N morpholino) を混合することによって RPMI を準備 propanesulfonic 酸 (モップ) 1,000 mL 純水にします。熱なし攪拌機で混合し、1 N NaOH (水酸化ナトリウムの 50 mL の純水に追加 2 g) を追加することによって 7 の pH を調整します。0.22 μ m の真空フィルター システムを使用してメディアを滅菌します。
2. 事前接種と接種
- C. albicans SN425 微生物を −80 ° C 冷凍庫から外し、常温に解凍しましょう。SDA クロラムフェニ コール (50 mg/L) を添加した培養シャーレにストックの文化 10 μ L をシードします。48 h の 37 ° C 好気的でシャーレを孵化させなさい。
- 培養 48 時間後 10 mL 酵母窒素培地 (YNB) 基本 100 mM グルコースを添加したし、, 事前接種の 16 h の 37 ° C で好気的にC. albicansの 10 の植民地を追加します。
- H, 16、1:10 で 100 mM グルコースと新鮮な YNB 培にスターター文化を希釈することによって、乳酸菌の準備のためのインキュベート後 (YNB 9 mL で希釈したスターター文化の 1 mL) の割合します。測定初期の光学濃度 (OD) 540 nm。
- 系統中間ログ成長フェーズに到達し、540 で最終的な外径を測定まで 8 時間 37 ° C で好気性の乳酸菌を孵化させなさい nm。中間ログ成長期 (8 h)図 1に成長曲線に基づくのか、乳酸菌の OD を確認する初期の OD から最終的な OD を減算します。
- 107セル mL-1接種まで、接種 5,500 × gで 5 分間遠心、上澄みを廃棄し、チューブの体積の半分に接種を集中します。
3. バイオ フィルム形成と光線療法
- 24 ウェル ポリスチレン板の井戸に接種の 1 mL を追加します。井戸の底に接着できるように 90 分の 37 ° C 好気的で孵化させなさい。
- 非コヒーレント赤使用ライト 635 ± 10 nm の波長と固定出力 1,460 mW cm− 2光源として (材料表を見なさい)。
- パワー メーターを使用すると、光のパワー密度を測定できます。適用される放射の露出は 87.6 J cm です-2露出の約 1 分に相当。エネルギー密度 (J/cm2) の式を使用して出力密度 (W/cm2) x 照射時間 (s) =。5 mm 光源と試料を地球温暖化を避けるためにバイオ フィルムとの間の距離を適用します。
- 1 分の 0.12% クロルヘキシジンと肯定的な制御バイオ フィルムと 0.89% と陰性対照バイオ フィルムを扱う 1分間塩化ナトリウム。
- 治療後、0.89 %nacl 水溶液で 2 回すべてのバイオ フィルムを洗ってください。
- RPMI 1640 3-(N morpholino) バッファーの 1 つの mL を追加、バイオ フィルムに pH 7 での propanesulfonic 酸 (モップ) し、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
- 朝は、同じ治療法を適用する手順 3.6 に 3.2 洗って二度 0.89% とバイオ フィルムとして NaCl、モップ (1 mL、pH 7) の井戸にバッファーされ新しい RPMI を追加し、37 ° C 好気的インキュベート
- 同じ日に、6 時間後に赤い光にバイオ フィルムを公開します。1 分の 0.12% クロルヘキシジンと肯定的な制御バイオ フィルムと 0.89% と陰性対照バイオ フィルムを扱う 1分間塩化ナトリウム。治療後 0.89 %nacl 水溶液で二回バイオ フィルムを洗浄します。
- バイオ フィルム開発の 48 h を達成するまで 3.2 3.8 の手順を繰り返します。
注: 基本的には、1 つの治療は、朝起きるし、(6 h 離れて) 同日午後に他の 1 つが起こる。
4. 処理
- 滅菌の 0.89 %1 mL を加えても塩化ナトリウムもピペット チップを使用して、掻くことによって、バイオ フィルムを除去。生殖不能の管に削除されたバイオ フィルムを追加します。
- 滅菌 0.89% の別の 1 mL を加えても塩化ナトリウム。再びそれをスクラッチし、懸濁液を 2 mL の容量の同じ管に追加します。
- コロニー形成単位 (CFU)
- 積極的に渦 1 分のバイオ フィルムのサスペンション。バイオ フィルムの中断からシリアル希釈に 0.1 mL を使用します。
- 0.89 %nacl 溶液 10-4 10-1からバイオ フィルム懸濁液を希釈します。
- SDA プレート各希釈の 50 μ L をシードし、48 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。
- コロニーをカウントし、数式 CFU/ml = 植民地 x 10nの数/q (n = 希釈; q = シード ボリューム)。
- 乾燥重量
- 重さし、マイクロ遠心チューブ用のラベルします。
- バイオ フィルムの中断から乾燥重量 (バイオマス) を決定するため 0.1 mL を使用します。
- バイオ フィルムの 0.1 mL の無水エタノール 1 mL を追加し、18 時間-20 ° C で保存します。18 h 後 10,000 x gで 10 分間遠心分離機します。
- 上澄みを廃棄、1 週間サンプルを乾燥させるとマイクロ遠心チューブ用の再度重量を量るデシケータにチューブを配置します。
-
水溶性多糖類 (Wsp) およびアルカリ可溶性多糖類 (Asp)
- バイオ フィルムの懸濁液、精力的に渦 1 分および 4 ° C で 10 分間 5,500 × gで遠心のボリューム (1.8 mL) の残りの部分から新しいチューブに上清を保存および沈殿物の滅菌超純水 (5,500 × g、4 ° C で 10 分間) と細胞外マトリックスの不溶性の成分を含む細胞で二回洗います。
- 再滅菌超純水水 1.8 mL で不溶性のコンテンツを中断します。
- 水溶性多糖類 (Wsp)
注: は、ヒューム フードにこの実験を実行します。- ストアドの上澄みから水溶性多糖類 (Wsp) の定量化のための 1 mL を留保します。
- 1 分のストアドの上澄みをホモジナイズしてください。生殖不能の管に転送し、95% のエタノールの 2.5 倍の量を追加します。Wsp の沈殿物のための-20 ° C で 18 h のチューブを格納します。
- 18 h 後 9,500 x g 4 ° C で 20 分間でチューブを遠心分離します。遠心分離後、上清を破棄します。
- 75% エタノールで 3 回サンプルを洗浄し、ペレットを風乾します。再滅菌超純水水 1 mL にペレットを中断して、フェノール硫酸法を使用して WSP を定量化します。
- 標準曲線の 0.1% ブドウ糖 (純水 10 mL にブドウ糖の 0.01 g) を使用 (0、2.5、5、10、15、20、および 25 μ L チューブあたりブドウ糖の)。
- 200 μ L のサンプルを構成するガラス管に 5% フェノール (47.3 mL 純水に 90% フェノールの 2.7 mL) 200 μ L を追加または標準曲線 (サンプルあたり 3 通) でポイントし、慎重に混ぜます。
- 管に硫酸 1 mL を加え、混ぜます。反作用のための 20 分を待ってから、分光光度計を使用して試料を測定 (490 nm)。
- アルカリ可溶性多糖類 (Asp)
注: は、ヒューム フードでこの実験を実行します。- 不溶性の再懸濁量から Asp の決定のための 1 mL を区切ります。各バイオ フィルムの懸濁液 (13,000 x g、4 ° C で 10 分間) の因数を遠心します。
- 各チューブの上清を慎重に削除します。その後、ペレットを乾燥させる真空濃縮にサンプルを配置します。
- ペレットの重さし、乾燥重量の 1 mg 当たり 1 N NaOH (水酸化ナトリウムの超純水水 50 mL に 2 g) の 300 μ L を追加します。37 ° C で 2 時間インキュベートして 13,000 × g 10 分間遠心分離します。
- 慎重に遠心チューブ、ペレットを維持するピペットと転送培養上清を収集します。
- もう一度、ペレットを構成する管に 1 N NaOH の等しいボリュームを追加し、ASP の抽出のため上記のように同じ手順を繰り返します。
- 2 時間後、遠心分離機のサンプル (13,000 x gで 10 分間)、慎重に培養上清を収集し、以前に収集した培養上清を加えます。
- 3 番目の抽出が、今回は、上記と同じ手順を繰り返して、遠心分離前に 2 h のサンプルをインキュベートしません。
- その後、各サンプルに 95% のエタノールの 3 つのボリュームを追加します。ASP の沈殿物のための 18 h の − 20 ° C にあるサンプルをストックします。
- チューブ (9,500 × gで 4 ° C で 20 分) を遠心し、上清を捨てます。
- 3 回で 75% エタノール ペレットを洗浄し、空気乾燥 (WSP の同じ手順でした)。再 1 N NaOH で最初の抽出の総量が等しいペレットを中断します。
- フェノール-硫酸を使用して ASP の定量化のためのサンプルを読む (WSP 分析方法と同様)。
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Representative Results
図 2は、1 分赤色光大幅削減ログ10 CFU/mL NC と比較しての赤い光で日当治療後ログ10 CFU/mLの c.albicansの結果を表示 (p = 0.004)。図 3は、毎日治療後c.albicansバイオの現存量 (mg) の成果を提示します。すべて治療グループ NC に比べてバイオマスの減少を示した (p = 0.000) 赤色光治療 PC で観察するバイオマスの同様なリスク減少を発表したグループ。図 4と図 5 NC と比較して PC に劣る量のc.albicans EPS 水溶性と不溶性 EPS を表示 (p = 0.000)。にもかかわらず統計的にC. albicansバイオ フィルムに 1 分用の赤灯の重要な日当アプリケーションは数値 EPS 水溶性と不溶性 EPS の量を減少しました。
図 1.成長曲線の c. アルビカンス SN 425 をひずみ。浮遊性文化は YNB 中グルコースの 100 mM で補われ、37 ° C で培養しました。光学濃度 (OD で 540 nm) と時間上 Log10 CFU/mL と判断されました。標準偏差が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ログ10の平均値と標準偏差 CFU/mLのc.albicans.評価は赤い光で治療の間行われた一日二回と controls-0.12% CHX (PC) 0.89 %nacl (NC)。同じ文字を表すグループ (p > 0.05) 統計的な類似性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ドライ重量 (mg) の平均と標準偏差 C. albicans.評価は赤い光で治療の間行われた一日二回と controls-0.12% CHX (PC) 0.89 %nacl (NC)。同じ文字を表すグループ (p > 0.05) 統計的な類似性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.EPS 可溶性の平均と標準偏差量 C. albicans バイオ フィルム (乾物重の μ g/mg).1 日 2 回、controls-0.12% CHX (PC) と 0.89% 比較を赤い光で治療の間行った NaCl (NC)。同じ文字を表すグループ (p < 0.001) 統計的な類似性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.EPS 不溶性の平均と標準偏差でコンテンツ C. albicans バイオ フィルム (乾物重の μ g/mg).評価は赤い光で治療の間行われた一日二回と controls-0.12% CHX (PC) 0.89 %nacl (NC)。同じ文字を表すグループ (p < 0.001) 統計的な類似性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
C. アルビカンスバイオ フィルムの培養に成功の最も重要な手順は、: 1) 事前接種と 100 mM グルコース; 混じって YNB 培地で接種を行う2) 90 分を待って接着相と二度 0.89% と井戸を慎重に洗うに塩化ナトリウム非付着細胞を削除するには・ 3) RPMI は菌糸の成長を刺激するためにバイオ フィルム形成を開始する付着細胞に RPMI 培地を追加します。C. アルビカンスを培養染色体異常が起こります。その結果、7 日以上経過、4 ° C でしていない既存の版から再縞セル板を格納しないことは、植民地を使用することが重要です。同様に、系統を一晩成長13の 18 時間前まで使用する必要があります。
研究の制約は、それが生体外で行われたことです。In vitro 試験では、バイオ フィルムの生物学の理解を増加している大きくしながら体内の条件14を正確に反映しません。ただし、生体外でテストは、antibiofilm の新しい治療法に関する質問にお答えする安価で簡単な方法14であることに加えて高スループットス クリーニングを提供します。バイオ フィルムの開発の各段階の正しい文化メディアの選択は、メソッドの成功のための重要なステップです。RPMI 1640、アミノ酸を持ち、人体の液体15の構成をシミュレートする栄養豊富な媒体です。RPMI 1640 には、L-グルタミン、L-アルギニン、L-アスパラギンに加えてビタミンや無機塩類が含まれています。それにもかかわらず、YNB メディアはグルコース (18 g/L) RPMI 1640 媒体 (ブドウ糖 2 g/L) と比較して高額です。高グルコース含量は、カンジダ種16の浮遊性の成長を高めるため記載されています。対照的に、アミノ酸の高濃度の存在は YNB 中16に比べて RPMI 培地でのバイオ フィルムの成長を助けます。SEM 観察結果を適用する定性的なデータを示した RPMI でc. アルビカンスバイオ フィルムの構造の設計が菌糸、新進要素および豊富な芽傷をダミエッタに酵母の堅実な成長と複雑な組織をプレゼント細胞外マトリックス16。このような成果は、 C. albicansバイオ フィルム15で菌糸の形成を RPMI 1640 に拡張報告以前の研究。これらの結果は、異なるバイオ フィルムの成長段階でカンジダによって基板使用率の違いを示すし、浮遊性の成長およびバイオ フィルム形成中にメディアを変更することの重要性を示します。
適切な温度とC. albicansのバイオ フィルムを育成する pH の選択も菌糸の適切な形成と法を達成するために重要です。C. albicansは blastospores から哺乳類宿主組織17の環境を模倣する条件に反応してフィラメントへの変換を行っています。これらの条件を含む中性17、ますます体温 (37 ° C) で、これは RPMI 培地の pH を 7 に調整する理由理由。
C. albicans SN 425 のバイオ フィルムは12、EPS 水溶性と不溶性の偉大な量を持っていることを示すライトの結果を分析する信頼性の高い方法となる前に特徴付けられたので、本研究で適用されるメソッドが重要細胞外多糖類。さらに、実験に適用される同じ非コヒーレント光デバイス正常に細菌の浮遊懸濁液18とバイオ フィルム9に適用し、このデバイスの最高の利点は作るもの、治療時間の短縮、臨床応用18のより現実的なデバイスです。本研究で適用する方法論が高速ですし、患者を自宅で簡単に行うことができます治療をシミュレートするので、 c. アルビカンスバイオ フィルムに適用される毎日の光線の解析は重要です。
赤色光毎日の処置は意味深長c.albicans実行可能なコロニーのカウントとバイオ フィルムのバイオマスを減少します。多くの研究は、治療法、光線で始まる、外用抗真菌薬を適用後の組み合わせを試してみてください。この戦略は、シールドc.albicansバイオ、バイオ フィルムに到達し、最終的にc. アルビカンス細胞を根絶を通じてより良い薬剤浸透を許可する細胞外マトリックスを disorganizing に役立ちます。この in vitro 実験の限界を考慮して 1 分の赤い光の使用は、口腔カンジダ症の治療に関するトピックを抗真菌薬の補助療法として助けるかもしれない。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究開発の博士ポーラ ダ · シルベイラ、博士 Cecília Atem ゴンサルベス デ · アラウージョ コスタ、ショーン ・ m ・ マウレ、シェーン ・ m ・ マウレ、博士・ マルヴィン (名) Janal、博士アントニア Zanin をありがとうございます。我々 も本研究で分析したひずみを寄付するため博士アレクサンダー D. ジョンソン (UCSF) を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
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